Evaluación de antimicrobianos en

materiales de vidrio y plástico y control de

calidad de medios de cultivo

Dr. Javier Castro Rosas

jcastro@uaeh.edu.mx
capicr@hotmail.com
 Toxicidad o residuos antimicrobianos en
materiales

Cajas de cultivo

6 cajas 6 cajas 6 cajas

6 cajas normal mente lavadas Lavadas con agua de
normal mente lavadas De Plástico desechables
y con 12 enjuagues detergente y dejar secar C
A B C

Esterilizar

3 cajas con102 y 3 con 103 UFC/caja

Medio de cultivo Incubación

Interpretación de los resultados

• Si no hay efecto tóxicos o inhibitorio, la diferencia entre

los promedios de los conteos de las cajas de los grupos
A-D debe ser inferior al 15%.

• La diferencia en el conteo promedio menor al 15% entre

los grupos A y B, pero superior al 15% entre los grupos
B y C indican que el detergente de limpieza tiene
propiedades inhibidoras que se eliminan con el lavado
de rutina.

• Una diferencia entre B y D superior al 15% indican la

presencia de un residuo inhibidor.
Control de calidad de medios de cultivo

• Productividad

• Selectividad
 Métodos para evaluar
Productividad/selectividad
de medios de cultivo

• Cuantitativos

• Semi-cuantitativos

• Cualitativos
 Productividad. Cuantitativo (Vertido en placa)
Cepa de trabajo (target)
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 102 UFC/mL

1 mL 1 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Adición de medio de cultivo

Incubación

PR

Ns
P R= N
O

PR= ≥0.7 No selectivos y de ≥ 0.1 selectivos

Ns:Total tal de bacterias en el medio problema
No: total de bacterias en el medio de referencia
 Productividad Oxford Cuantitativo (Vertido en placa)
L. monocytogenes ATCC 19111
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 102 UFC/mL

1 mL 1 mL

Oxford AST

Adición de medio de cultivo

Incubación

PR

Ns
P R= N
O

PR= ≥0.5

Ns:Total tal de bacterias en el medio problema

No: total de bacterias en el medio de referencia
Productividad. Cuantitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (target)
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 103 UFC/mL

0.1 mL 0.1 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Adición de medio de cultivo

Incubación

PR

Ns
P R= N
O

PR= ≥0.7 No selectivos y de ≥ 0.1 selectivos

Ns:Total tal de bacterias en el medio problema
No: total de bacterias en el medio de referencia
Productividad Baird Parker Cuantitativo (Vertido en placa)
S. aureus ATCC 6538
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 103 UFC/mL

0.1 mL 0.1 mL

Baird Parker AST

Adición de medio de cultivo

Incubación

PR

Ns
P R= N
O

PR= ≥0.5

Ns:Total tal de bacterias en el medio problema

No: total de bacterias en el medio de referencia
 Selectividad. Cuantitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (No-target)
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 105 -107 UFC/mL

0.1 mL 0.1 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Adición de medio de cultivo

Incubación

SF

SF= Do – Ds (valor en Log10)

SF= ≥2
Do: es la mayor dilución que muestra el crecimiento de al menos 10 colonias en el medio de referencia
Ds: es la mayor dilución que muestra el crecimiento comparable en el medio de ensayo
Selectividad. Cuantitativo (Siembra en superficie)
Cepa de trabajo (No-target)
CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales: 105 -107 UFC/mL

0.1 mL

Medio de prueba

Adición de medio de cultivo

Incubación

No desarrollo
 Semi-cuantitativo (ecométrico)
Cepa de trabajo (target oNo-
target) CST 35°C/18- 24 h
1
2 A
Diluciones decimales:
3
106 UFC/mL
4

Estriar con asa calibrada (1μL)

16 8 7 6 5
15 D B
14
13
3
12
111
10 30°
C 9 20°
 Cálculos
• Después de la incubación, se evalúa la apariencia y tamaño de las colonias
y la intensidad de crecimiento. Y se calcula el índice de crecimiento (GI).
Cada línea o estría que presenta crecimiento se califica con 1.

• La puntuación máxima por cada caja de cultivo es de 16.

• Se da un valor de 0.5 cuando el crecimiento sólo se produce en la mitad de

la línea o estría.

• Un escaso crecimiento en la línea (menos de la mitad de la longitud) o no

crecimiento de colonias, se califica como 0.

