Aplicación y análisis de las tecnologías ómicas (Gpo 661)

Tarea 1
Vladimir Guillermo Thompson Ruiz – A00289636 | 11 Marzo 2022

1. PCR y diseño de primers

Gen: APC
Importancia:
Este gen codifica una proteína supresora de tumores que actúa como antagonista de la vía de
señalización Wnt. También participa en otros procesos, como la migración y adhesión celular, la
activación transcripcional y la apoptosis. Los defectos en este gen causan poliposis adenomatosa
familiar (FAP), una enfermedad premaligna autosómica dominante que generalmente progresa a
malignidad. Se ha encontrado que las mutaciones en el gen APC ocurren en la mayoría de los
cánceres colorrectales.

Forward Reverse
AGTTTGGAGAGAGAACGCGG GGAGATCTGCAAACCTCGCT

A:6 A:5
T:3 T:4
G: 9 G: 5
C: 2 C: 6
 *Tm = 62 *Tm = 62

*Tm = 4(G + C) + 2(A + T)

Referencias:

National Center for Biotechnology Information. (2022). APC regulator of WNT signaling

pathway [ Homo sapiens (human) ]. ncbi.nlm. Recuperado 10 de marzo de 2022, de

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/324

2. PCR en tiempo real (qPCR) - genes de referencia

El nivel de expresión de algunos genes suele ser tan pequeño que la qPCR se convierte en la única
técnica que puede detectar un número tan pequeño de copias de ARNm. Para evitar la influencia de
la extracción de ARNm entre muestras y el rendimiento de la transcripción inversa y la propia PCR,
se aplica un gen normalizador frente al cual se determinará el nivel de expresión.
El método popular para determinar los valores RIN/RQI (valor de integridad del ARN/valor de
calidad del ARN) tiene en cuenta tejidos de mamíferos en una proporción perfecta de 2 para el
ARN 28S/18S, y en el caso de las plantas, 25S RNA o incluso dos picos adicionales: 16S RNA y
23S RNA si se trata de un RNA total que contiene cloroplastos.
Otros genes de referencia utilizados comúnmente son: TUBA (α-tubulina), ACTB (β-actina), β2M
(β2-microglobulina), ALB (albúmina), RPL32 (proteína ribosómica L32), TBP (proteína de unión a
secuencia TATA), CYCC (ciclofilina C), EF1A (factor de elongación 1α), GAPDH (gliceraldehído-
3-fosfato deshidrogenasa), HPRT (hipoxantina fosforribosil transferasa), RPII (ARN polimerasa II),
etc.

Referencia:

Kozera, B., & Rapacz, M. (2013). Reference genes in real-time PCR. Journal of Applied

Genetics, 54(4), 391–406. https://doi.org/10.1007/s13353-013-0173-x

 3. Diferencias entre Taqman y SYBR Green

SYBR Green Taqman

Colorante de unión al ADN de doble cadena
(dsDNA).
Se une al ADN de doble cadena y se observa
un aumento de casi 1000 veces en la intensidad
de la fluorescencia, por lo tanto, depende de la
cantidad de dsDNA.
Menor costo y facilidad de uso, menor
especificidad
Uso de oligonucleótidos marcados con
fluorescencia
La señal se genera sólo cuando la sonda
específica del amplicón se hibrida con la
región complementaria.
Un fluoróforo denominado “quencher” está
unido a un reportero. El quencher absorbe la
señal del reportero durante la amplificación: la
actividad de la nucleasa 5' de la ADN
polimerasa descompone el oligonucleótido y el
indicador y el quencher se separan, lo que
permite que se libere la señal fluorescente del
indicador.
Mayor especificidad, mayor costo

Referencias:
Kozera, B., & Rapacz, M. (2013). Reference genes in real-time PCR. Journal of Applied Genetics,

54(4), 391–406. https://doi.org/10.1007/s13353-013-0173-x

Tajadini, M., Panjehpour, M., & Javanmard, S. (2014). Comparison of SYBR Green and

TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of

four adenosine receptor subtypes. Advanced Biomedical Research, 3(1), 85.

https://doi.org/10.4103/2277-9175.127998
 Tarea 2

1. Transposones

Los transposones son también conocidos como "genes saltadores" y corresponden a secuencias de
ADN que se mueven de un lugar del genoma a otro. Se clasifican principalmente en dos grupos: los
retrotransposones o clase 1, que requieren transcripción inversa (es decir, la transcripción de ARN
en ADN) para transponerse; mientras que los últimos se conocen como transposones de ADN o
clase 2 y no requieren transcripción reversa para moverse.

