AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

MSC. Jans Velarde Negrete

Introducción
Recogida y procesamiento de muestras
Al igual que sucede en los restantes tipos de procesos infecciosos, el diagnostico de laboratorio de
la infección causada por un hongo depende directamente de la recogida correcta de material clínico
adecuado y la entrega inmediata de las muestras al laboratorio clínico.
La selección de las muestras para cultivo y estudio microscópico se basa no solo en la información
obtenida durante la exploración clínica y radiológica, sino también en la selección del patógeno
fúngico que con una probabilidad mayor podría producir un tipo especifico de infección.
Las muestras se deben recoger en condiciones asepticas o despues de haber limpiado y
descontaminado la zona de obtencion.
Es preciso remitir de inmediato una cantidad apropiada de material clinico para su cultivo y estudio
microscopico.
• Entre las recomendaciones que debe darse al paciente están:
suspender los medicamentos sistémicos o tópicos con acción
antimicótica 15 días antes de la toma de la muestra y cinco días antes
debe evitarse la aplicación de cremas o polvos sobre la piel a estudiar.
Introducción
Lamentablemente, muchas de las muestras remitidas al laboratorio presentan una baja calidad, su
cantidad es insuficiente y no son adecuadas para elaborar un diagnostico.
Siempre que sea posible, las muestras deben remitirse en un contenedor estéril hermético y
acompañarse de unos antecedentes clínicos relevantes.
El laboratorio depende de la información clínica para determinar el método mas adecuado de
procesamiento de la muestra con el objeto de recuperar el agente etiológico.
Los antecedentes clínicos también resultan de utilidad para interpretar los resultados de los cultivos
y otras pruebas de laboratorio, en especial cuando se procesan muestras procedentes de zonas no
estériles, como el esputo y la piel.
Por otra parte, la información clínica alerta al personal del laboratorio de la presencia de un posible
patógeno peligroso, como Coccidioides immitis/posadasii o H. capsulatum.
El transporte de las muestras al laboratorio debe efectuarse sin demora
alguna; no obstante, un retraso en el procesamiento de las muestras
para su cultivo fungico puede ser menos perjudicial que en el caso de
las muestras remitidas para su estudio bacteriologico, virico o
parasitologico. Por lo general, cuando el procesamiento no va a
realizarse de inmediato, las muestras para cultivos fungicos pueden
conservarse a 4 °C durante un corto periodo sin que ello conlleve una
perdida de viabilidad del microorganismo.
Examen microscópico
Una o dos gotas de una muestra acuosa o serosa, por ejemplo esputo, orina, liquido raquídeo o
aspirado, deben colocarse sobre un portaobjetos en una gota de hidróxido potásico al 10 a 20%;
después de aplicar un cubreobjetos, se examina el portaobjetos bajo el microscopio con
objetivos de potencia baja y alta.
El KOH disuelve cualquier tipo de tejido; las paredes celulares micoticas, resistentes, muy
insensibles, se tornan mas visibles.
Este procedimiento asimismo puede utilizarse para examinar muestras de tejido raspado o
picado. La sensibilidad de la solución de KOH mejora con adición de calcofluor blanco, que es una
tinción de la pared celular del hongo no especifica, visible con un microscopio de fluorescencia.
La detección de hongos en pus, exudados viscosos y tejido picado también se puede examinar
con preparaciones de KOH mediante calentamiento suave del portaobjetos para disolver los
residuos de tejido excesivo y células inflamatorias.
Los hongos también pueden observarse en frotis de sangre, LCR y otras preparaciones tratadas
con tinción de Gram o Wright.
Examen microscópico
En muestras de biopsia fijada con formalina, los hongos pueden
detectarse con tinción histopatologica de hematoxilina y eosina (H&E)
corriente.
Sin embargo, son mas sensibles las tinciones especializadas de pared
celular de hongos.
Las dos tinciones mas comunes son la de plata de metenamina de
Gomori (GMS, gomori-methenamine silver) y acido periódico y
colorante de Schiff (PAS, periodic acid-Schiff ), las cuales tiñen las
paredes celulares de negro o rojo, de forma respectiva.
Otras tinciones especializadas, por ejemplo las tinciones de capsula para
Cryptococcus, se describen en secciones posteriores.
Preparación de hidróxido de potasio (KOH). Criptococosis. En esta muestra obtenida por lavado
Muestra obtenida por raspado de cuero cabelludo de una probable tiña, la
cual se mezcló con solución de KOH al 10% y se observó al microscopio
pulmonar se advierte netamente la capsula de Cryptococus
con la lente de bajo aumento. La piel se ha disuelto, revelando hifas neoformans. Tincion de Giemsa.
ramificadas de estructura tubular.

Cryptococcus neoformans, tinta china.

Tinción con blanco de calcoflúor que Tinción de Gram de Cryptococcus
Tinción de Gram de Aspergillus. Esta muestra no
muestra la presencia de levaduras de neoformans. Las levaduras de gemación
retuvo la tinción de violeta de genciana, por lo que
gemación y seudohifas de Candida albicans encapsuladas de tamaño variable presentan un
los microorganismos aparecen como
patrón moteado debido a la irregular retención
gramnegativos.
de la tinción de violeta de genciana.

