DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

Profesora Cristina Iovannitti www.mancia.com.ar

Depto Microbiología. Centro de Micología
¿Cuando es
necesario un
examen
micológico?
 Siempre

Las manifestaciones clínicas de las

micosis y su sintomatología no son
patognomónicas de las infecciones
fúngicas.
 Un diagnóstico micológico precoz
posibilitará un uso racional de los
antifúngicos y limitará el desarrollo de
resistencia.
Uso racional del laboratorio de Micología

Examen micológico directo y

coloraciones
‹ Permite conocer la presencia de elementos
fungicos
‹ De acuerdo a su morfología se pueden adoptar
las conductas terapéuticas adecuadas
‹ Rentabilidad: alta, en corto tiempo con bajo
costo de materiales
‹ Dificultades: necesita de personal entrenado
con gran experiencia en la observación
microscópica
Uso racional del laboratorio de Micología

CULTIVOS

Identificación macro y
micromorfológica
Bioquímica de los hongos

Permite adecuar los tratamientos

de acuerdo a la susceptibilidad
conocida de los géneros y
especies
Uso racional del laboratorio de Micología

Diagnóstico micológico indirecto

‹ Titulación de anticuerpos

‹ Permiten el diagnóstico de las micosis

sistémicas endémicas y su tratamiento

‹ Búsqueda de antígenos
Por técnicas serológicas o moleculares
Permiten el diagnóstico precoz y la
implementación de terapéuticas
adecuadas
Uso racional del laboratorio de Micología

Histopatología
‹ H&E
Coloraciones especiales
‹ PAS

‹ Grocott

‹ Alcian Blue
 Uso racional del laboratorio de Micología

Pruebas de susceptibilidad a los

antifúngicos
‹ Determinacione de CIM por dilución

‹ Pruebas de difusión

La correlación ”in vivo” “in vitro”

es dificil de interpretar
 Diagnóstico Microbiológico
Con que técnicas contamos?
Diagnóstico micológico directo
1. Exámenes en fresco o con
coloraciones
2. Cultivos. Pruebas bioquímicas
Identificar el agente etiológico
1. Exámenes histopatológicos
2. Determinación de antígenos y anticuerpos fúngicos
3. Detección de ácidos nucleicos
4. Sensibilidad ”in vitro” a los antifúngicos
 Diagnóstico micológico directo
Exámenes en fresco montados en agua destilada
levaduras obtenidas por escarificación de una ulcera

Paracoccidioides brasiliensis
 Diagnóstico micológico directo
Exámenes de escamas con hidróxido de potasio

Micelios tabicados o cenociticos

Levaduras con o sin seudomicelio

 Diagnóstico micológico directo
Exámenes de PELOS con hidróxido de potasio

PELOS MICROSPÓRICOS
 Diagnóstico micológico directo
Estudio de secreciones con tinciones

Tinción Giemsa
Tinción de Gram
seudomicelio levaduras
intracitoplasmáticas
Candida
Histoplasma capsulatum
Examen directo de escamas de
pelos de cuero cabelludo
(tinea capitis) con HOK 40%
con tinta

Pelo ectotrix.
Tiña microspórica
 Diagnóstico micológico directo
Montados sobre una gota de tinta china
Biopsia de piel con tinción de PAS: levadura monogemante
Fase levaduriforme de Sporotrix schenkii
 Examen en fresco de secreción nasal
Micelio hialino cenocítico. Mucormicosis
Exámenes histopatológicos
Tinción con H&E
Micelio tabicados hialinos

Técnicas argénticas
Micelios cenocíticos
Granuloma conteniendo cuerpos
esclerotales. Cromomicosis
Cuerpos esclerotales. Examen directo de lesiones cutaneas.
Fase tisular de Demateaceos
Examen directo de esputo. Elementos esféricos de 100 µ de
diámetro. Fase parasitaria de Coccidioides posadasii
Corte histológico de una biopsia de polipo nasal con tincón de H&E
Esporangios de más de 300 µ de diámetro Rhinosporidium seeberi
 CULTIVOS

EN MEDIOS DE SABURAUD O LACTRIMEL

INCUBADOS A 28º 37º
ENTRE 7 A 21 DIAS
Diagnóstico micológico Cultivos
‹ Son métodos de concentración
‹ Los medios cromogénicos permiten
aislar e identificar algunas especies de
levaduras
‹ Detectar infecciones mixtas

‹ Permiten el aislamiento del agente

causal
‹ Permiten la identificación de género y
especiees
 PARA HONGOS MICELIALES

