INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MEDICAMENTOS

Valoración microbiológica de
antibióticos
Equipo 10
Alegría Hernández Alejandra
González Buendía María Magdalena
Segura Bermúdez Ana Laura
 Valoración microbiológica de
antibióticos
Actividad biológica de los antibióticos se demuestra
por su efecto inhibitorio sobre microorganismos bajo
condiciones establecidas.
Importancia de determinar la potencia
• Determinar la sensibilidad de un cultivo a diferentes
antibióticos.
• Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI).
• Asignar a un microorganismo en las categorías de
sensible o resistente.
• Asegurar la eficacia antimicrobiana de un producto
farmacéutico.
Técnicas para determinar la potencia
ENSAYOS INMUNOLÓGICOS
ENSAYOS QUÍMICOS

• HPLC ❖ Inmunoensayo de
• Espectrofotometría UV. polarización fluorescente.
❖ Radioinmunoanálisis.

Mediciones cuantitativas de la pureza de los antibióticos

No pueden proporcionar una indicación verdadera de la actividad

biológica
 Métodos de valoración

Métodos Químicos Métodos Microbiológicos

Ligeros cambios químicos en los antibióticos Pérdida de actividad

antimicrobiana. NO DETECTABLE POR MÉTODOS QUÍMICOS
 Valoración microbiológica de antibióticos
Antibiótico analizado
Grado de inhibición de mo
POTENCIA sensibles y específicos producida
por concentraciones conocidas Sustancia de referencia

MGA 001

Turbidimétrico

Cilindro en placa
 Método turbidimétrico
Medición espectrofotométrica
del crecimiento del
microorganismo de prueba en
un medio líquido.

Concentraciones
crecientes de antibiótico
 Método de cilindro en placa (difusión en
agar)

FUNDAMENTO
Difusión del antibiótico a
través de una superficie
con agar inoculado con el
microorganismo de
prueba
 Características del material
• Limpio y seco.
• Libre de detergentes y antibióticos.
• Material en contacto con el microorganismo debe
esterilizarse.
 Características del material

20 mm x 100 mm diámetro externo: 8 0.1 mm

diámetro interno: 6 0.1 mm
longitud:10 1mm
 Factores que afectan el halo de
inhibición
• pH del medio de cultivo.
• Componentes del medio de cultivo.
• Tamaño del inóculo
• Estabilidad del medicamento.
• Tiempo de incubación.
• Antagonismo.
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Método de difusión en agar. Preparación de las placas
Medios de cultivo

Medio 11

Peptona
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Extracto de carne
Dextrosa
Preparación del inóculo
G+
 Ensayo de potencia
Preparación del estándar de referencia
Pesar y diluir estándar hasta una concentración
1 microgramo/mL de ampicilina

Farmacopea
1) Agua 2) Solución
estéril amortiguadora
Preparación de la solución madre y diluciones de prueba de la
SRef
 Soluciones amortiguadoras

a
b
c

Ampicilina

3b
 Diluciones del estándar
Pesar la cantidad adecuada (por ejemplo 10 mg) y diluir hasta obtener una solución
que contenga ( 1 µg/mL)
Diluyente inicial: agua destilada
Diluyente final: Regulador de fosfatos.

EJEMPLO
1 mg del estándar contiene 893.56 µg de principio activo

Si 1 mg ----------- 893.56 µg
x --------------- 10000 µg

x= 11. 19 mg

11.9 mg (10000 µg) ------ 100 mL = 100 µg/mL

1 mL (100 µg/mL) --------------- 100 mL = 1 µg/mL
 Curva tipo
Tomar de la solución de 1 µg/mL

a) 6.4 mL ( 6.5 µg) --------------------- 100 mL = 0.064 µg/mL

b) 8.0 mL ( 8.0 µg) --------------------- 100 mL = 0.080 µg/mL
c) 10 .0 mL (10.0 µg) ------------------- 100 mL = 0.100 µg/mL
d) 12.5mL (12.5 µg) --------------------- 100 mL = 0.125 µg/mL
e) 15. 6 mL (15.6 µg) -------------------- 100 mL = 0.156 µg/mL
 Ensayo de potencia
Preparación de la muestra

Solución 0.1 µg/mL

EJEMPLO:
Muestra de ampicilina inyectable 500 mg/2 mL = 250 mg/mL.
Tomar:
Hidratar producto de a) 1 mL (250 000 µg) ----------- 100 mL = 2500 µg/mL
acuerdo al marbete b) 1 mL (2500 µg) ----------------100 mL = 25 µg/mL
c) 2 mL (50 µg)---------------------100 mL = 0.5 µg/mL
d) 10 mL ( 5 µg) -------------------50 mL = 0.1 µg/mL

AFORAR CON REGULADOR DE FOSFATOS

 Prueba del inóculo
Suspensión bacteriana: 0.5, 1 y 2 mL

100 mL
Agar antibiótico
11
Ampicilina
0.1
microgramos/mL

35- 37ºC / 24 h
Prueba del inóculo
Examinar y medir halos de
inhibición
Halo de inhibición punto C: 14-16 mm

Volumen de suspensión que produzca

la zona óptima de inhibición

Ensayo
 Colocación de la capa base

Solidificar

21 mL Agar
antibiótico 11

El número de placas depende del número de muestras

por analizar (3 placas por muestra).
Curva tipo: 12 placas.
 Preparación de la capa siembra

