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VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

“Frederick Garfield(1) indica que un laboratorio de análisis debe tener como uno de sus propósitos
principales la producción de datos analíticos de alta calidad por medio del uso de mediciones analíticas
que sean precisas, confiables y adecuadas para tal fin.”

Según las “Normas de Buena Fabricación y de Control de Calidad de productos Farmacéuticos”, la

validación debe aplicarse no solo a los procesos de fabricación, sino también a los métodos de análisis
y control(2).

Considerando el laboratorio analítico como un eslabón de la cadena productiva, la validación es

necesaria por lo siguiente:

• Proporciona un alto grado de confianza y seguridad en el método analítico y en la calidad de

los resultados.
• Permite un conocimiento profundo de sus características de funcionamiento.

Al realizar la validación se tiene los siguientes resultados:

• Disminución del número de fallos y repeticiones con el consiguiente ahorro de los costes
asociados.
• Cumplimiento de los plazos previstos de análisis.
• Optimización del método, por ejemplo, mejorando la característica de practicabilidad y
posibilidades de automatización.

ORGANIZACIÓN

Para validar un método analítico se requiere, en primer lugar, un “entorno” de trabajo que garantice la
seguridad de los resultados que se obtengan.

La garantía de la calidad de los resultados obtenidos en un laboratorio analítico requiere actuar

mediante procedimientos correctos previamente establecidos, que se definen como “Normas Correctas
del Laboratorio Analítico”. Estas normas incluyen, entre otros, los aspectos siguientes:

• Buena organización funcional.

• Personal suficiente y adiestrado.
• Instalaciones adecuadas y suficientes.
• Métodos escritos, disponibles, actualizados y aprobados.
• Equipos y aparatos apropiados, cualificados y en buen estado de funcionamiento.
• Procedimientos apropiados para la toma de muestras.
• Utilización de reactivos apropiados y soluciones valoradas idóneas.
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• Utilización de material auxiliar (vidrio, etc.) apropiados y en perfectas condiciones de uso.

• Utilización de patrones y muestras de referencia correctos.
• Verificación-supervisión de los resultados obtenidos y que los registros de los análisis
efectuados sean auditables.
• Adecuada información y comunicación de los resultados obtenidos.
• Higiene y seguridad.
• Autoinspección.

DEFINICIÓN

En las “Normas de Correcta Fabricación y Control de Calidad de los Medicamentos” definen la

validación como sigue:

“Se llama validación a la obtención de pruebas, convenientemente documentadas, demostrativas

de que un método de fabricación o control es lo suficientemente fiable como para producir el
resultado previsto dentro de intervalos definidos”(2).

En general, se consideran tres tipos de validación:

• Validación prospectiva: para metódicas nuevas.

• Validación retrospectiva: para metódicas repetidamente utilizadas, no validadas
anteriormente y de las que se tiene documentación suficiente para probar la bondad del
método.
• Revalidación: Repetición parcial o total de una validación debido a cambios efectuados que
pueden afectar a la bondad del método validado.

Validación, cualificación y calibración, son conceptos que suelen emplearse de forma indistinta, sin
embargo conceptualmente son diferentes.

Validar: es verificar documentalmente que un método o proceso hace lo que tiene que hacer.

Cualificar: es dotar o verificar las cualidades o características inherentes a un aparato (máquina,

instrumento, etc.).

Calibración: es una parte de la cualificación.

En resumen, los métodos deben ser validados y los aparatos deben ser cualificados.

CRITERIOS FUNDAMENTALES DE VALIDACIÓN

“Las características de funcionamiento de los métodos analíticos deben definirse y usarse

experimentalmente de forma que cualquier analista pueda interpretarlos correctamente (2).
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Se consideran los siguientes grupos de características de funcionamiento:

• Características de fiabilidad.- Son las que demuestran la capacidad de un método analítico para
mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validación.
• Características de practicabilidad.- Son las que deciden si el procedimiento analítico es fácil o
difícilmente realizable en la práctica.
• Características de idoneidad.- Son el conjunto de parámetros que garantizan que el sistema
responde, en el momento del análisis, a los requisitos fijados en la validación del método.

