Validacin de los mtodos microbiolgicos INTRODUCCION A LA VALIDACION DE METODOS MICROBIOLOGICOS

Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos Generales a desarrollar Validacin de mtodos:

Concepto de validacin. Definicin de parmetros a determinar para validar mtodos microbiolgicos cualitativos y cuantitativos.

Conceptos tericos sobre las caractersticas de los resultados de ensayo microbiolgicos.

Mtodos estadsticos: Clculos de parmetros a determinar para validar mtodos microbiolgicos cualitativos y cuantitativos. Protocolo de validacin.

Objetivos Generales a desarrollar Validacin de mtodos:

Intentaremos contestar las siguientes preguntas: Qu es validar un mtodo?

Por qu y para qu valido un mtodo?

Cundo valido un mtodo? Cmo valido un mtodo?

Objetivos de la clase
1. Presentar el concepto de validacin de mtodos microbiolgicos. 2. Definicin de parmetros a determinar para validar un mtodo microbiolgico: Especificidad Sensibilidad Lmite de deteccin Exactitud. Desviacin positiva y Desviacin negativa Lmite de cuantificacin Repetibilidad y reproducibilidad Robustez

Ejemplo: Un laboratorio dise una nueva metodologa para la deteccin de E coli O157:H7 basada en el uso de anticuerpos monoclonales para evaluar la inocuidad y calidad de alimentos crnicos. Qu caractersticas tendrn que tener los resultados que arroja dicho mtodo? Puedo emplearlo inmediatamente para emitir resultados que impliquen una decisin de conformidad o no con las especificaciones alimentarias vigentes?

La respuesta es: Antes de usar un mtodo debo asegurarme que haya sido validado
Necesito que el mtodo sea: Adecuado para el propsito. Los datos que arroja un ensayo le permiten al usuario tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas para un propsito preestablecido.

 Por qu es necesario validar un mtodo?

Respuesta: Para saber si ese ensayo sirve para lo que lo quiero usar. El laboratorio microbiolgico tiene la responsabilidad de garantizar que los resultados que l produce son exactos, validos y confiables de modo de proporcionar informacin til acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de los alimentos. Para conocer el comportamiento del mtodo.

 Por qu es necesario validar un mtodo?

Si el resultado de un ensayo no es confiable, el ensayo no presenta ninguna utilidad y sera mejor no realizarlo. Cuando un cliente recurre a un laboratorio microbiolgico a solicitar un anlisis, lo hace porque necesita resolver un problema y no puede hacerlo por s mismo y espera poder confiar en los resultados.

Buenos resultados del ensayo

Se identifican 6 principios de la prctica analtica, los cuales cuando se implementan simultneamente conducen a una buena prctica:

Principios de la prctica analtica: 1. Las mediciones analticas deben hacerse de forma tal que satisfagan un requerimiento acordado (un objetivo definido) 2. Deben realizarse utilizando mtodos y equipos que hayan sido probados para asegurar que son aptos para un determinado propsito. 3. El personal que realiza las mediciones debe ser competente y estar calificado.

Principios de la prctica analtica: 4. Debe haber una verificacin independiente (externa) y peridica de la competencia tcnica del laboratorio. 5. Las mediciones analticas realizadas en un laboratorio deben ser consistentes con las que se realizan en cualquier otro lugar. 6. Los laboratorios que realicen ensayos deben tener procedimientos bien definidos de control de calidad y de aseguramiento de la calidad.

En nuestro caso ejemplo:

La presencia de E.coli O157:H7 en un alimento puede ocasionar, para un determinado grupo poblacional, enfermedad y muerte. Tambin, cuando se desee comercializar, la partida de alimento ser rechazada en los sitios de control provocando un dao econmico y de prdida de imagen. PROBLEMAS DE INOCUIDAD Y CALIDAD.

En nuestro caso ejemplo: (cont) Por lo tanto, este mtodo propio desarrollado por el laboratorio debe ser capaz de: Detectar ese microorganismo. Detectar la presencia del microorganismo en muy pequeas cantidades. Dar los mismos resultados cuando lo repito. Detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro.

Definicin: VALIDACION*

Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin especfica.

*[ISO 9000: 2000]

Evidencias objetivas:
Cmo puedo aportarlas?
En el marco de un adecuado criterio microbiolgico, tengo dos herramientas fundamentales que permiten sacar conclusiones:

Diseo de experimentos estadsticamente vlidos. Anlisis de los resultados usando mtodos estadsticos.

Antes de realizar la validacin se deben especificar:

ALCANCE: Matriz Concentracin en la que se aplica.

Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA LOS FINES (teniendo en cuenta los requisitos particulares para un uso especfico previsto).

Validacin Mtodos de ensayo microbiolgicos CUALITATIVOS

1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado: LMITE DE DETECCIN

SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD

DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA EFECTO MATRICIAL

EXACTITUD RELATIVA

REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

Validacin Mtodos de ensayo microbiolgicos CUANTITATIVOS

1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo. Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado: LMITE DE CUANTIFICACIN.

EXACTITUD REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA

SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD

Definicin: LMITE DE DETECCIN.

Es el nmero mnimo de microorganismos que pueden ser detectado por el mtodo, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisin. (Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos)

LMITE DE DETECCIN:
Los resultados de los anlisis cualitativos deben expresarse como : detectado/no detectado en una cantidad o volumen definidos.
Determino el lmite de deteccin antes de evaluar la sensibilidad.

Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO MTODO MICROBIOLGICO

Matriz naturalmente o artificialmente contaminada

Mtodo a validar
+ + + + -

Mtodo de referencia
+ + + + + -

Target 1 Target 2 Target 3 Target 4 Target 5 NO Target 1 NO Target 2 NO Target 3 NO Target 4 NO Target 5

Definicin: MTODO DE REFERENCIA.

Mtodo investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o ms propiedades. Que ha demostrado tener una exactitud y una precisin apropiadas para el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros mtodos empleados para realizar la misma medicin y, en particular, para caracterizar un material de referencia. En general se trata de un mtodo normalizado nacional o internacional.

RESULTADO Resultado DEL ENSAYO asignado POSITIVO* A VALIDAR

Positivo Negativo +/+ (PV) -/+ (DN)

Resultado asignado NEGATIVO *

+/- (DP) -/- (NV)

Total

PV + DP DN + NV

Total

PV + DN

DP + NV

*por mtodo de referencia o por inoculacin de cepa de referencia.

Definicin: Desviacin negativa (DN). Ocurre cuando: el mtodo a validar da un resultado negativo sin confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado positivo. Esta desviacin se convierte en un resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo.

Definicin: DESVIACIN POSITIVA (DP).

Ocurre cuando: el mtodo a validar da un resultado positivo sin confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado negativo. Esta desviacin se convierte en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo.

FALSOS POSITIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un resultado positivo cuando la muestra no contiene el analito. F + = DPc/ DP + NV = 1- ESPECIFICIDAD

FALSOS NEGATIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un resultado negativo cuando la muestra contiene el analito. F - = DNc/ DN + PV = 1- SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias POSITIVOS que son correctamente asignados con el mtodo utilizado. [ISO 13843:2000]

Sensibilidad %= PV/(DN c + PV) x100

Capacidad del mtodo de dar positivo cuando las muestras tienen el analito Resultado del caso ejemplo: Sensibilidad %= 3/5x100= 60%

ESPECIFICIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias NEGATIVOS que son correctamente asignados con el mtodo utilizado. [ISO 13843:2000]

Especificidad %= NV/(DPc + NV) x100

Capacidad del mtodo de dar negativo cuando las muestras no tienen el analito Resultado del caso ejemplo: Especificidad %= 4/5x100= 80%

EXACTITUD RELATIVA: Grado de concordancia entre los resultados del mtodo evaluado y los obtenidos utilizando un mtodo de referencia reconocido
EXACTITUD RELATIVA %= PV + NV/(PV + NV + DN + DP) x100

Definicin: LMITE DE CUANTIFICACIN. Nmero mnimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del mtodo evaluado. Tengo en cuenta la incertidumbre del mtodo para valores bajos. (Aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos)

Robustez
DEFINICIN: INSENSIBILIDAD DE UN MTODO ANALTICO A PEQUEOS CAMBIOS EN EL PROCEDIMIENTO.

PARA EXAMINAR LA ROBUSTEZ ES ACONSEJABLE ABUSAR DEL MTODO EN UN CAMINO CONTROLADO.

Estimacin de la Incertidumbre de medicin en microbiologa

la incertidumbre de medicin es un parmetro asociado al resultado de la medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente asignados al mesurando. (mtodo cuantitativo)

En nuestro caso ejemplo: Ensayo de Deteccin de E.coli O157:H7 en un alimento Dijimos que: Necesito un mtodo capaz de detectar ese microorganismo.=Sensibilidad Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia del microorganismo en muy pequeas cantidades.= Lmite de deteccin Realizo muchas veces el mtodo y los resultados del ensayo se repitan = repetibilidad y reproducibilidad Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro = Especificidad