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SEMANA 10 - PRÁCTICA DE GENÉTICA

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE PRUEBAS MOLECULARES DE


AYUDA AL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS: REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA PUNTO FINAL (PCR)- SÍNDROME DE MARFAN

Se presenta 2 niños de 10 (niño N°1) y 8 (niño N°2) años respectivamente, con


clínica típica de S. Marfan, el médico entre otros estudios de laboratorio pide
un estudio diferencial de PCR punto final para el gen de la fibrilina 1 (FBN1),
obteniéndose los siguientes resultados.

1. ¿Cuál es el papel del gen FBN1 en el S. de Marfan y cómo es su expresión


normal?

El gen FBN1 que se encuentra localizado en el cromosoma 15q21.1, se encarga de


codificar la Fibrilina tipo 1, su expresión normal genera la producción de fibrilina, qué es el
componente importante de los tejidos conectivos elásticos y también los no elásticos, y es
la principal proteína de un grupo de microfibrillas del tejido conectivo que son esenciales
para para una normal fibrilogénesis. 1

Podemos decir que el papel del gen FBN1 será la síntesis de fibrilina tipo 1 y su expresión
normal producirá fibrilina que será el componente esencial para las fibras elásticas.
2. ¿Qué es PCR punto final o convencional?

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) convencional o en punto final, se encarga de


medir la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos (20 a 35
cambios repetidos de temperatura).

La técnica de PCR detecta un fragmento de ADN (ácido desoxirribonucleico) de un


patógeno (virus, bacteria, hongo, etc.) o mutaciones genéticas que se encuentran en una
muestra clínica (sangre, esputo, biopsia, suero, etc.).

Esta técnica multiplica exponencialmente y amplifica la región de interés del ADN


mediante el uso enzimas, cebadores, nucleótidos específicos para cada patógeno o
mutación, y un termociclador; el cual realiza cambios de temperatura sobre el ADN para
que se duplique a un número grande y sea detectado por un software donde el resultado
es de manera objetiva. 2

En síntesis, se puede decir que la PCR es una reacción tipo enzimática que es mediada por
el ADN polimerasa in vitro; la cual ayudará a la amplificación, multiplicación o replicación
de millones de veces de una secuencia específica de ADN (fragmento de ADN) durante
varios ciclos repetidos, generando copias idénticas o fieles. Esto se llevará a cabo gracias a
un equipo conocido como termociclador, el cual interviene en el ambiente y tiempo de los
ciclos repetidos; dando como resultado de esta replicación y amplificación del ADN a los
amplicones, los cuales se llevan a gel de agarosa para que sean posteriormente analizados
y detectar alguna mutación o enfermedad.

3. ¿Qué pasos se siguen para hacer un PCR punto final?

Desnaturalización (96°c): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las


cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.

Templado (65°c): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

Extensión (72°c): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa


extiende los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.3

Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 – 4
horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente , puede
producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco.

En resumen los pasos más importantes son la desnaturalización , donde se separan las
cadenas de ADN ,el templado ,donde los cebadores se unen a sus secuencias
complementarias y finalmente la extensión donde la Taq polimerasa sintetiza nuevas
cadenas de ADN.
4. ¿Qué es la electroforesis en gel?

Consiste en la separación de ácidos nucleicos o proteínas según su tamaño, naturaleza y


movilidad en un campo eléctrico sobre una matriz porosa que contiene moléculas del
interés a analizar, permitiendo de esta manera poder observar cuantos fragmentos de
ADN están presentes en una muestra, para la separación de ácidos nucleicos se utiliza el
polisacárido agarosa constituido por una matriz de fibras poliméricas que se mantienen
unidas por los puentes de hidrógeno y para la separación de proteínas se utiliza
poliacrilamida útiles para la separación de moléculas tamaño-carga.4

En conclusión la electroforesis en gel es una técnica que permite determinar las proteínas
contenidas en el ADN ayudando de esa manera a poder obtener resultados fiables en el
caso de mutaciones genéticas observando fragmentos de ADN más cortos o más largos de
lo habitual o también para determinar si una persona participó en un delito, su posición
dependerá de su tamaño mientras más pequeñas sean estarán en la parte inferior del gel
por el contrario si estás son grandes se encontrarán en la parte superior.
5. ¿Cómo es el proceso de migración del ADN a través del gel?