Las características de fiabilidad comprenden cinco criterios fundamentales de validación que son:

• Proporcionalidad entre concentración del analito y respuesta del instrumento. Este concepto se
relaciona con los parámetros linealidad, intervalo o rango y también con la sensibilidad.
• Dispersión de una serie de resultados alrededor del valor medio o central, es decir el “mas-
menos” de un procedimiento analítico. Este concepto está relacionado con los parámetros
precisión, repetibilidad, reproductibilidad y robustez.
• Diferencia entre el valor hallado en el análisis y el valor verdadero. Concepto relacionado con
los parámetros exactitud y recuperación.
• Cantidad mínima de analito requerida para obtener un resultado significativo. Concepto
relacionado con los parámetros sensibilidad, límite de detección y límite de cuantificación.
• Capacidad de un método para determinar el analito sin interferencias de impurezas, productos
de degradación, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra. Este concepto está
relacionado con los parámetros selectividad y especificidad.

PROPAGACIÓN DE ERRORES

Cuando las cantidades que se midieron se van a usar para calcular otra cantidad, los errores de
medición introducen errores en el resultado calculado. En este caso, se dice que los errores se han
propagado a través de los cálculos. Si se ha determinado el error en cada cantidad medida, en los casos
más simples, puede obtenerse el error en el resultado.

El error se define como la diferencia entre el valor verdadero o esperado y el medido y pueden
depender de muchos factores.

ERRORES ALEATORIOS O INDETERMINADOS

Varían en signo y magnitud. Los errores repetitivos varían alrededor de un valor central. Afectan la
precisión de los resultados. Cuando aumentan las repeticiones disminuyen los errores por
compensación.

Todos los procedimientos analíticos están sujetos a errores aleatorios. Estos errores pueden ser
estimados y una vez conocidos, puede establecerse la reproducctibilidad del método.
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ERRORES SISTEMÁTICOS O DETERMINADOS:

Originan desviaciones del mismo signo. Afectan la exactitud del resultado. Pueden ser constantes (que
sean independientes de la concentración) y pueden ser proporcionales (que sean dependientes de la
concentración). Son Debido a las fallas del procedimiento analítico: La etapa defectuosa se repite cada
vez que la determinación se lleva a cabo. Si una muestra se analiza cinco veces, los resultados pueden
ser concordantes entre ellos, pero pueden diferir considerablemente de la respuesta verdadera. Los
errores sistemáticos más comunes se deben a:

• Error de operador: debido al analista, su experiencia, manejo de equipo, etc.

• Reactivos y equipos: impurezas en los reactivos, etc. o lecturas incorrectas de los equipos.
• Método analítico: el método puede tener errores que se compensan entre sí.

Todo aumento del número de pruebas y observaciones, conduce a una disminución del error existente
en la determinación. Para poder detectar los errores, la precisión y la exactitud se emplean términos de
medidas de tendencia central y de dispersión. Siendo éstos determinados estadísticamente.

APLICACIONES ESTADÍSTICAS

MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL

Con frecuencia es útil calcular un solo valor que represente un conjunto de datos. Tal valor se conoce
como medida de tendencia central y algunas veces como “parámetros de localización. Tales medidas
son la media aritmética, la mediana y la moda.

• Media Aritmética.

La media aritmética o promedio es la más comúnmente usada y consiste en la suma de los valores
individuales en un grupo, dividido por el número de valores.

x
n x  x1  x 2  x 3  .......x n
n n

MEDIDAS DE DISPERSIÓN

Además de conocer un parámetro de localización, que es representativo de un grupo de datos, también

es importante conocer el grado de dispersión de los valores individuales. Las medidas usadas con
mayor frecuencia son la varianza, la desviación estándar y la desviación estándar relativa o
coeficiente de variación.
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• Varianza.

Matemáticamente, la varianza (s2) de la muestra es la suma de los cuadrados de las

diferencias entre los valores individuales de un grupo y la media aritmética del mismo,
dividido entre el número de valores menos uno.

La fórmula para calcular este parámetro es la siguiente:

 x 2
s2 

 xx 
2

 x2 
n
n 1 n 1

• Desviación estándar.

La desviación estándar (s) es la raíz cuadrada de la varianza de la muestra.

s s2
• Desviación estándar relativa.

