Cromatografía Líquida de

Alta Eficiencia

Andrea Nettle B.
La cromatografía es la ciencia y el arte de separar entre sí
los compuestos de una sustancia

XIC of +MRM (34 pairs): 253.2/171.2 amu from Sample 14 (1ng/ml QqQ in soil) of c... Max. 6620.0 cps.

6.9
6500

6000

5500

5000

4500

4000
I n t e n s it y , c p s

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
 ¿Qué es un HPLC?

High Performance Liquid Chromatography

Ø Es una técnica de separación en la cual la muestra se disuelve

en un líquido y se hace pasar a través de una columna rellena
con partículas de tamaño muy pequeño. El proceso permite la
separación de la muestra en sus diferentes componentes.
Ø Es la más importante y utilizada para en el análisis de
compuestos orgánicos y biomoléculas.
Ø Amplia gama de aplicaciones
– Muy utilizada en la industria farmacéutica, cosmética,
alimenticia y bioquímica.
 Historia

• La Cromatografía fue descubierta por el botánico ruso

Mikhail Tswett quien separó pigmentos de plantas en
columnas de silica gel en 1903.
• Desde la década de los 40, se utilizaron columnas de sílica
para purificar materiales orgánicos, con elusión por
gravedad.

CL Clásica
(Flujo por Gravedad)
 Principios

 Para analizar un compuesto debemos preocuparnos de

eliminar por un proceso de extracción los compuestos que
provoquen interferencias en el análisis.

Luego hay que analizar los componentes para hacer una

identificación de estos, utilizando bibliotecas si se dispone de
ellas o contra un estándar.

Saber la concentración de dichos componentes.

Para que exista cromatografía debe haber: Analitos, fase

estacionaria y fase móvil (Líquido).
 Componentes de la Cromatografía
xoxo
xoxo

Muestra: Motivo a elucidar o analizar. Fase

Móvil

Fase móvil : Es aquella que fluye

a través de la columna, transportando la
muestra con los analitos (Líquido) . Fase
Estacionari
a
Fase estacionaria: Es aquella que
compone un medio de separación,
que interactúa en forma selectiva
con el analito.
 Interacciones en la Fase estacionaria
Los componentes son colocados Fase móvil
al inicio del sistema de separación
(inyector). oxoxo
xoxox

A medida que éstos son arrastrados

Fase móvil
por la fase móvil (líquido), se comienzan a
oooxxx
distribuir, separándose por diferencias oooxxx
de afinidad con la fase estacionaria.

Finalmente los componentes salen

Fase móvil
separados para posteriormente ser ooo xxx
ooo xxx
detectados.
 La Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC) es un
perfeccionamiento de la cromatografía en fase líquida (LC),
en la cuál la fase móvil se utiliza a alta presión.
 La fase móvil es en forma líquida.
• Diferentes tipos de cromatografía Líquida:

• Cromatografía líquida-sólida , de fase normal o Cromatografía

de Adsorción ( LCS).
• Cromatografía líquida-líquida ,de fase reversa (RPC)
• Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
• La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC o GPC)
 • Cromatografía líquida-sólida , de fase normal o
Cromatografía de Adsorción ( LCS)

 La fase estacionaria es sólida , polar , (gel

Flujo
de sílice),que retiene a los solutos por
efecto de adsorción física y química.
 La fase móvil es no polar (pentano,
acetato de etilo, éter, diclorometano,
metanol, etc.).
 ADSORCION
Fenómeno de acumulación de partículas sobre una superficie.
La sustancia que se adsorbe es el adsorbato y el material sobre
el cual lo hace es el adsorbente. El proceso inverso de la
adsorción es la desorción.

Características:

1.Es altamente selectiva.

2.Es un proceso rápido.

