CULTIVOS MICOLGICOS

El diagnstico definitivo de la mayora de las micosis requiere el aislamiento e identificacin del hongo a partir del cultivo.
El objetivo fundamental de la utilizacin de los medios de cultivo es optimizar el crecimiento de los microorganismos. Segn
su composicin, los medios de cultivo puede ser:

Generales.- El ms caracterstico y clsico es el Agar Dextrosa de Sabouraud (SDA) utilizado para el aislamiento de hongos
a partir de muestra clnicas y para su identificacin.
Enriquecidos.- Se utilizan especialmente en micosis sistmicas endmicas (histoplasmosis, paracoccidioidomicosis, etc.), un
ejemplo es el agar infusin cerebro-corazn (BHIA).
Selectivos.- Son medios que favorecen el aislamiento de los microorganismos deseados impidiendo el de otros. Se utilizan
con antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina) y/o antimicticos, (cicloheximida). Utiles en
micosis cutneas y sistmicas.
Diferenciales.- Ayudan a la identificacin del hongo basada en la apariencia de ste en dicho medio, gracias a la adicin de
determinados componentes (sustancias cromgenas, o indicadores de pH). DTM para Dermatofitos, CHROMagar Candida.
Especializados.- Son aquellos medios que contienen algn componente destinado a aislar e identificar un agente concreto
(semillas de girasol Guizotia abyssinica para (Cryptococcus neoformans) o a favorecer la identificacin de ciertas especies
(medio de Czapeck para las especies de Aspergillus).

MEDIOS DE CULTIVO MS UTILIZADOS

Agar Dextrosa de Sabouraud, (SDA)
Agar Infusin cerebro-corazn (BHIA) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sin antibacterianos
Agar inhibidor para mohos (MIA)
Mycosel/Mycobiotic(antibacterianos/cicloheximida)
Agar Dextrosa de Papa (PDA).
Agar agua

Los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos la mayora de los medios bacteriolgicos, si se incuban
el tiempo suficiente.

Agar de Urea.- Se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.
Agar de harina de maz (Corn Meal Agar).- Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas especies de Cndida y
para realizar subcultivos ya que estimula la esporulacin de hongos miceliales. Suplementado con 10 gramos de Glucosa:
para diferenciar el Gnero Trichophyton

DIAGNSTICO
1. Deteccin de la presencia del hongo (Examen directo y Examen histolgico)
2. Cultivo
3. Identificacin

IDENTIFICACIN
Se basa fundamentalmente en la morfologa. No existen mtodos rpidos, miniaturizados ni automatizados, ni tests
nutricionales y fisiolgicos que nos permitan identificar la mayora de especies.
MEDIOS DE CULTIVO USADOS EN CLNICA
Agar de Sabouraud, agar glucosado de patata, etc Ricos en Nutrientes. El hongo se pleomorfiza con facilidad y dificulta el
diagnstico micolgico.

CULTIVO PURO
Medios de cultivo adecuados:
Estimular la esporulacin
Desarrollar estructuras frtiles similares a las que presenta en la naturaleza
Producir pigmentos
Determinar tasas de crecimiento
MEDIOS DE CULTIVO PARA:

Estimular la esporulacion:
Agar patata zanahoria
Agar harina de avena
Agar V8
Agar harina de Maiz
Tasa de crecimiento y produccion de pigmento
Agar patata dextrosa
Agar Harina de avena
Identificacion de especies (Fusarium)
Agar nutritivo sintetico
Agar hojas de clavel
Identificacion de especies (Aspergillus y Penicillium)
Agar extracto de malta al 2%
Agar Czapek Dox

INCUBACIN
Condiciones estandar para un patgeno oportunista:
Temperatura: 24-28C
Luz: - Oscuridad
- 12h UV / 12h oscuridad

CARACTERES MACROSCPICOS.- Dimetro de la colonia, color, textura...

CARACTERES MICROSCPICOS.- Morfologa de las hifas, de las estructuras frtiles

IDENTIFICACIN DE ESPECIES
Estudio de los caracteres microscpicos: preparaciones directas y microcultivo

Preparaciones Directas.- Lquidos de Montaje

Preparaciones semipermanentes:
Lactofenol
Lactofenol-Azul Algodn
cido Lctico al 85
cido Lctico- Azul Algodn

Preparaciones permanentes:
Alcohol Polivinilo

Microcultivo.- Preservar las estructuras frgiles

HEMOCULTIVOS
El hallazgo de un hongo en sangre certifica el diagnstico de una micosis invasora; sin embargo, el hemocultivo presenta baja
sensibilidad y en general su positividad no supera el 50 % en pacientes con candidiasis invasoras. Los hongos filamentosos,
aun cuando invadan tejidos son difciles de encontrar en sangre. Se debe diferenciar los contaminaciones de los hongos
filamentosos y levaduriformes de las verdaderas micosis invasoras.