Histoplasma capsulatum

Aspergillus fumigatus
Fase saprofítica de Coccidioides immitis
Hifas hialinas, tabicadas ramificadas con microconidias claviformes
y clamidioconidias intercalares de
Trichophyton tonsurans
Micelio hialino tabicado con macroconidias en raqueta:
Epidermophyton floccosum
Examen microsópico de un cultivo de la fase saprofítica de
Sporotrix schenckii
Espórofos largos de donde
emergen microconidias piriformes
no tabicadas
Scedosporium apiospermun
Macroconidias en semiluna tabicadas
Fusarium spp.
Micelio pigmentado tabicado con macroconidias tabicadas (fragmosporos)
Alternaria alternata
Micelio tabicado pigmentado con macroconidias tabicadas de la
familia Demateacea Curvularia lunata
Micelio hialino tabicado
con espóforos largo de
donde emergen
microconidias
Acremonium falciforme
Micelio filamentoso, ramificado, tabicado de color pardo, con fialides
en forma de ánfora con conidias ovaladas en el extremo distal de
Phialophora verrucosa
Esquema de fructificación rinocladiella de
Fonsecae Pedrosoi
Cabezas aspergillares

esterigmas

Micelio tabicado hialino que termina en dilataciones las que

proyecta los esterigmas de los cuales se generan los condios
asexuados externos. Aspergillus fumigatus.
 esporangio

Micelio hialino cenocítico del que seforma un fruto asexuado (esporangio):

Absidia corymbifera
Para hongos levaduriformes

•El aislamiento primario lleva 24 a

48 hs.
•El uso de medios cromogénicos
permite conocer la especie en
forma precoz y detectar las
infecciones mixtas.
•Su tipificación requiere de
pruebas bioquímicas que tardan
24 a 72 hs.
•Son métodos comerciales
 Examenes directo sin coloraciones
„ Examen en fresco
1. Permite reconocer la presencia de elementos
fúngicos
2. Diferenciar las formas levaduriformes de las
miceliales
3. Diferenciar los micelios hialinos de los
pigmentados
BAJA SENSIBILIDAD
Y EXCELENTE ESPECIFICIDAD
CONCLUSIONES

„ Técnicas mediante tinciones

„ Gram: permite observar claramente la presencia de
algunos hongos levaduriformes ( Candida)
„ Giemsa : hongos intracelulares
„ Técnicas argénticas

BAJA SENSIBILIDAD Y
EXCELENTE ESPECIFICIDAD
 „Técnicas de examen directo c/ fluorocromos
Tinción con blanco de calcofluor
„ Mayor sensibilidad que los exámenes en fresco
permite detectar a los hongos cuando se
encuentran en bajas concentraciones

Tubos germinativos
de Candida
Técnicas inmunológicas de examen directo
Inmunohistoquímica con anticuerpos
marcados
Estandardizado solo para
P neumocystis jirovecii

Levaduras capsuladas
Cryptococcus neoformans
Montados con Tinta china
Estudios histopatológicos
•La observación de hongos en
tejidos con coloraciones
especiales, PAS y Grocott.
•Permiten ver la forma tisulares
y estudiar el tipo de reacción
inflamatoria.
•Su tiempo de procesamiento
puede variar de 24 a 72 horas.
•Está en desarrollo promisorio la
tipificación de género y/o especie
por PCR y anticuerpos
específicos.
„Permite conocer la invasión tisular .
„La observación de trombos fúngicos confirma el carácter micótico

„Las coloraciones de H&E permiten estudiar el tipo de reacción y

distinguir los hongos hialinos de los pigmentados.

„PAS y Grocott aumentan la sensibilidad por evidenciar la presencia

de hongos

„El uso de métodos inmunohistoquímicos y moleculares aumentan

la sensibilidad y permiten llegar en algunos casos
al diagnóstico de género y especie.
Diagnóstico micológico Cultivos
Hongos miceliales Hongos levaduriformes
Estudio macro y Estudio morfológico y
micromorfológico bioquímicos en medios
diferenciales

Único método estandardizado para

IDENTIFICAR Y TIPIFICAR el agente etiológico.
La obtención de resultados varía entre 7 A 21 días
puede ser tardía en relación a la toma de conductas
terapéuticas
Interpretación de resultados cuando solo hay cultivos
‹El aislamiento debe estar relacionada
con la clínica.
‹ El aislamiento de A. fumigatus y A.
flavus de muestras respiratorias tiene
valor predictivo en pacientes
neutropénicos.
‹ La agresividad de los mucorales justifica
comunicar su aislamiento.
‹ El aislamiento de hongos del género
Candida solo tiene valor diagnóstico si
fueron aislados de cavidades cerradas.
Diagnóstico micológico Hemocultivos

‹ La utilización de métodos automatizados y

de lisis--centrifugación son los mas sensibles.
‹ El aislamiento de hongos levaduriformes
tiene un alto valor predictivo positivo.
‹ La sensibilidad es variable.
‹ Mas del 60% de los pacientes con fusariosis
presentan hemocultivos positivos.
‹ El hallazgo de Aspergillus spp. y otros
hongos ambientales se deben interpretar en
relación con la clínica y el aislamiento en
otros materiales.
Búsqueda de antígenos
‹
y anticuerpos fúngicos
TITULACIÓN DE ANTICUERPOS (IgG)