3.Proceso exotérmico.
• Cromatografía líquida-líquida ,de fase reversa (RPC)
Mas ampliamente utilizada.
La fase móvil es de alta polaridad. (agua, no polar

metanol, acetonitrilo)

Flujo
Los analitos polares eluyen primero, mientras
los no polares son más retenidos por la fase
estacionaria.
polar
Al grupo Silanol del soporte sólido se le une
mediante enlaces químicos estables una fase
orgánica polar (o de polaridad variable) (ej: C18,
C8)grupos que están en posición perpendicular
a la superficie, generando una estructura de
cepillo o brocha.
Cuanto mayor es el número de átomos de C,
mayor es la eficacia.
En columna no polar (C18) se utiliza una fase acuosa polar, y
separo los analitos polares.
 Señales cromatográficas

1. Uracil
2. Phenol
3. Acetophenone
Methyl 4. Nitrobenzene
5. Methyl benzoate
Octyl (C8) 6. Toluene

Octadecil (C18)

minutos minutos minutos

Efecto en el largo de la cadena de carbonos en columna fase reversa con partículas de 5µ. Con fase móvil
de 50/50 MeOH /Agua, a un flujo de 1 ml/min
• Cromatografía de intercambio iónico (IEC)

Las partículas cargadas negativamente se unen a la matriz

cargada positivamente, y son detenidas.

Las partículas cargadas positivamente son rechazadas por la

matriz sólida cargada positivamente y son eluídas.

La elución de las partículas cargadas negativamente se

consigue cambiando el pH del solvente hasta igualarlo a su
punto isoeléctrico o hasta invertir su carga neta.
• La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC o GPC)
 Esta cromatografía se denomina también cromatografía
de permeación sobre gel (GPC)
 Separación basada en la acción de un colador de
poliestireno con tamaño de poro controlado
 La fase móvil es un disolvente orgánico (en general
tetrahidrofurano o tolueno).
 La fase estacionaria es un sólido poroso.Las moléculas
grandes eluyen primero, mientras las moléculas pequeñas
penetran dentro de los poros y eluyen despuès.
 Ampliamente utilizada en la determinación de Pesos
Moleculares de polímeros, biomoléculas y en
procedimientos de limpieza.
• Factores importantes a considerar en la cromatografía:
 pH
 Cañerías
 Temperatura
 Presión
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
EFECTO pH 4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

A valores de pH 1,25 y 3,0 el sulfisoxazol es inestable y no eluye

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

A valores de pH entre 5,0 y 7,0 se produce un cambio en el orden de elución

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
 1. Acido Sulfanílico
2. Sulfamerazina
3. Sulfisoxazole
4. Sulfapiridixina

Fig. cortecia de Phenomenex

La separación es excelente a valores de pH de 9,0, siendo peor cuando el pH es 10

Columna Phenomenex Luna 5µm C18, 150mm X 4,6mm, fase móvil 20 mM KH2PO4: Acetonitrilo 95:5
con el pH indicado, velocidad de flujo 1,0 ml/min
EFECTO DE CAÑERIA

• Las cañerías deben tener igual diámetro

durante el proceso, a excepción en la salida
que debe ser mayor.
• Evitar espacio entre los tornillos “Espacio
muerto” que afecta la cromatografía.
• Las columnas requieren tiempo para equilibrarse
• Se busca aumentar la sensibilidad
• Optimizando el flujo se observan variaciones
 Efecto temperatura

• La viscosidad del disolvente disminuye (fluye más fácilmente)

• Velocidades de difusión del soluto aumentan, originando
difusión más rápida en todas direcciones
• El equilibrio entre los diversos solutos y la fase estacionaria se
desplaza en proporciones diferentes.
 Efecto de la Temperatura

20ºC 30ºC 20ºC 30ºC 20ºC 30ºC

Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3

 EFECTO PRESIÓN
•Se requiere mayor Presión para conservar la misma velocidad
de flujo que en una columna de mayor tamaño de partícula.

•El tamaño de la columna se reduce, acortando el tiempo de

Análisis.