CONSEJOS PRCTICOS PARA EVALUAR UN CULTIVO DE MUESTRAS RESPIRATORIAS Y EMITIR UN INFORME

No todos los hongos tienen capacidad para producir una micosis invasora del tracto respiratorio inferior, por lo que
hay que evaluar especialmente los aislamientos de aquellos hongos que con mayor frecuencia se han visto implicados
en procesos clnicos.
El aislamiento de
- fumigatus o A. flavus en una muestra respiratoria de un paciente leucmico y/o neutropnico tiene un alto valor de
infeccin fngica invasora.
 La gravedad y agresividad de una mucormicosis pulmonar justifica siempre informar de la presencia de un mucoral
en una muestra respiratoria correctamente procesada.
La corticoterapia prolongada es por s sola un importante factor de riesgo para desarrollar una aspergilosis invasora.
El aislamiento de
- C. neoformans en una muestra respiratoria es indicativo de criptococosis pulmonar o de infeccin sistmica
- Scedosporium apiospermum y S. prolificans pueden dar lugar a micosis pulmonares invasoras clnicamente
indistinguibles de la aspergilosis.
La fusariosis pulmonar suele deberse a diseminacin hematgena en un cuadro sistmico y, en ms del 50% de los
casos, cursa con hemocultivos positivos.
La especies del gnero Candida rara vez dan lugar a micosis pulmonares invasoras, si no es en pacientes terminales,
estando presentes en las secreciones respiratorias del 20% de la poblacin sana y en ms del 50% de los pacientes
que han recibido antibioticoterapia.

INMUNOMICOLOGIA
Diagnstico inmunologico de las micosis profundas
INFECCIONES POR INHALACION DE ESPORAS
Histoplasmosis
Blastomicosis
Paracoccidioidomicosis
Coccidioidomicosis
Aspergilosis
Zygomycosis
Cryptococosis

Respuesta inmunologica del huesped

MEDIACIN CELULAR ANTICUERPOS
ADR
MEDIACIN POR:
Aglutinacion
Hemaglutinacion
Inmunoprecipitacion
Ria,
Elisa, etc.

Deteccin de la sensibilidad cutnea

Antgeno:
Histoplasmina (filtrado del cultivo miceliano)
Reaccin positiva:
Infeccin en evolucin ( infiltracin pulmonar, lesiones cutneas) o
Crnica ( calcificacin pulmonar, esplnica )
Reaccin negativa:
No excluye infeccin (comienzo, diseminacin, anergia).
Induce la formacin de anticuerpos
Presencia de reacciones cruzadas con otras micosis
Uso epidemiolgico. Sin valor diagnstico

INMUNODIAGNSTICO DE HONGOS PATGENOS

Investigacin de antgenos
Antigeno Polisacrido capsular : Cryptococcus neoformans:
Exoantgenos de C. albicans puede diferenciar C. tropicalis
Deteccin de los serotipos A y B de Candida albicans.
Antgenos liberados en cultivo: Extractos de medios de cultivo
 Investigacin de anticuerpos
Tcnicas de IDD
B. dermatitidis,
P. brasiliensis,
H. capsulatum,
C. immitis,
Candida
Aspergillus, etc.

Se han desarrollado diversos mtodos alternativos al cultivo que pueden proporcionar al clnico informacin rpida y fiable
ante la sospecha de una micosis invasora. Entre estos mtodos destacan:
Deteccin de antgenos,
Deteccion de anticuerpos y
Deteccion de componentes fngicos no antignicos.
Algunas de estas tcnicas serolgicas ya se han convertido enherramientas bsicas en el laboratorio de Microbiologa Clnica
actual, como:
Deteccin del antgeno capsular de Cryptococcus neoformans
Deteccin de galactomanano en pacientes con aspergilosis invasora.

DETECCION DE ANTIGENO
Criptococosis
La deteccin de antgeno capsular en lquidos orgnicos y especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis
criptoccica.
Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez tcnica y especificidad de la prueba.
Permite el diagnstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99% de las meningitis criptoccicas y el 67% de las
criptococosis diseminadas.
El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios das.
Se utilizan dos tipos de tcnicas, una cualitativa y otra cuantitativa.
La tcnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de criptococosis o para confirmar reinfeccin
especialmente en el sida.

Antgeno cryptococo
La tcnica consiste en la deteccin de antgeno capsular criptoccico mediante anticuerpos monoespecficos dirigidos
frente a l y unidos a partculas de ltex. La aglutinacin de las partculas de ltex tras la reaccin antgeno-anticuerpo
se detecta a simple vista..
La tcnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimiento
de la evolucin de pacientes ya diagnosticados mediante el ttulo de antgeno capsular presente en la muestra clnica,
que generalmente es suero o LCR.
Es til para conocer la eficacia del tratamiento antifngico aplicado.

