Facultad de Ciencias de La Salud

Carrera de Tecnología Médica

CROMATOGRAFÍA
CÁTEDRA:
Taller XII
CATEDRÁTICO:
Kattian Gavino Fernandes
ESTUDIANTES:
Ore Villalba Antonella
Cabezas Aylas Leydi
HISTORIA DE LA
CROMATOGRAFÍA
El botánico ruso Michael Isweet, (1872-1919) en 1906 empleó
por primera vez el término cromatografía.

A comienzos de año 1903 uso columnas de adsorción de

líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo
clorofilas)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a

desarrollarse en los años 1960,aumentando su importancia en
las décadas siguientes ,hasta convertirse en la técnica
cromatográfica más empleada .
 QUE ES LA CROMATOGRAFIA
La cromatografía es un método físico de separación para la
caracterización de mezclas , la cual tiene aplicación en todas las ramas
de la ciencia .Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de
retención selectiva , cuyo objetivo es separar los distintos componentes
de una mezcla ,permitiendo identificar y determinar las cantidades de
dichos componentes .
La cromatografía cumple dos funciones básicas que se complementan :

Separar los componentes de la mezcla ,para obtenerlos más puros y

usarlos posteriormente .

Medir la proporción de los componentes de la mezclas

Separacion de componentes

Dejamos que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan porque se
mueve a diferentes velocidades , debido a las diferentes fuerzas de adsorción que ejerce el
soporte sobre cada elemento , así de fácil .

No confundir el término adsorción y absorción .

 Clasificación de las técnicas cromatográficas

De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:

Cromatografía plana
Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en
capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido.
 Disposiciones experimentales para
Cromatografía ascendente en capa realizar una cromatografía en papel
fina descendente (izqda.) y ascendente
(dcha.).
Cromatografía ascendente en capa fina:
colocación de una muestra (con 3
componentes), desarrollo de la
cromatografía y revelado del
cromatograma.

Rf es el factor de retardo o retraso, que

mide la movilidad relativa de cada
componente con respecto al máximo
posible, la distancia recorrida por el
frente de fase móvil.
Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va
produciendo la separación de los componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se
deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y
medida de su avance
 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud.

F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.

F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso más) de longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la columna.

Funcionamiento de una columna,

mostrando la carga de la muestra y
diversos momentos a lo largo de la elución:

1. Muestra depositada sobre el lecho

cromatográfico
2. La muestra penetra en el lecho
3. Se añade fase móvil
4. Comienza la separación de los
componentes de la muestra
5. Eluye el primer componente
6. Eluye el segundo componente
 De acuerdo con el estado físico de las fases
Cromatografía líquida
Cromatografía de gases
Con fase móvil líquida.
Con fase móvil gaseosa.
● Cromatografía líquido-líquido
● Cromatografía gas-líquido ● Cromatografía líquido-sólido
● Cromatografía gas-sólido

HPLC

Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia

(cuando se emplean partículas de fase estacionaria muy
pequeñas y una presión de entrada relativamente alta).

[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High

Performance Liquid Chromatography]
 fase móvil

líquida gaseosa

“cromatografía “cromatografía
líquida” de gases”

Cromatografía Cromatografía
sólida
líquido-sólido gas-sólido
fase
estacionaria
Cromatografía Cromatografía
líquida
líquido-líquido gas-líquido
De acuerdo con el mecanismo de separación
Cromatografía de adsorción
(atención: es adsorción, no absorción)
Diferente afinidad de adsorción de los
componentes de la muestra sobre la
superficie de un sólido activo. La adsorción
es la capacidad de las superficies para fijar
moléculas.
La F.E. es siempre sólida. Ejemplos:
alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato
cálcico, hidroxiapatito.
Cromatografía de reparto
Diferente solubilidad de los componentes de
la muestra en la fase estacionaria (caso de la
cromatografía de gases), o diferentes
solubilidades de los componentes en las
fases móvil y estacionaria (caso de la
cromatografía líquida).
Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es
el agua o disolvente asociados a la celulosa
(papel) o al soporte sólido que forma la capa
fina; en columna, como F.E. se usan tierra de
diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo.
Cromatografía de intercambio iónico
Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa intercambio de
iones? La F.E. Posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga
opuesta.

● Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la
muestra (de ahí la palabra intercambio).
● Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la
muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores intercambiadores La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

catiónicos aniónicos
carboxilato dietilaminoetilo (DE Puede verse una animación de una cromatografía de
sulfonato AE) intercambio aniónico.
fosforilo dietil-(2-hidroxiprop
carboximetilo (CM) il)aminoetilo Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos
sulfopropilo (SP) polietilenimina
ionizables, de modo que
su carga eléctrica neta depende del pH del medio en el q
ue se encuentran
(es decir, la F.M.).
Cromatografía de exclusión
También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las
moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es aprovechar las diferencias de forma y
tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación
en gel o de tamiz molecular.

Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros de las partículas que forman el gel (fase estacionaria,
relleno de la columna), por lo que tienen mayor recorrido y se retarda su avance por la columna. Las moléculas de
tamaño superior al de los poros sólo circulan por el exterior de las partículas (se dice que son excluidas), por lo que
avanzan más rápido y eluyen antes.

Esquema de la separación de moléculas de

distinto tamaño durante una cromatografía de
exclusión.
◯ partículas de gel
Moléculas en la muestra:
⬤ de tamaño menor que los poros del gel
⬤ de tamaño mayor que los poros del gel
 Cromatografía de afinidad
Variedad particular de cromatografía en la que la separación se basa en la especificidad biológica
singular de interacción entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los
ejemplos más comunes son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-
receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente
el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo,
antígeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas (proteínas con afinidad por
oligosacáridos)...

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de afinidad.

 Algunas técnicas especiales

Cromatografías de fase Análisis isocrático

normal y de fase invertida
La composición de la fase móvil
Fase normal: cuando la F.E. es más permanece constante a lo largo
polar que la F.M. del proceso de elución.
Fase invertida: cuando es más polar la
F.M.
Elución con gradiente
La composición de la fase móvil se
cambia, de forma continua o en
etapas, a lo largo del proceso de
elución (respectivamente,
gradiente continuo y gradiente
escalonado o en etapas).
Cromatografía bidimensional
Una vez separados los componentes de la
muestra, parte de ellos o todos se someten a
etapas adicionales de separación bajo
diferentes condiciones, en otra columna o, en
el caso de la cromatografía plana, en
dirección perpendicular.
Ejemplo: Huellas dactilares estudio de
proteínas