•Si se reduce el diámetro se reducirá la cantidad de disolvente

utilizado

1943 psi
Al disminuir la longitud de la
columna disminuye la presión del
sistema.
4567 psi
 FASE MÓVIL
• Es el medio que permite conducir los analitos a través
de la columna, interactuando con ellos en el proceso de
separación cromatográfica.

• Son usualmente una mezcla de uno o más solventes

con las siguientes características :
•Fìsicas:
Alta pureza, bajo costo, no corrosivo, baja viscosidad, baja
toxicidad, no inflamable, solubilidad de la muestra.

•Resistencia:
Está relacionada con la polaridad del solvente; agua es un
solvente fuerte en una fase normal pero débil en una fase
reversa

•Selectividad:
Depende del momento dipolar, dipolo inducido, enlaces de
hidrógeno y características dispersivas del solvente.
 Elución isocrática: composición constante de la fase móvil
Elución por gradiente: los distintos analitos son eluídos con
incremento de la composición de la fase móvil.
 Componentes de un HPLC, generalidades
Componentes fundamentales de un cromatógrafo líquido
Reservorios para
Inyector Fases Moviles

Precolumna

Bomba HPLC

Columna Analítica

Sistema de Manejo
Detector
de Datos
Filtro en linea
SISTEMA DE INYECCIÓN MANUAL

Se llama inyección manual cuando utilizamos cualquiera de las

clásicas válvulas para HPLC. Estas tienen un Loop de volumen fijo e
intercambiable. El Loop se debe utilizar en su completa capacidad y
debe ser llenado por medio de una jeringa apropiada (Sin punta y de
diámetro controlado).
Inyectores Automáticos: Automuestreador
Este mecanismo permite automatizar la inyección. Normalmente
aceptan variados volúmenes de muestra, ya que cuentan con Loop
de alta capacidad (hasta 2000 ul). En estos instrumentos la
muestra se deposita en un vial especial y el sistema toma de
manera autónoma el volumen seleccionado previamente.

Volumen de inyección: 0.1-2000 µl

Requerimientos para Bombas HPLC:
• Alta precisión (<1%)
– Velocidades de flujo entre 0.05 mL - 5 mL/min para columnas
analíticas , 0.01 - 0.2 mL/min para nano y hasta 10 mL/min
para columnas semi-preparativas
– Que permita alta presiones de operación (hasta 5000 psi y
más)
• Compatible con la mayoría de los eluyentes
– Solventes orgánicos, buffers y sales
– Construida con materiales inertes como acero inoxidable,,
teflon, titanio, rubí, safiro etc.
• Confiable operación con larga vida útil de los sellos
– Fácil mantenimiento y servicio

• Para bombas que permitan gradiente

– Las bombas para 2 o 4 solventes deben tener buena
exactitud en la composición y precisión en la
programación de gradientes
 DETECTORES PARA HPLC

• Un detector de HPLC es un equipo con una pequeña celda de

flujo conectado a la salida de la columna que monitorea la
concentración del analito, generalmente tiene una capacidad de
5-10ul.

• Detectores más comunes

-UV detector de absorbancia
-Fluorescencia
-Índice de refracción
-Espectrometría de masas
-Otros detectores como electroquímico, conductividad, infrarojo,
etc.
OTROS DETECTORES:

DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MS/MS

• SELECTIVIDAD
• ESPECIFICIDAD

Técnica confirmatoria que se basa en ver moléculas cargadas

+ ò – observando carga-masa.
No permite ver moléculas neutras

Determinaciones analíticas en: drogas ilícitas, drogas

terapéuticas, explosivos, venenos, investigación de nuevos
fármacos, etc.
 Tipos de Columnas

Micro HPLC. 0,1 ml a 5 ml de flujo, max. presión 5800 psi columna

3µm x 50mm x 2,1mm

Nano HPLC: 20 nl a 1 ul de flujo, max. presión 5800 psi columna,

3,5µm x 30mm x 75µm.

