PRACTICA No.

“RECUENTO DE ORGANISMOS MESOFíLICOS AEROBIOS”

INTRODUCCIÓN

Dentro de nuestra legislación, el asegurar la calidad microbiológica de los alimentos es

de esencial importancia, ya que éstos, por sus condiciones de elaboración y manejo,
pueden convertirse en vectores de enfermedades causadas por microorganismos
patógenos. La NOM-092-SSA1-1994 establece la metodología para el recuento de
microorganismos mesofílicos aerobios y así, evaluar de alguna manera la inocuidad de
un alimento. Esta técnica es de utilidad en productos fresco-enfriados, congelados,
precocidos o alimentos preparados.

En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos

presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc. hacen
que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente
presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.

Cuando la temperatura de incubación ha sido entre los 20 y los 37°C se le designa

como organismos mesofílicos aerobios, cuenta total viable, cuenta estándar en placa
viable general, cuenta total aeróbica o cuenta en placa aeróbica.

Al grupo de organismos mesofílicos aeróbicos pertenece una gran variedad de

microorganismos, de hecho, están incluidos todos aquellos microorganismos capaces
de desarrollar entre 20 y 37°C, que son los extremos de las temperaturas a las cuales
suele realizarse este recuento, en condiciones de aerobiosis.

Dentro de la flora mesofílica aerobia tenemos bacilos, cocos, gram positivos y gram
negativo, aislados o agrupados en todas las variedades que nos son familiares.

La utilidad de las bacterias mesofílicas aerobias en la microbiología sanitaria se ha

recomendado para los siguientes objetivos:

o Como indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.

o Como indicador del valor comercial de un alimento.
o Como indicador de la idoneidad de un ingrediente cuando se va a incorporar a un
alimento.
o Para seguir la eficiencia de un proceso germicida o de preservación.
o Para predecir la vida de anaquel de un alimento.

El recuento de mesofílicos aerobios presenta limitaciones que deben tenerse en cuenta:

o En alimentos madurados se recurre a la adición de microorganismos, por lo que

impide que puedan ser considerados como grupo indicador en estos procesos.
 o En alimentos desecados los microorganismos pierden viabilidad, por lo tanto no
se puede referir su número al momento en que fue envasado en la planta.
o La presencia de inhibidores en el producto.
o Sólo una pequeña porción del alimento es analizada.
o La técnica sólo pone de manifiesto las bacterias viables, por lo que, no puede
saberse con certeza las posibles violaciones en el manejo de los alimentos
previas a un tratamiento térmico o de otra forma destruir microorganismos.

Principio base del método.

El método se basa en incubar en agar de recuento en placa, a 35ºC y durante 48 hrs.,

volúmenes medidos de diferentes diluciones de la muestra, y contar el número de
colonias producidas para determinar el número de gérmenes viables o unidades
formadoras de colonias por gramo de muestra.

OBJETIVO

Comprender el procedimiento de análisis en la determinación de la cuenta total de

bacterias mesofílicas en alimentos, para evaluar su calidad microbiológica.

REQUERIMIENTOS PARA LA PRÁCTICA

Basados en la NOM-092-SSA1-1994
(Por equipo)
MATERIALES
1 Agitador de vidrio Algodón
5 Pipetas de 1 ml estériles Papel aluminio
3 Pipetas de 5 ml estériles Cerillos o encendedor
3 Pipetas de 10 ml estériles Cubre bocas desechables
1 Termómetros de 20 – 150ºC Marcador permanente punto fino
1 Vaso de vidrio para licuadora 250 ml
1 Pinzas para Matraz Erlenmeyer
1 Espátula
6 Placas petrifilm para recuento de aeróbicos
1 Aplicador para placa petrifilm
1 Frasco de dilución

REACTIVOS EQUIPO
Agua destilada 1 Potenciómetro calibrado
Fenol 5% o trifeniltetrazolio acuoso 1% 1 Balanza con sensibilidad de
0.01 g
Buffer pH 4, 7, 10 1 Autoclave
NaOH 0.1N 1 Baño maría
HCl 0.1N 1 Estufa de cultivos
Agua destilada estéril 1 Cuentacolonias de campo
oscuro
2 Mecheros Fisher
 PROCEDIMIENTO

a) Preparación de la muestra.

Asépticamente pesar 10 g. de muestra y diluir en 90 ml. de agua peptonada al 0.1% (o

agua destilada estéril) .
Homogenizar la mezcla por trituración en un vaso esterilizado de licuadora durante 60-
90 segundos.

b) Diluciones.

Según el número de gérmenes esperado y sobre la base de la solución inicial de 10 g.

en 90 ml. (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2, 10-3, 10-4, usando
pipetas estériles para cada dilución, tomando 1 ml. de la solución anterior en 9 ml. de
agua peptonada al 0.1% (o agua destilada estéril), evitando se forme espuma. Mezclar
manualmente cada dilución agitándola 25 veces en 7 segundos con movimientos
ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de 60º entre
brazo y antebrazo.

c) Técnica.

Colocar la placa petrifilm en una Con una pipeta perpendicular a Bajar el film superior; dejar que
superficie plana. Levantar el film la placa petrifilm colocar 1 ml de caiga. NO deslizarlo hacia
superior. muestra en el centro del film abajo.
interior.

Con la cara lisa hacia arriba, Con cuidado ejercer una presión Levantar el aplicador. Esperar
colocar el aplicador en el film sobre el aplicador para repartir un minuto a que solidifique el
superior sobre el inóculo. el inóculo sobre el área circular. gel.
NO girar ni deslizar el aplicador.

Incubar las placas petrifilm cara
arriba en pilas de hasta 20
placas, a 35 ± 2°C durante 48
± 2 hrs.
NOTAS:
 Para realizar el
contaje, se toman las placas
que presenten entre 30 y 300
colonias.
 Recordar
inocular y poner el aplicador
antes de pasar a la siguiente
Leer las placas en un contador placa.
de colonias estándar o una
fuente de luz con aumento.

 El cálculo del valor promedio del número de unidades formadoras de

colonias por gramo de muestra se efectúa multiplicando el número de colonias
contadas en cada dilución de las placas seleccionadas (valor C), por el factor de
dilución correspondiente (valor D).
 Obtener el valor del recuento total de gérmenes expresado de la siguiente
manera:

N= C x D
donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra.
C= Número de colonias.
D= Factor de dilución.

BIBLIOGRAFÍA

AMADOR, L. R. y otros. 1993. Manual de laboratorio de microbiología sanitaria. 2 da.

edición. Instituto Politécnico Nacional. México

FERNÁNDEZ, E. E. 1981. Microbiología sanitaria, agua y alimentos. Vol. I. Universidad

de Guadalajara. ANUIES-SEP. México

SSA. 1979. Técnicas generales para análisis microbiológico de alimentos. México.

http://www.ssa.gob.mx/nom/092ssa14.html

ANEXOS

Agua Peptonada para Dilución:

Peptona 1g
Agua destilada 1 lt

Disolver la peptona en un litro de agua destilada ajustando el pH a 6.8 ± 0.1 y

esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 a 20 minutos.