Cuando el gel está en la cámara, con cada una de las muestras del ADN que queremos
analizar(ya sea cada reacción de PCR o cada plásmido digerido con enzimas de restricción)
se transfiere a uno de los pozos. Un pozo se reserva para el marcador de peso molecular,
un estándar de referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Los
marcadores comerciales cubren diferentes intervalos de tamaños. Después, se aplica
energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir corriente a través del gel. Los grupos fosfato
de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una carga negativa a las moléculas de ADN,
por lo que empiezan a moverse a través de la matriz de gel hacia el polo positivo. Cuando
el sistema está encendido y pasa corriente por el gel, se dice que está corriendo. Conforme
corra, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los poros de la
matriz del gel que los fragmentos más grandes. Luego de un tiempo que ha corrido el gel,
los fragmentos más cortos estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más largos
se mantendrán cerca de los pozos. 5

Con los fragmentos del ADN de los grupos fosfato les otorga la carga negativa y se
desplazan a través de la matriz del gel hacia el polo positivo, los fragmentos cortos del
ADN son más rápido a través de los poros a diferencia de los más grandes y si se separan
por su tamaño.

6. Según los resultados del PCR punto final ¿Cuál es su interpretación?

Haciendo un análisis del PCR del niño 1 y el niño 2 concluimos que los dos presentan
mutaciones.

Ya que en las ampliaciones mostraron que en el niño 1 hay 80000 pares de bases y el niño 2
hay 200000 pares de bases que no tienen el peso normal de un Gen FBN1.

En conclusión, en los dos niños una mutación corto la secuencia de nucleótidos o en el pcr
está al final de su ciclo.6
7. Explique genéticamente la razón por la cual el niño N° 1 obtiene 80 x 103 pb
y el niño N° 2 obtiene 200 x 103 pb; en el corrido electroforético del PCR punto
final para el gen FBN1.
La razón por la cual el niño Nº 1 obtiene en el PCR 80 x 103pb es debido que presenta una
mutación que podría ser una mutación sin sentido o una mutación por corrimiento de
lectura, originada por una inserción/delección, las cuales generan un codón de terminación
prematuro. Sobre los resultados del niño Nº 2 se podría decir que su mutación es una
mutación con sentido que crea o sustituye residuos de cisteína o también podría tratarse de
una mutación en el corte y empalme (splicing) de la secuencia de referencia, tiene un
mecanismo que forma parte de la maduración del ARN que consiste en la eliminación de
intrones de forma que se obtiene una secuencia codificante, estas mutaciones pueden
traducir sin interrupciones una proteína. Estas mutaciones se tomaron en cuenta debido a
que ni existe una mutación previamente descrita y estos tipos de mutaciones tienen una
alta probabilidad de ser patogénicas, por tanto nos ayudan a establecer la patogenicidad de
una mutación relacionada con el síndrome de Marfan. 6

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Muñoz J. Saldarriaga W. Isaza C. "Síndrome de Marfan, mutaciones nuevas y


modificadoras del gen FBN1". IATREIA. [En línea] 2014.[consultado el 5 de Julio del
2020] vol. 27.pp. 206-215 disponible en:
https://www.redalyc.org/pdf/1805/180531198008.pdf
2. Yuen Lab: Laboratorio clínico y biología molecular. Técnica de PCR. [internet] Perú;
2020. [consultado el 5 de Julio del 2020]. Disponible en: http://yuenlab.com/pcr-2/
2. Bonifaz A. Micología Médica Básica(III).3a edición, México D.F: McGraw-Hill
Interamericana; 2010.
3. Montalvo C., Lugo M. Electroforesis: Fundamentos, avances y aplicaciones.
Epistemus. 2016 Nov: 48- 54.
4. Kratz R., Siegfried D. Using gel electrophoresis to separate molecules (La
electroforesis en gel sirve para separar moléculas). Biology for dummies. 2° Edición.
Hoboken.2010
5. Tamay de Dios L, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la
polimerasa(PCR)y PC en tiempo real.[Internet] Mexico;2013.[consultado el 5 de Julio
del 2020].Disponible en:
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
6. Barriales-Villa R., García-Giustiniani D., Monserrat Lorenzo. Genética del síndrome de
Marfan. Elsevier/cardiocore (en línea). 2011; nº 46. (Citado: 2020 Julio 05); (3): 101-
104 (4 p.p.). Disponible en:
https://www.elsevier.es/es-revista-cardiocore-298-articulo-genetica-del-sindrome-m
arfan-S1889898X11000727

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