Tinción de Giemsa
Tinción de Giemsa que que muestra formas
revela la presencia de levaduriformes
formas intraquísticas y intracelulares de
tróficas de Pneumocystis Histoplasma
jirovecii. capsulatum.
Tinción de plata de quistes de Pneumocystis jirovecii. Tinción de plata de Rhizopus.
Cultivo
Según su composición y función:
Generales: son medios diseñados para el crecimiento
de la mayoría de los microorganismos fúngicos.
En micología el más conocido es el Agar Sabouraud
Dextrosa (SDA) por su fácil preparación, se utiliza
cotidianamente y es un medio base para el aislamiento
y crecimiento de agentes fúngicos provenientes de
muestras clínicas para una futura identificación.
Sabouraud con una colonia de Trichophyton rubrum
 var. rodhaini.
Sporothrix schenckii en Agar Sabouraud.
Trichophyton terrestre en Agar Sabouraud
Cultivo
Selectivos: Esto se logra porque en su
composición poseen sustancias inhibidoras
como lo son los antibióticos, en el caso de
antifungicos tenemos la Actidiona y en los casos
de antibacterianos tenemos Cloranfenicol y
Gentamicina que son los más usados.
En este caso el medio conocido por excelencia y
que proporciona buenos resultados es el Agar
Micosel.
Crecimiento de Sporothrix
schenckii en agar Micosel//Causante
de la esporotricosis
Son medios que permiten el crecimiento de los hongos patógenos que
afectan al ser humano y que son de importancia para el estudio en los
casos clínicos, estos se debe a que permiten el crecimiento de los
agentes fúngicos patógenos e impiden el crecimiento de la mayoría de
hongos ambientales y bacterias que no tienen importancia clínica.
Cultivo
Enriquecidos: Son medios utilizados para ciertos microorganismos que exigen
ciertos sustratos adicionales para poder desarrollarse y crecer (estos medios
no necesariamente inhiben el crecimiento de los demás hongos). Aquí
tenemos como ejemplo el Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) que permite
un buen aislamiento en el caso de los hongos causantes de micosis profunda
como es el caso de la histoplasmosis.
Diferenciales: son medios que permiten diferenciar y clasificar diversos
hongos en género o especie debido a la presencia de sustancias comógenas o
indicadores de pH, evidenciando las características que presenta cada uno de
estos microorganismos fúngico.
Por ejemplo el Agar Cromogénico para Candida que permite su crecimiento y
a su vez diferenciar diversas especies de este patógeno, según el desarrollo o
producción de un pigmento (color) específico cuando crece en este agar.
Cultivo
Especiales: Son medios diseñados específicamente para el crecimiento de un
género o especie de hongos.
Un ejemplo claro es el medio Converse para obtener la fase levaduriforme
de Coccidioides spp. debido a que tiene especificaciones únicas para poder
obtener el crecimiento de este hongo.
Medios caseros de Borelli: Son medios cuya forma de preparación se basan en
utilizar nutrientes de “casa” como zanahoria, papa, maíz, cambur, miel, leche,
harina de trigo, avena y otros que sean de uso cotidiano. Estos medios son
útiles porque brindan al microorganismo los sustratos necesarios para
favorecer la esporulación y producción de conidias que son parte de su
morfología, siendo importantes e indispensables para la identificación de los
hongos. Como ejemplo tenemos el medios Lactrimel que posee principalmente
Leche, harina de trigo y miel de abeja.
TECNICAS INMUNOLOGICAS Y
MOLECULARES
Se han efectuado muchos estudios para poner a punto técnicas
sensibles y especificas para la detección de antígenos fúngicos en
líquidos estériles, sangre u orina, en particular de hongos oportunistas,
como cándida y aspergilos cuando producen infecciones sistémicas
profundas en el pulmón, el riñón y otros órganos.
Los unicos reactivos comercializados con amplia experiencia y que
hasta la actualidad se han mostrado utiles son los dirigidos a la
deteccion de antigeno de Pneumocystis jiroveci (IF), del antigeno
capsular de criptococo en el LCR o en el suero (latex) y del
galactomanano de Aspergillus fumigatus en el suero (ELISA).
TECNICAS INMUNOLOGICAS Y
MOLECULARES
Existen otras tecnicas comercializadas para la detección de antigenos fungicos
(enzimoinmunoanalisis para la deteccion de mananos de candida).
Tambien se han comercializado antigenos para la deteccion de anticuerpos
antimananos (ELISA) y antimicelio de candida (IFI), asi como para la deteccion
de anticuerpos frente a varias especies de Aspergillus2' por diversas tecnicas.
Por otra parte, tambien es posible detectar mediante tecnicas enzimaticas
componentes no antigenicos, como los 1 -3 (3-glucanos, presentes en la
mayoría de los hongos.
Todas estas pruebas son de reciente incorporacion y estan en fase de
evaluacion. Como en todos los reactivos comercializados, para su uso debe
seguirse estrictamente las indicaciones del fabricante.
TECNICAS INMUNOLOGICAS Y
MOLECULARES
La aplicacion de tecnicas moleculares para el estudio de las infecciones
fungicas se encuentra en plena fase de desarrollo.
Actualmente, solo existen reactivos comercializados para la
identificacion por tecnicas de hibridación de algunos hongos patogenos
primarios Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis, Blastomyces
dermatitidis (AccuprobeR, Gen-Probe), mientras que las tecnicas
diagnosticas por metodos de amplificacion solo estan disponibles a
nivel experimental.
• Modificada de Mujeeb I y cols.: Fungi and fungal infections. En McClatchey KD,
editor: Clinical laboratory medicine, 2.ª ed., Filadelfia, 2002, Lippincott Williams
& Wilkins.
• ADN, ácido desoxirribonucleico; ARN, ácido ribonucleico; EIA,
enzimoinmunoanálisis; FID, detector por ionización de llama; GLC, cromatografía
de gas-líquido;
• HSP-90, proteína del shock térmico-90; ITS, región espaciadora transcrita interna;
LA, aglutinación de látex; P450, gen de la lanosterol 14-alfa-desmetilasa;
• RIA, radioinmunoanálisis.
• *Todas las secuencias se detectan mediante reacción en cadena de la
polimerasa.
GRACIAS