• Los resultados se suman para obtener el GI. Por ejemplo, si el crecimiento

se obtuvo en los sectores A y B y en la mitad del sector C, la GI será de 10

A= 4; B=4; C=2

G1=4+4+2= 10
 Límites

Productividad
• Medios no selectivos y Selectivos con cepas target:
GI ≥ 6

Selectividad
• Medios selectivos; cepas No target:
Parcial o completamente inhibida
 Cualitativo
Cepa de trabajo (target oNo-
target) CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales:
106 UFC/mL

Estriar con asa calibrada (1μL)

 Cualitativo
Cepa de trabajo (target oNo-
target) CST 35°C/18- 24 h

Diluciones decimales:
106 UFC/mL

Estriar con asa calibrada (1μL)

0 corresponde a uno desarrollo

1 corresponde a un débil crecimiento
2 corresponde a un buen crecimiento.

Cepas target =2; apariencia, tamaño y morfología. Colonia típica.

Cepas No targer= 0 o 1; desarrollo parcial o totalmente inhibido
 Productividad (Cuantitativo)
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24h)

Cepa de trabajo

Diluciones decimales: 102 UFC/mL

Medio de referencia Medio de prueba

PR

PR= 0.7 No selectivos y de 0.1 selectivos

Ns: tal de bacterias en el medio problema
No: total de bacterias en el medio de referencia
 Medios líquidos

• Cuantitativos

• Semi-cuantitativo

• Cualitativo
Productividad (Cuantitativo) Caldos no selectivos
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

Cepa target

Diluciones decimales: 102-103 UFC/mL

1 mL 1 mL

10 mL 10 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Incubación Si hay estándar lo que marca el estándar

y si no 45 min a 22-25°C

PR= >0.1 No selectivos

Productividad (Cuantitativo). Caldos selectivos. Cultivo
mixto.
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

Cepa target y No target

Diluciones decimales: target 103 UFC y No target >104 UFC/mL

1 mL 1 mL

10 mL Mezcla de las dos cepa 10 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Incubación Si hay estándar lo que marca el estándar

y si no 45 min a 22-25°C

Recuento en medio de cultivo: Medio selectivo

Mayor concentración de la targer
Productividad (Cuantitativo). Diluyentes y medios de
trasporte(MT)
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

Cepa de trabajo (No MEZCLA); Target ó No target

Diluciones decimales; Target: 1000 UFC/mL. No targer >10 4 UFC/mL

1 mL 1 mL

10 mL 10 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Incubar: Diluyente 45 min; MT en de trabajo

Recuento en medio de cultivo: Medio no selectivo

Diferencia máxima 50%
Productividad (Cuantitativo). Caldos selectivos
Cepa de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

Cepa No target

Diluciones decimales: >104 UFC/mL

1 mL 1 mL

10 mL 10 mL

Medio de referencia Medio de prueba

Incubación Si hay estándar lo que marca el estándar

y si no 45 min a 22-25°C

SF = 2
 Medios líquidos

• Evaluación Semi-cuantitativa
Productividad (Semi-cuantitativo)
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

Cepa target

Diluciones decimales: 103 UFC

1 mL

10 mL

Medio de prueba

Incubación

Lectura de los tubos

Productividad (Semi-cuantitativo). Caldo EC
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

E. coli ATCC 25922

Diluciones decimales: 103 UFC

1 mL

10 mL

Caldo EC

44.5° / 24-48 h

Producción de gas y turbidez

 Caldo Fraser. Evaluación Semi-cuantitativa
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

L. monocytogenes E. coli ATCC 25922

Diluciones decimales: 103 UFC/mL Diluciones decimales: >104 UFC/mL

1 mL 1 mL
Productividad

Selectividad
10 mL 10 mL

Caldo Fraser Caldo Fraser

37°C/48 h 37°C/48 h
10 μL 10 μL
Siembra en Oxford Siembra en AST
por estría por estría

>10 UFC típicas Completa inhibición ó < 10 UFC

 Caldo Rappaport. Semi-cuantitativa
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

S. Typhimurium ATCC14028 E. coli ATCC 25922

Diluciones decimales: 103 UFC/mL Diluciones decimales: >104 UFC/mL

1 mL 1 mL
Productividad

Selectividad
10 mL 10 mL

Caldo Rappaport Caldo Rappaport

42°C/24 h 42°C/24 h
10 μL 10 μL
Siembra en Agar Verde Siembra en AST
Brillante por estría por estría

>10 UFC típicas Completa inhibición ó < 10 UFC

 Medios líquidos

• Evaluación Cualitativa
 Evaluación Cualitativa
Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

target No target

Asada (1 μL) Asada (1 μL)