Otra clasificación es la de transposones autónomos y no autónomos. Tanto los transposones de clase

1 como de clase 2 pueden ser autónomos o no autónomos. Los autónomos pueden moverse por sí
mismos, mientras que los elementos no autónomos requieren la presencia de otros para moverse
porque carecen del gen de la transposasa (con función de escisión e inserción) o transcriptasa
inversa que se necesita para su transposición.

Los de clase 2 se caracterizan por la presencia de repeticiones terminales invertidas, de

aproximadamente 9 a 40 pares de bases de largo, en ambos extremos; las terminales son
complementos invertidos entre sí (Figura 1).

Figura 1. Los transposones de clase 2 están flanqueados en ambos extremos por repeticiones invertidas que
son complementos entre sí (la repetición en un extremo es una imagen especular y está compuesta por
nucleótidos complementarios a la repetición en el extremo opuesto).

Aproximadamente la mitad del genoma humano esté compuesto por los retrotransposones L1 y Alu.
Mucho de lo que hace un transposón depende de dónde aterriza. Aterrizar dentro de un gen puede
resultar en una mutación, como se descubrió cuando las inserciones de L1 en el gen del factor VIII
causaron hemofilia. Años más tarde, los investigadores encontraron L1 en los genes APC en células
de cáncer de colon, pero no en los genes APC en células sanas en los mismos individuos. En
contraste, los transposones pueden impulsar la evolución de los genomas al facilitar la translocación
de secuencias genómicas, la mezcla de exones y la reparación de rupturas de doble cadena. Las
inserciones y transposiciones también pueden alterar fenotipos y regiones reguladoras de genes
Algunos transposones están inactivos porque tienen mutaciones que afectan su capacidad para
moverse; otros están perfectamente intactos y son capaces de moverse, pero se mantienen inactivos
por mecanismos de defensa epigenéticos como la metilación del ADN, la remodelación de la
cromatina y los miARN.
Referencia:

Pray, L. (2008). Transposons: The jumping genes. Nature Education. Recuperado 10 de

marzo de 2022, de https://www.nature.com/scitable/topicpage/transposons-the-

jumping-genes-518/?error=cookies_not_supported&code=0ba9ae4b-6628-42a9-

9e13-b6c120116f69

2. Secuenciación de genomas completos o fragmentos

Completos Fragmentos
 Estudio y caracterización de un  Estudio de genomas pequeños (virus y
organismo. algunas bacterias).
 Establecer correspondencias entre las  Identificación de variantes y/o
secuencias genómicas observadas y los mutaciones específicas.
caracteres fenotípicos.
 Identificar variantes que podrían
pasarse por alto con enfoques
específicos.
 Estudios de expresión génica y los
mecanismos de regulación.
 Respaldar el ensamblaje de nuevos
genomas.

Referencias:

Illumina, Inc. (2022). Whole-Genome Sequencing (WGS). Illumina.Com. Recuperado 10 de

marzo de 2022, de https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-

sequencing/whole-genome-sequencing.html

Houldcroft, C. J., Beale, M. A., & Breuer, J. (2017). Clinical and biological insights from

viral genome sequencing. Nature Reviews Microbiology, 15(3), 183–192.

https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.182
 3. Secuenciación: Profundidad y Cobertura
El término "cobertura" describe una relación entre lecturas de secuencias y una referencia (por
ejemplo, un genoma completo o un locus), a diferencia de la profundidad de secuenciación que
describe un número total de lecturas.

Cobertura
 Secuenciación completa de genomas
 Mapeo dentro de un genoma objetivo.
Profundidad
 Mejorar la estadística de un ensayo
 Estudiar regiones difíciles de
secuenciar o genomas poliploides
 Identificación de SNP´s

Referencias:

Illumina, Inc. (2022). Sequencing Coverage for NGS Experiments. Illumina.Com. Recuperado 11

de marzo de 2022, de https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-

sequencing/plan-experiments/coverage.html

Bioinformatics, E. (2019). How to calculate the coverage for a NGS experiment. Ecseq.Com.

Recuperado 11 de marzo de 2022, de https://www.ecseq.com/support/ngs/how-to-calculate-

the-coverage-for-a-sequencing-experiment

Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. et al. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic
analyses. Nat Rev Genet 15, 121–132 (2014). https://doi.org/10.1038/nrg3642