Interpretación de resultados de laboratorio de patologías monitoreadas, análisis

de las muestras tomadas desde los RM (rastro municipal) para la toma de

decisiones.

UNAN-LEON
MÓDULO: MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO N° 2: Identificación y recuento de Mesófilos aerobios

1. Objetivo.

El siguiente instructivo tiene como principal objetivo el conocer la cantidad de

microorganismos de aerobios Mesófilos que contienen muestras de carne y leche.

2. Introducción.

Mesófilos aerobios: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis (en

presencia de oxigeno)
Recuento: Es la determinación del número de células viables de Mesófilos presentes en una
muestra, utilizando medios cultivos.
La determinación de microorganismos aerobios Mesófilos por el método recuento en placa
se fundamenta en la capacidad de todos los microorganismos (Bacterias, levaduras y
mohos) de desarrollarse en presencia de oxígeno a una temperatura de 35°C por 48 h. Este
método estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.

Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones decimales sucesivas. Siembra en

placas utilizando el medio de cultivo específico y la cantidad de muestra apropiada,
Incubación aeróbica de 35°C por 48 h. Calculo del número de unidades formadoras de
colonias (UFC) por gramo (g) / ml de la muestra a partir del número de colonias obtenidas
en las placas que contienen 250 colonias.

3. Descripción del método de ensayo

a) Equipos y materiales

1- Utensilios estériles para la manipulación de las muestras tijeras, cucharas.

2- Placas Petri estériles de vidrio o de plástico de 90-100 mm de diámetro.
3- Botellas de vidrio de 1000 mL de capacidad.
4- Tubos de 16 x 160 mm.
5- Pipetas bacteriológicas estériles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 ml
 6- Incubadora regulada a 35 ± 2ºC
7- Agitador de tubos Vortex
8- Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente
9- Cabina de bioseguridad clase II.
10- Baño maría
11- Balanza analítica
12- pH- metro digital.
13- Bolsas para stomacher.
14- Gradillas para tubos de ensayos de 16 x 150 mm.

b) Soluciones, medios, reactivos químicos y biológicos

1. fosfato buferada de Butterfield pH 7.2 ± 0.1 distribuida en volúmenes de 9 mL en

tubos de tapa rosca.

2. Agar para recuento en placas: Agar Plate Count Agar.

4. Preparación de la muestra.

En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones adecuadas al producto,

hasta el momento del examen.

5. Realización del ensayo

1. Pesar 50 ± 0.5 g la muestra en bolsa para Stomacher

2. Agregar 450 ± 45.0 mL de Agua dilución fosfato, agitar completamente.

3. Preparar diluciones decimales de 10ˉ², 10ˉ³. a partir del homogeneizado de la

muestra. Para ello transferir 1 mL a un frasco con 9 mL de diluyente.

4. Identificar las placas Petri con número de la muestra y dilución.

5. Sembrar 1 mL por duplicado de cada dilución en placas estériles previamente

identificadas.

6. Verter en cada placa Petri aproximadamente 12-15 mL de agar previamente fundido

y mantenido en baño de agua a 47°C ± 2 ºC.
 7. Mezclar el inoculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma
adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente:

a) Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,

b) hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,

d) hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

8. Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente para prevenir el
crecimiento de colonias invasivas por acumulación de humedad.

9. Incubar a 35 ºC durante 48 horas ± 2 horas

Recuento de colonias

1. Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro.

2. Placas de 25 - 250 colonias:

• Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo.

• Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño.

• Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa.

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente

manera:

3. Placas con más de 250 colonia:

 Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar
(MNPC).

4. Placas con menos de 25 colonias (< 25 colonias)

Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, registre
los valores obtenidos e indique como recuento estimado.

5. Placas sin desarrollo de colonias

Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin
desarrollo en la dilución correspondiente (SD) o < 1 por la correspondiente dilución
más baja e indique como recuento estimado.
 6. Crecimiento invasivo

Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:

a) El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por
desintegración de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar
el agar con la alícuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar
como una colonia. Si una o más cadenas parecieran originarse de fuentes distintas,
contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal
cadena como una colonia.

b) El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de

agua entre el agar y el fondo de la placa Petri.

c) El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la

superficie del agar.

Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual
se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alícuota de siembra es uniformemente
distribuida en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas.

d) Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias

solamente:

• Si el área invadida no excede la mitad de la placa.

• Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida.

• Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo.

6. Interpretación de Resultados

Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen dentro
del rango 25 a 250 colonias:
- Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales
- Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución.
Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango 25-250
colonias calcular según la siguiente fórmula:
N =ΣC/[(1 x n1) + (0.1 x n2)] x d
Donde:
N = número de colonias por g/ ml de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento

Ejemplo
1: 100 1:1000
_________________
232 y 244 33 y 28
N =232 + 244 + 33 + 28/[(1 x 2) + (0.1 x 2)] x 0,01
N=537/0.022
N= 24 409
Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 25-
250 colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.

Todas las placas con menos de 25 colonias.

Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, informar el
recuento como menor de 25 por el recíproco del factor de dilución menor.

Ejemplo
1: 100 1: 1.000 R A M (g/ml)
_______________________________________________
18 2 < 2.500
0 0 < 2.500
Todas las placas con más de 250 colonias

Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 250 colonias cada una (pero menos
de 100 por cm²) contar las placas más cercanas a 250, sacar promedio y multiplicar por el
recíproco de la dilución.
Ejemplo
1:100 1: 1.000 R A M (g/ml)
____________________________________________
MNPC 640 640.000 recuento en placa estimado

(MNPC = Muy numeroso para contar)

7. Aseguramiento de la Calidad

Controles del Método

Realizar controles de: ambiente, esterilidad del medio de cultivo, esterilidad del
diluyente.

Incubar los controles junto con las muestras y analizar estos de la misma manera
que la muestra.
ANEXO: 2

Agar recuento en placa

Izquierda: Placa con crecimiento máximo de UFC.

Derecha: Placa con crecimiento mínimo de UFC.

Placa con crecimiento entre 25-250 UFC.