El coeficiente de variación (CV) llamado preferiblemente desviación estándar relativa

(DER), es el cociente de la desviación estándar con la media, multiplicada por 100 para
convertirla en un porcentaje del promedio.

s
DER(CV )  100
x

REPRESENTACIÓN GRÁFICA

Con frecuencia los datos representados en forma de tablas no son fáciles de interpretar. A veces, el gran
número de valores que figuran en una tabla parece resaltar datos individuales más que indicar la
tendencia general en la variación de los datos. Sin embargo, una gráfica obtenida por la simple unión
de un conjunto de datos experimentales permite:

• Ver la tendencia general de los datos.

• Mostrar una relación numérica entre los datos obtenidos en diferentes experiencias.
• Predecir los datos que podrán obtenerse en experiencias realizadas en una serie de diferentes
condiciones a las realmente utilizadas.

En la mayor parte de los trabajos experimentales se pretende estudiar sistemas en los que solo varían
las cantidades o propiedades, las llamadas variables. El método general de estudiar dichos sistemas es
asignar a una variable una serie de valores dentro de un intervalo predeterminado y medir los valores
de la segunda variable. La variable que controla o cambia a voluntad se conoce como variable
independiente y la que se observa o se mide es la variable dependiente.
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LINEALIDAD

Se entiende como linealidad la capacidad de un método analítico de obtener resultados linealmente

proporcionales a la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado.

El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrón del analito, como sobre
muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito. Se determina luego la curva
de calibración, efectuándose posteriormente el tratamiento matemático de los resultados analíticos.

COEFICIENTE DE CORRELACIÓN

El coeficiente de correlación (r) refleja el grado de relación o ligazón entre las variables x
(concentración), y (respuesta).

Su valor máximo es 1. Si r es cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad
elevada.

COEFICIENTE DE VARIACIÓN DE LOS FACTORES DE RESPUESTA

El factor de respuesta (f) es la relación entre la lectura y la concentración. En una calibración lineal los
factores de respuesta deben ser semejantes entre sí y cercanos al valor de la pendiente; por este motivo
se puede tomar el coeficiente de variación de los factores de respuesta como una expresión de la
linealidad. Se considera que coeficientes de variación superiores al 5% indican falta de linealidad.

PRECISIÓN

La precisión es el grado de concordancia entre los valores de una serie de ensayos analíticos efectuados
sobre una muestra homogénea o, expresado de otra forma, la distribución de los valores analíticos
alrededor de su media aritmética.

La idea de precisión, en general, viene expresada por la media aritmética para el valor central y la
desviación estándar para la dispersión de los resultados.

Un estudio de precisión requiere la repetición del análisis sobre una muestra. La precisión así obtenida
se denomina “del método” puesto que incluye todo el procedimiento analítico, desde la preparación de
la muestra hasta la lectura instrumental. También se puede determinar directamente la precisión del
“sistema instrumental”, hallando la variabilidad de respuesta de una solución patrón.
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EXPRESIÓN DE LA PRECISIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO

Desviación Estándar y Coeficiente de Variación (CV).

La precisión se expresa matemáticamente por la desviación estándar o, preferiblemente, por el

coeficiente de variación (desviación estándar relativa). El valor aceptable de precisión de un método
depende de la concentración del analito y del número de repeticiones del análisis.

Existen tablas (Tabla I) que establecen el Coeficiente de variación máximo aceptable de un método
analítico en función de los límites de aceptación del resultado y del número de réplicas.

Tabla I - CV Máximo Aceptable en Función del Intervalo de Aceptación

y del Número de Réplicas (n)

Intervalo de CV (%) máximo aceptable

Aceptación (%)
n=1 n=2 n=3 n=4 n=5
95.0 – 105.0 1.9 2.7 3.3 3.8 4.2
90.0 – 110.0 3.9 5.5 6.7 7.8 8.7
85.0 – 115.0 5.8 8.2 11.6 11.6 12.9
99.0 – 101.0 0.39 0.55 9.67 0.78 0.87
98.5 – 101.5 0.58 0.82 1.00 1.16 1.30
98.0 – 102.0 0.77 1.09 1.33 1.54 1.72

“Por otro lado, Kolthoff indica diferentes coeficientes de variación en función del porcentaje de analito
en la muestra. La tabla II compara los CV permitidos por Horwitz y Kolthoff. Por supuesto que estos
límites son orientativos y no deben interpretarse rígidamente”(2).