UPLC: 0,1 ml a 5ml de flujo, max. presión de 15.000 PSI , columna

1,7µm x 5µm x 1mm
 Factores a considerar para la elección de la
mejor columna

Factores importantes:

 Costo.
 Aplicación.
 Asegurar la afinidad polar y la compatibilidad de la columna
con todas las series de analitos a trabajar.
Debido a que muchas veces existen grandes diferencias de
polaridad y afinidad en los componentes de una muestra
compleja, no existe la columna perfecta.
 Se debe escoger una que permita la mejor elución al máximo
de analitos, considerando los rangos extremos de temperatura,
presión y resistencia a los solventes.
 Grupos de enlaces comunes
Fase reversa

C18 Octadecyl
Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2-CH2- CH2- CH2- CH2- CH2-
CH2- CH2- CH2- CH3

C8 Octyl Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
C4 Butyl Si- CH2- CH2- CH2- CH3

Fase Normal
Si Silica S i - OH
CN Cyanopropyl Si- CH2- CH2- CH2- CN

Intercambio Iónico

SP Sulfo propyl Si - CH2- CH2- CH2- SO3-

CM Carboxymethyl Si-CH2-CO2-

DEAE Diethylaminoethyl Si - CH2-CH2-NH+ (C2H5)2

 Guía para seleccionar la fase de separación
• C18
– La fase mas común, presenta buena retención y estabilidad
– La fase C18 dependiendo del fabricante puede tener
diferente retención y desempeño.
• C8
– Es preferida por tener mejor compatibilidad con fases
móviles con alto contenido acuoso
• C4
– A menudo es usada para separación de proteínas (C18 para
Péptidos)
• CN
– En ambos modos NP o RP; es usada en variadas aplicaciones
(e.g., antidepresivos)

Column Selection Guides, PE Brownlee HPLC Column Catalog, Perkin-Elmer, L-1928, Norwalk, CT, p.27
• Phenyl
– Para separaciones en RP aplicada a componentes de
polaridad media; selectiva para aromáticos
• Amino
– Es usada en reemplazo para el modo NP ; análisis de
azucares.
CONCEPTOS:

• Cromatograma:
Grafico en función tiempo versus respuesta
• Pico cromatografico o peak:
Es la figura geométrica que se forma en la gráfica, cuando es
detectado algún compuesto.
Idealmente tiene forma de curva gaussiana, debido a los
procesos de difusión que se producen dentro de la columna.
• Tiempo de retenciòn(Tr): Es el tiempo que demora un
componente pasar por la columna, desde que es inyectado hasta
que es detectado.
Depende de La naturaleza química del analito , la columna, la
fase móvil y la temperatura
 Análisis Cualitativo

El análisis cualitativo por cromatografía es bastante simple ,

una vez que los componentes son separados , es fijado el flujo,
composición de la fase móvil y la temperatura de trabajo.
Entonces, para estas condiciones, el tiempo de retención se
hace característico al compuesto. Por lo tanto solo es
necesario reproducir estas condiciones para dar un resultado
cualitativo al análisis.
 Análisis Cuantitativo

Existen diferentes tipos de cálculos , pero el principio básico

es que el área bajo la curva del peak es directamente
proporcional a la concentración del compuesto en la muestra.

Por ser esta una medida relativa, se debe tener en cuenta que
este análisis es válido en las condiciones establecidas para una
cromatografía en particular y empleando un estándar
apropiado en cuanto a concentración e integridad.
Factores asociados a la Eficiencia Operacional

Mínimo tiempo de análisis:

– Dependiente del tipo de Columnas
– Dependiente del largo de Columna
– Dependiente del diámetro y tamaño de partícula

Mínimo instrumental:
•Acondicionamiento y estabilización
•Mantención y limpieza del instrumento
 Factores asociados a Eficiencia, Resolución y vida útil de
las columnas
• La vida útil típica esta entre 3 - 12 meses o 100 - 1,000 inyecciones (Según estudios
realizados desde 1994)

• La vida útil de una columna esta determinada por:

– Materiales de elaboración, estabilidad de la fase de relleno, procedimiento de
empacado y calidad de los reactivos utilizados entre otros.