Productividad

Selectividad
10 mL 10 mL

Caldo a evaluar Caldo a evaluar

Incubar Incubar

Turbidez:
- no turbidez: 0
- escasa turbidez: 1 No turbidez
- Alta turbidez: 2

Turbidez: 1 a 2
Evaluación Cualitativa. Productividad
Caldo BHI

Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24 h)

S. aureus ATCC 25923

Asada (1 μL)

10 mL

BHI

37°C / 24 h

Turbidez: 1 a 2
Evaluación cualitativa. Selectividad
Caldo EC

Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 24h)

Pseudomonas aeruginosas ATCC 27853

Asada (1 μL)

10 mL Un solo tubo

Caldo EC

44.5° / 24-48 h

No turbidez ni gas
¿Y el procedimiento para determinar
toxicidad del agua destilada?
Otros medios materiales a evaluar

• Medios para pruebas bioquímicas

– Metodología especificada por el productor o en los
estándares (microbiología médica)

• Antibióticos. Metodología especificada por el

productor o en los estándares (microbiología
médica)
Validación de métodos alternativos
de análisis microbiológico
 Introducción
• Justificación

• Pertinencia

• Metodología

• Factibilidad

• Métodos cualitativos y cuantitativos

 Requisitos previos
• Implementación de BPL

• Control de calidad funcionando

• Laboratorio de alta calidad

• Estudios interlaboratorio

• Incertidumbre de las mediciones

 Requisitos (protocolos)

• Sensibilidad de las técnicas

• Productividad de las técnicas

• Estabilidad de las muestras

• Estrés celular

• Contaminación
 Términos y definiciones
• Método alternativo: método de análisis que se utiliza para
investigar o estimar el mismo analito que el correspondiente método
de referencia.
a) El método puede ser no comercial, y no necesariamente tiene que
sustituir por completo el procedimiento de análisis del método de
referencia, es decir desde la preparación de muestras hasta el
resultado final.

b) El método alternativo exhibe los atributos adecuados a las

necesidades de los usuarios, por ejemplo:
- Velocidad de análisis y / o respuesta.
- Facilidad de ejecución y / o la automatización.
- Propiedades analíticas (precisión, exactitud, límite de detección, etc).
- Ahorro de material (miniaturización).
- Reducción de costos.
 Términos y definiciones
• Método de referencia: método internacionalmente reconocido y
ampliamente aceptado.
• Validación de un método alternativo: demostración de que los resultados
obtenidos por el método alternativo son comparables a los obtenidos por el
método de referencia.
• Analito: componente medido por el método de análisis. Puede ser un
microorganismo.
• Método cualitativo: método de análisis cuya respuesta es la detección
(directa o indirecta) de la presencia o ausencia del analito en una cierta
cantidad de muestra.
• Método cuantitativo: método de análisis cuya respuesta es la cantidad de
analito determinado ya sea en forma directa (enumeración en una masa o
un volumen), o indirecta (absorbancia, color, impedancia, etc) en una cierta
cantidad de muestra.
 Términos y definiciones

• Comparación de métodos de estudio: es el estudio realizado por un

laboratorio calificado en el que se compara el método alternativo contra el
método de referencia
• Estudio interlaboratorio: es el estudio del método entre varios
laboratorios usando muestras comunes y bajo el control del laboratorio
calificado.
• Laboratorio calificado: Laboratorio que cuenta con el personal calificado y
la capacidad necesarias para efectuar el estudio comparativo del método
alternativo y organizar el estudio interlaboratorio.
• Es necesario contar con un técnico con experiencia en estadística para el
análisis de los resultados.
 Principios generales para la validación y la
certificación de métodos alternativos

Validación de protocolo
• El protocolo de validación consta de dos fases:
– A) Un estudio comparativo del método alternativo contra el método de referencia
efectuado por el laboratorio calificado.

– B) Un estudio interlaboratorio de cada uno de los dos métodos.

• Si es posible, las dos fases se podrán llevar a cabo en paralelo.

• Si el método alternativo ya ha sido validado y satisface las disposiciones

establecidas por una organización de reconocido prestigio (como la AOAC)
no aplican los puntos anteriores; reglas específicas son definidas más
adelante para esta situación.
 Protocolo para la validación de métodos
cualitativos
Muestras de alimentos
• Como prioridad se debe trabajar con muestras de alimentos contaminados
naturalmente con el analito que se desea detectar.