Tabla II – CV Máximos Permitidos Según Kolthoff y Horwitz

Porcentaje de analito CV (%) máximo CV (%) máximo

en la muestra Kolthoff Horwitz
100 0.1 – 0.3 2
50 0.3 2.2
10 1 2.8
1 2–5 4
0.1 5 – 10 5.7
0.01 – 0.001 10 8 – 11.3
0.0001 --- 16
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EXACTITUD

El único tipo de cantidad física que puede medirse con una exactitud perfecta es un conjunto específico
de objetos discretos; por ejemplo, billetes y centavos o el número de objetos en un museo. Al medir
cualquier cantidad susceptible de variaciones continuas, por ejemplo, la masa o la longitud, siempre
existe cierta incertidumbre, ya que la respuesta a semejanza de un número irracional como  no puede
expresarse por medio de un número finito de dígitos.

Además de los errores que resultan de las equivocaciones inherentes al experimentador en la

construcción y uso de los mecanismos de medición, existen otros errores sobre los que el
experimentador no tiene control y los cuales están implícitos en las mediciones. En consecuencia, es
necesario que al hacer cualquier medición se efectúen al menos dos, tres o más, determinaciones. El
valor "real", o dicho de modo más correcto, el valor "aceptado", de una cantidad, debe ser seleccionado
tomándose como valor más probable de acuerdo con los datos disponibles.

“La exactitud indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos posibles al
valor verdadero. Si la diferencia entre el valor verdadero y el valor hallado es pequeña, la exactitud es
buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores
determinados que deberían corregirse(2).

No debe confundirse exactitud y precisión. La precisión está relacionada con la dispersión de una serie
de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo cerca que está del valor verdadero. Podemos tener
mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere
cierto grado de precisión.

La falta de exactitud puede ser por defecto o por exceso.

(a) Las desviaciones por exceso suelen producirse cuando existen interferencia analíticas y la
selectividad del método no es la adecuada: los resultados finales son superiores a los
verdaderos. En este caso, debería modificarse el método para hacerlo más selectivo.
(b) Las desviaciones por defecto suelen darse en métodos analíticos muy laboriosos, con
varias fases, extracciones, purificaciones, etc., que se traduce, inevitablemente, en una
disminución de la recuperación.

Un estudio de exactitud permite establecer el porcentaje promedio. Si el porcentaje es bajo se pueden

utilizar unos factores de corrección en los cálculos finales que compensen las pérdidas de analito,
debidas a las manipulaciones previas a la medición final.

EXPRESIÓN DE LA EXACTITUD

- Matemáticamente la exactitud se expresa en forma de porcentaje de recuperación de la

cantidad de analito presente en la muestra, o bien en forma de diferencia entre el valor
hallado y el valor verdadero.
- Estadísticamente suele efectuarse un test de t de Student para determinar si el valor medio
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hallado y el valor considerado como verdadero no difieren significativamente para un grado

de probabilidad determinado.

mx mx mx n

t exp   
sx s s
n
Donde:

m = valor verdadero
x = valor medio
n = número de determinaciones
sx = desviación estándar de la media
s
sx 
n

Para hallar si la exactitud de un método es aceptable, se expresan los resultados en forma de porcentaje
de recuperación y se aplica un test t de Student. Se utilizan las fórmulas anteriores, y simplemente se
sustituye el valor medio x por el porcentaje de recuperación medio R, el valor verdadero m por "100"
y la desviación estándar s por el coeficiente de variación CV.

El porcentaje de recuperación es igual al valor experimental dividido entre el valor real o verdadero.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. GARFIELD F. M. (1993): “Principios de Garantía de Calidad para Laboratorios Analíticos” Trad.

G. García A., Edición española, p. 1, 12-19.

2. ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE FARMACÉUTICOS DE LA INDUSTRIA: “Validación de

Métodos Analícos” Monografía AEFI, p. 4-17, 29.