Procedimiento de prueba

Preparación de las diluciones

Se debe preparar un mínimo de 5 a 6 diluciones de la muestra para realizar una curva dosis
respuesta y así obtener valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0 % y para muestras
ambientales de 0.3 a 0.5.
Para la preparación de cada dilución se utiliza agua dura reconstituida (es posible el uso de
agua mineral dura para consumo humano), realizando el control negativo con el agua de
dilución empleada. Para el caso de las muestras cuya toxicidad es desconocida, previo a la
realización de la prueba definitiva, se sugiere hacer una prueba exploratoria (ensayo preliminar)
utilizando diluciones logarítmicas (100, 10, 1, 0.1, 0.01) que permitan establecer el intervalo de
concentración conveniente para obtener valores de efecto entre 100 y 0%.
Control de calidad de pruebas
Se debe establecer valores de elongación en el control negativo y también para un control
positivo, se realizan cartas control para evaluar el crecimiento en los controles negativos
(promedio ± 2σ de la elongación de la radícula) y de la sensibilidad frente al compuesto tóxico
de referencia (promedio ± 2σ de la CE50 para el Zn(II) preparado a partir de sulfato de zinc). La
reducción en el poder germinativo (< 90%) y el aumento en la variabilidad de las medidas de
elongación de radícula e hipocótilo en el control negativo a lo largo del tiempo, son indicadores
de la reducción de la vitalidad y envejecimiento de las semillas. En este caso se recomienda
utilizar un nuevo lote de semillas.
Desarrollo de la prueba
Colocar en cada caja Petri un disco de papel de Filtro
Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la fecha y hora de
inicio y término del bioensayo
Saturar el papel de Filtro con 4 o 5 mL de la dilución evitando que se formen bolsas de aire
Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas, dejando espacio suficiente
entre las semillas para permitir la elongación de las raíces.
Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad. Dado
que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que se produzca la
germinación (semillas fotoblásticas negativas), las cajas de Petri deben cubrirse de la luz
inmediatamente después de colocarlas las semillas en su interior y durante el período de
ensayo Incubar por 120 horas (5 días) a una temperatura de 22 ± 2 ºC Realizar repeticiones
para cada dilución ensayada.
Tabla 1.- Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda con Lactuca sativa L.

Figura 2.- Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con semillas de Luca Sativa L.
Se debe realizar un registro de las semillas que germinaron normalmente. Utilizando un papel
milimétrico o regla, medir cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocótilo de cada
una de las plántulas, correspondientes a cada concentración del compuesto tóxico o dilución de
muestra y a los controles.
Figura 3.- Esquema de plántula de Lactuca sativa al Finalizar el período de exposición

Figura 4.- Estadios por los que atraviesa la semilla Lactuca sativa durante el ensayo de germinación y
elongación

Datos a registrar

 Altura de la planta (medido en cm)

 Peso aéreo seco (medido en g)
 Peso radicular seco (medido en g)
 Número de hojas
 Diámetro del tallo (medido en mm)
Cálculos:

 Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de las

plántulas de cada repetición
 Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el promedio
de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control
negativo
  Porcentaje de inhibición en la germinación
 Con los datos obtenidos, se elabora una gráfica dosis/respuesta, colocando los datos
del porcentaje de inhibición en la ordenada, y la concentración en la abscisa. Mediante
un método grafico se calcula la concentración que produce el 50% de inhibición
(CI50/CE50) para cada punto final evaluado.

Germinación relativa de semillas (GRS):

N de semillas germinadas con agua del sitiode muestreo
GRS ( % ) = × 100
N de semillas germinadas con agua del testigo

Crecimiento relativo de la radícula (CRR):

longitud media de radicula con agua de sitio de muestreo
CRR ( % ) = ×100
longitud media de radicula con agua de testigo

Índice de germinación (IG):

GRS ×CRR
IG ( % )=
100

Índice de porcentaje de germinación residual normalizado (IGN):

Germ ( x )−Germ (testigo )

IGN =
Germ ( testigo )
Donde:

 Germ (x): porcentaje promedio de semillas germinadas en el agua de cada sitio de

estudio
 Germ (testigo): porcentaje de semillas germinadas en el testigo

Índice del porcentaje de elongación radical residual normalizado (IER):

Elong ( x ) −Elong(testigo)
IER=
Elong (testigo)
Donde:

 Elong (x): longitud promedio de la radícula de las semillas germinadas en cada sitio de
estudio
 Elong (testigo): longitud promedio de la raticula de las semillas germinadas en el
testigo
Crecimiento relativo del hipocótilo (CRH):
longitud media de hipocotilo con agua del sitio de muestreo
CRH = × 100
longitud media de hipocotilo con agua del testigo

Índice del porcentaje de elongación del hipocótilo residual normalizado (IEH):

Elong ( x )−Elong ( testigo )

IEH=
Elong ( testigo )
Donde:

 Elong (x): longitud promedio del hipocótilo de semillas germinadas en cada sitio de
estudio
 Elong (testigo): longitud promedio del hipocótilo de semillas germinadas en el testigo