• Para su análisis los alimentos se agrupan en las siguientes categorías:

1. Productos cárnicos: Crudos, procesados por calor, congelados, fermentados, curados,

patee.
2. Pollo: Crudos, procesados por calor, congelado.
3. Peces y productos marinos: Crudos, procesados por calor, congelados, ahumados
4. Frutas y vegetales: Crudos, procesados por calor, congelados, deshidratados,
fermentados, curado, salados, jugos, concentrados, baja humedad.
5. Productos lácteos: Crudos, procesados por calor, congelados, deshidratados,
fermentados.
6. Chocolate y productos de panadería: de baja humedad, deshidratados, masa,
repostería.
7. Otros productos: cerveza, rellenos de panadería, especias, mayonesa, pasta, huevo y
derivados, cereales, arroz.
 Tipo de muestras
• Si se trata de validar el método para todos los alimentos se deben
analizar las categorías mencionadas.
• Las muestras ambientales pueden ser incluidas como una
categoría.
• Es deseable que las muestras de alimento sean de la más amplia
distribución posible, a fin de reducir cualquier sesgo por alimentos
especiales locales y ampliar la gama de validación.
• Al analizar muestras contaminadas naturalmente, el alcance y la
distribución de la contaminación de las muestras son
representativos de los niveles que normalmente se encuentran en
ese producto.
 Tipo de muestras
• Si no es posible adquirir un número suficiente de
alimentos contaminados naturalmente para cada una de
las categorías, se puede recurrir a muestras de
alimentos contaminación artificial.
• El método y los niveles de contaminación deberán ser
similares a los naturalmente contaminados.
• En muestras contaminadas artificialmente la microflora y
el microorganismo de prueba deberán estar en una
concentración, tipo y estado de estrés similar al que
ocurre naturalmente en los productos contaminados.
 Número de muestras

• El número de porciones de ensayo a analizarse es de 60 para cada

categoría de alimentos. por cada método se tiene que analizar un
mínimo de 60 porciones.
• Puede ser una sola categoría
• Dentro de cada categoría seleccionar tipos de alimentos
representativos
• Para muestras artificialmente contaminadas, para cada tipo de
alimento ajustar los niveles del microorganismo para lograr
muestras positivas y negativas: 50% inoculadas y el 50 % no
inoculadas.
 Preparación de la muestra
• La misma sub-muestra debe ser analizada, en la medida
de lo posible, con ambos métodos a comparar.
• Si la primera etapa de los dos métodos es la misma (por
ejemplo, el mismo caldo de pre-enriquecimiento),
realizar la división de la sub-muestra en el segundo paso
(Esquema 1).
• Si existen diferencias, desde el inicio preparar pares de
porciones de ensayo para el análisis. Esquema 2
 Esquema 1. Preparación de la muestra
Caso 1. Cuando todas las condiciones de cultivo de la primera etapa
por ambos métodos es idéntica.

25 g de alimentos

Homogenización

Primera etapa del cultivo

(p.e.pre-enriquecimiento)

Incubación

División

Método de referencia Método alternativo

Continuar el análisis de acuerdo a cada protocolo

 Esquema 2. Preparación de la muestra
Caso 2. Cuando la primera etapa del cultivo de ambos métodos es
diferentes

Para productos 50 g de muestra + 50 de diluyente

no líquidos
Para productos
Homogenización
Líquidos (50 mL)

División

Método de referencia Método alternativo

50 g de homogeneizado (o 50 g de homogeneizado (o
25 g de productos líquidos) 25 g de productos líquidos)
+ medio de cultivo para dar + medio de cultivo para dar
la correcta w / v ratio la correcta w / v ratio

Continuar con el análisis

de acuerdo a cada protocolo
Cuadro 1. Relación de los resultados obtenidos con
ambos métodos.

Respuestas Positivos por el método de Negativos por el método de

referencia (R+) referencia (R-)
Positivos por el método Relacion Positiva +/+ (RP) Desviavión Positiva +/+
alternativo (A+) (DP) (R-/A+)
Negativos por el método Desviavión negativa -/- Relacion negativa -/- (RN)
alternativo (A-) (DN) (A-/R+)
Protocolo para evaluar la sensibilidad de las técnicas

Alimento representativo

Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 23 h)

5 niveles de Inoculo*

Diluciones decimales: 0, 1, 5, 50, 500

Cada inóculo por sextuplicado

Técnica a evaluar

Resultado
 Productividad

Alimento representativo

Cepas de trabajo (CST 35°C/18- 23 h)

2 nivel de inóculo 0 y el de la sensibilidad

Mínimo 20 muestras

Técnica a evaluar

Resultado