• Las causas mas comunes para que una columna sea dada de baja son:
– Tapones
– División de picos
– Pérdida de eficiencia y retención

• La vida útil de una columna es maximizada cuando:

– Se le da un buen cuidado y mantención
– Se realiza regeneración
– Al usarla juiciosamente y con pre-columnas (Guarda Columnas)
 Conclusiones de la teoría cromatográfica

La Cromatografía es una técnica de la química analítica que

nos permite a través del uso de estándares, identificar y
cuantificar mezclas de iones y moléculas, que cumplan con las
condiciones básicas que permita el análisis por esta técnica.

Aunque la teoría de la cromatografía es muy clara, la práctica

en esta técnica, es esencial para poder lograr la confianza en
los datos entregados por el instrumento.
 MANTENIMIENTO:
Revisión rutinaria en cromatografía Líquida
EL ANALISTA DEBE CONTROLAR :
1- Solventes y fases pre-mezcladas
2- Funcionamiento normal de ventiladores y filtros
3- Estado de filtros en línea y filtro de reservorio

4- Mantención de Bomba y filtraciones

5- Condición de suciedad en el cromatógrafo
(incluye estado de columna y Fuente de inyección

6- Condición de accesorios, jeringas e inyector

 Mantenimiento del cromatografo
Limpieza de columna
Frecuencia: Luego de cada set de muestras.

Cambio de sellos en válvula de inyección

Frecuencia: Según número de inyecciones.

Limpieza filtros para fases móviles

frecuencia: Según número y carga de las inyecciones
(Semanal).

Cambio de sellos en bomba

Frecuencia: Según tiempo de trabajo.
 Tipos de metodologías de análisis.
- Análisis Cuantitativo por Estandarización
• Se llama análisis por Estándar interno
• Se llama análisis por Estándar
externo cuando antes de ingresar la
muestra, se inyecta los componentes
a analizar en diferente
concentraciones conocidas
( estándares ), los que
posteriormente permitirán evaluar
por comparación directa los
componentes buscados en la
muestra, ya sea por AREA o ALTURA.
Esto lo denominamos hacer curvas
de calibración.
(IST),cuando ase agrega a los
estándares y muestras una
concentración conocida de un
componente que no esta presente en
ninguna de las anteriores, esto con el
fin de minimizar con certeza la variación
en la respuesta, producto de las
diferencias de inyección, extracción y
degradación entre otros. Esto se realiza
por medio de la relativización de las
áreas estándares frente a las del
Estándar Interno, Construyendo curvas
de calibración en donde el eje de la “X”
grafica “Concentración del ST” y el eje
“Y”, “Área de St / Área IST”
 Al comenzar a trabajar…
Ø Filtrar los solventes

Ø Desgasificar los solventes (sin

desgasificación en línea)

Ø Purgar la bomba

Ø Acondicionar el sistema

Jeringa
de purga
Puerta
de acceso
 Filtrado y desgasificado de los solventes
• Filtrado
– Filtrar todos los solventes orgánicos o solventes acuosos a través
de membranas de 0.5- μm (nylon, teflon, celulosa acetato).
– Todas las bombas para HPLC deben tener un filtro en línea de
mínimo 1.0 μm (normalmente se usa 0.5 μ m ).
• Desgasificado
– Desgasificar la fase móvil es importante para la exactitud del
mezclado de solventes de la bomba y para evitar la formación
de burbujas en la celda de flujo del detector.
– Las mejores maneras de desgasificar son burbujeando Helio en
los reservorios o utilizando un sistema de desgasificación en
línea.
MUCHAS GRACIAS.