EN PACIENTES INMUNOCOMPETENTES

PRUEBAS SEROLÓGICAS

Inmunodifusión
Contrainmunelectroforesis
ELISA

Tienen valor DIAGNÓSTICO y PRONÓSTICO

 CURVAS PROBABLES EN LA EVOLUCIÓN
DE LAS IgG

Evolución del título de anticuerpos

diluciones del suero

1200
1000
800
600 m al pronóstico
400
buen pronóstico
200
0 m al pronóstico
1 2 3 4 5
sem anas
 Detección de antígenos fúngicos
„ Específicos
1. Aglutinación de partículas de látex Cryptococcus spp..
( Crypto--LA test.. Wampole Labs

2. ELISA para galactomananos de Aspergillus spp.

3. ELISA para residuos β--1,5 manano de Candida

„ Panfúngicos
1. Test cromogénico para la detección de β--D-glucanos..
Detección de poliscárido capsular de
Cryptococcus neoformans
„Técnica de Aglutinación de partículas de látex
sensibilizadas con anticuerpos anti--polisacáridos

‹ Estandardizada para LCR, suero y

orina.
‹ Técnica Cuali-cuantitativa

‹ Sensibilidad y especificidad > 90%

‹ Reacciones cruzadas en infecciones

por Trichosporon spp. y algunas

bacterias capsuladas.
ELISA para galactomananos de Aspergillus
‹ ELISA sándwich, usa el anticuerpo
monoclonal EBA--2
‹ Esta validado solo para la detección

semicuantitativa en sueros humanos.

‹ Se consideran positivas para Aspergilosis

Invasora todas las muestras con un

índice mayor o igual a 1.5 en dos o más
determinaciones consecutivas
‹ Sensibilidad del 50-92%

‹ Especificidad 94-99 %
TEST CROMOGÉNICO PARA LA DETECCIÓN DE
(1--3) β--D--GLUCANOS.

‹ Técnica de detección panfúngica

‹ Sensibilidad del 90 %
‹ Especificidad del >85 %
‹ No existen estudios multicéntricos
comparativos
‹ No presenta evidencias para su
recomendación
‹ No es útil para el diagnóstico de
C neoformans,, otros Basidiomycetes y
especies de Mucorales (β 1--6 D glucano)
‹ Detección de ácidos nucleicos
 Utilidad de las técnicas moleculares

‹ Detección de ADN en muestras biológica

‹ Métodos de tipificación molecular de hongos

aislados o en cortes histopatológicos.

‹ Estudios de brotes de infecciones

intrahospitalarias..

‹ Caracterización molecular y secuenciación

genética en el estudio de la resistencia a los
antifúngicos.
‹ Detección de acidos nucleicos en suero,
sangre, LCR y otros materiales en el
diagnóstico de infecciones fúngicas

‹ PCR con sondas para la detección

panfúngicas
‹ PCR con sondas especificas de género y
especie
‹ PCR cuantitativa en tiempo real
‹ Sensibilidad y susceptibilidad variable
‹ No existen métodos estandardizados
‹ Determinación de sensibilidad
” in v itro”
Técnicas para realizar estudios de
sensibilidad
‹ Métodos de dilución
‹ NCCLS Doc. M27-A2 para levaduras
‹ NCCLS like ( Propuesto por EUCAST)
‹ NCCLS Doc. M38-A
‹ Métodos de difusión
‹ Etest Tabletas Rosco
‹ NCCLS M44-P
‹ Métodos calorimétricos
‹ YeastOne
‹ Fungitest
 Conclusiones Finales

‹ El diagnóstico micológico clásico es aun hoy

la forma mas segura de confirmar la
enfermedad fúngica y caracterizar su agente
etiológico.
‹ La recuperación por cultivo del hongo permite:
I. Elegir el tratamiento mas adecuado de
acuerdo a su género y especie.
II. Estudiar la susceptibilidad a los antifúngicos.
III. Caracterizar a través de estudios
moleculares su responsabilidad en la
aparición de brotes de infecciones
intrahospitalarias.
 Conclusiones Finales
‹ Técnicas serológicas para la búsqueda de
antígenos y anticuerpos:
I. La detección de anticuerpos en pacientes
inmunocompetentes ha demostrado su
utilidad en la toma de conductas
terapéuticas..
II. La búsqueda de antígenos capsulares de
Cn en cualquier hospedero presenta alto
nivel de evidencia y es diagnóstica.
III. L a cuantificación de g alactomananos de
Aspergillus en pacientes
oncohematológicos son útiles para su
categorización
 Conclusiones Finales
Las técnicas moleculares son promisorias: pero

I. No están estandardizadas y no son

reproducibles en diferentes centros.
II. Presenta utilidad con evidencia variable en la
caracterización de los pacientes
neutropénicos con micosis
III. Son útiles en la caracterización de brotes de
infecciones intrahospitalarias.