Homogenizar
Solidificar

Agar 11
4 mL
 Colocación y llenado de los
cilindros
Para la muestra Colocador de
cilindros
c o pinzas estériles y
una plantilla

m m

c c

m: muestra
c: estándar de m
concentración
 Colocación y llenado de los
cilindros
Para la curva tipo
c

x x

c c
x= a, b, d, e
x
 Criterios de validez del análisis
• Relación directamente proporcional dosis-
respuesta de los promedios de los halos de
inhibición.
• Diámetro punto C: 14-16 mm
 Especificación
Contiene el equivalente a no menos de 90% y
no más de 115% de la cantidad indicada en el
marbete.
Ensayo microbiológico
de ampicilina
 Metodología
St. de referencia Preparación de la
Agar fundido
muestra

Cajas petri 21 mL agar

(capa base)
c
Diluciones hasta una
Diluciones Adicionar 4 mL agar + concentración 0.1 o
a,b,c,d,e microorganismo de prueba m 1 microgramo/mL
m

c y llenar cilindros
Colocar c

Incubar 32-35 ºC/ m

24 h

Lectura y cálculos
Resultados
 Cálculos: Curva tipo
c
1. Promedios de lecturas (9)
x x

2. Corregir valores
X-c c c

Promedio 9 lecturas de a=20 mm x

Promedio 9 lecturas de c=22 mm
X-c= 22-20=-2
 Cálculos: curva tipo
3. Calcular el estándar 36 (Est 36)
Promedio punto c
4. Corrección de valores
Est 36= 22.6 mm Diferencia obtenida (X-c)=-2.0
22.6-2.0= 20.6 mm
Valor corregido
 Cálculos: Curva tipo
5. Calcular puntos alto (H) y bajo (L)
L= 3a+2b+c-e/5 H=3e+2d+c-a/5
6. Graficar H y L en papel semilogaritmico
Concentración vs diámetro
7. Interpolar
 Cálculos: Muestra
1.Promedio lecturas y estándar (9)
2. Diferencia de promedios
Muestra (x)= 21 mm Estándar (c)= 23 mm
X-c= 21-23= -2 mm
 Cálculos: Muestra
3. Sumar o restar la diferencia al punto central
de la recta (PCR)
PCR= 21 mm X-c=-2
21-2= 19 mm Valor corregido

4. Interpolar valor corregido

 Cálculos: Muestra
5. Multiplicar concentración x Factor de
dilución (FD)
19 mm 0.094 microgramos/mL
FD= 2500000

0.094 x 2500000= 235 000 microgramos/mL= 235mg/mL

250 mg/mL (marbete) ------ 100%

235 mg/mL----- x=?

x=94%
 CURVA TIPO
Tabla 1. Resultados de halos de inhibición de la curva tipo.
Diámetro de halos (mm) Diámetro de halos (mm) Diámetro de halos (mm) PROMEDIO
PLACA 1 PLACA 2 PLACA 3 (mm)

a 10 9 8 10 10 9 8 9 9

c 15 14 16 13 15 16 16 14 14

b 12 11 12 13 12 11 11 12 12

c 14 14 15 14 13 13 16 15 15

d 17 18 18 17 17 18 18 18 18

c 14 15 15 13 15 14 16 15 14

e 20 21 22 20 20 21 21 21 20

c 16 15 15 14 14 15 15 13 13
♦ Diferencias de puntos.

Diferencia de punto (a,b,d,e) = promedio del punto (a,b,d,e) - promedio de punto c

“correspondiente”

Punto a =
36

Punto b =

Punto d =

Punto e =
♦ Corrección de puntos.

Valor corregido (a,b,d,e) = St 36 + diferencia obtenida de punto (a,b,d,e) (SUMA ALGEBRÁICA)

Punto a =

Punto b =

Punto d =

Punto e =

St 36=
♦ Graficar.
El equipo encargado graficará en papel semilogarítmico los
puntos H y L y extrapolará en 0.1 mg/mL para obtener él
PCR (o sea los mm del diámetro del halo de inhibición que
corresponden a la dosis media de la curva tipo).

Posteriormente escaneará su gráfica e insertará en este

espacio la imagen escaneada.

Nota.- No deberán hacer una regresión lineal para obtener

el PCR
Extrapolar PCR, sino
= 100 aplicar
% actividad el método gráfico que se indica en este
biológica
recuadro.
 Cálculo de % de potencia de una muestra de ampicilina:
Resultados de halos de inhibición.
Diámetro de halos Diámetro de halos Diámetro de halos (mm) Promedio Factor de corrección Valor corregido
(mm) (mm) PLACA 3 FC = (M – c) PCR + FC
PLACA 1 PLACA 2

Muestra 16 17 16 17 17 16 18 16 16 16.5

C 14 13 12 14 14 14 14 15 14 13.7

Cálculo de potencia:
• Interpolar en valor corregido de mm de halo de inhibición de la muestra en la curva tipo para
obtener los mg/mL que le corresponden = X mg/mL
● Multiplicar por el factor de dilución de la muestra, en este caso 2,500,000
● X m g/mL x 2,500,000 = mg/mL= mg/mL
● En el marbete se indica
● 250 mg/mL ----100 % Especificación:
mg/mL x = % Contiene el equivalente a no menos de 90% y no más del
115% de la cantidad de C16H19N3O4S indicada en el marbete.