Cryptococosis latex
FUNDAMENTO:
Consiste en la precipitacin de particulas de latex sensibilizadas con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C.
neoformans en muestras de LCR, suero y orina.
Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de pacientes con criptococosis menngea.
El limite de deteccin es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .
Una reaccion negativa no descarta infeccin.
La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento progresivo de titulo es de mal pronostico.
Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.
Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clnicos con pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya
funcion es separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor reumatoideo, elimina los falsos positivos y
aumentar la sensibilidad de la prueba.
 LECTURA DE RESULTADOS:
La lectura es visual y se debe realizarse de la siguiente manera:
Negativo: Suspensin granular muy fina con ausencia de aglutinacin
Positivo +: Suspensin con escasos grumos contra un fondo homogeneo lechoso.
Positivo ++: Suspensin con escasos a moderados grumos contra un fondo moderamente homogeneo.
Positivo +++: Suspensin con moderados a abundantes grumos contra un fondo claro.
Positivo ++++: Suspensin con abundantes grumos contra un fondo totalmente claro

Titulacin Criptococos
Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar titulaciones para el seguimiento de tratamientos.
Las diluciones recomendadas son:
- Positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2;
- Positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100
Posteriormente para muestras seriadas del mismo paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.
El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion de la aglutinacin.
Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo equipo para
evita variaciones.

Falso positivo
La sensibilidad vara entre el 93% y el 100% con un 93-98% de especificidad.
Puede haber falsos positivos:
- Presencia de factor reumatoide
- Pacientes con lupus
- Pacientes con sarcoidosis,
- Arrastre medio de cultivo de agar chocolate,
- Asas de platino o desinfectantes.
- Infeccin sistmica por Trichosporon ashaii
Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o 2-mercaptoetanol.

CANDIDOSIS (DETECCIN DE ANTGENOS CIRCULANTES)

La Candidosis diseminada representa una de las causas de infeccin ms importantes en lo que concierne a
mortalidad y morbilidad en el paciente inmunocompetente e inmunocomprometido.
Los mtodos habituales de diagnstico (hemocultivo) son negativos en las candidosis profundas.
Los mtodos serolgicos no diferencian entre la colonizacin y la invasin.
Aglutinacin con particulas de ltex sensibilizadas:
- Acs. monoclonales anti mananos
- Acs. policlonales anti glucoprotenas

DETECCIN DE ANTGENO DE CANDIDA

Candidiasis
La deteccin de antgeno en pacientes con candidiasis invasora nos ha permitido solucionar el problema diagnstico
que presenta esta micosis.
La deteccin de manano parece ser ms sensible y especifica.
Platelia Candida Ag (Bio-Rad)
Es un ELISA que detecta manano en suero utilizando el anticuerpo monoclonal EBCA1.
Este anticuerpo reconoce residuos -1,5 del manano de C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii, C.
parapsilosis y C. pseudotropicalis pero no de C. krusei.
El lmite de deteccin de la prueba es 0,25 ng/ml de suero.

DETECCIN DE ANTGENO DE ASPERGILLUS

Aspergilosis
La deteccin de galactomanano mediante un ELISA permite el diagnstico de la aspergilosis invasora.
Especificidad del 89,6% y sensibilidad del 87,5%.
Esta prueba en algunos estudios se ha demostrado que es positiva antes de que aparezca la sintomatologa clnica.
 Platelia Aspergillus EIA (Bio-Rad)
La prueba es un ELISA que detecta galactomanano en suero utilizando el anticuerpo monoclonal EBA-2, que reconoce
el galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger.
El lmite de deteccin de la prueba es 1 ng/ml de suero

Actualmente, se considera un resultado positivo cuando el paciente presenta dos muestras consecutivas con un ndice 0,5.
La deteccin de galactomanano puede verse disminuda en pacientes con enfermedad granulomatosa crnica y Sndrome de
Job
El Platelia Aspergillus EIA no ha sido evaluado en profundidad en plasma, orina, BAL y LCR.
La prueba puede dar positiva con hongos del gnero Penicillium, Alternaria y Paecylomyces.
Alimentos como los cereales, pollo, pastas y productos lcteos pueden contener galactomanano que puede ser adsorbido en
nios y pacientes con alteraciones en la barrera intestinal.
Resultados falsos positivos en pacientes tratados con: piperacilina-tazobactam y amoxicilina-clavulnico

ANTGENO DE HISTOPLASMA
Las pruebas pueden aplicarse a muestras tales como: suero, plasma, liquido peritoneal o LCR de pacientes con enfermedad
respiratoria, hepatoesplenomegalia, signos de infeccin sistmica extrapulmonar o con compromiso menngeo, en pacientes
que vivieron o trabajaron en zonas endmicas de Histoplasma capsulatum.

DIAGNSTICO INMUNOLGICO DE LAS MICOSIS PROFUNDAS

(Reacciones serolgicas)
Aglutinacin
Fijacin de Complemento
Inmunoprecipitacin en gel:
- Inmunoelectroforesis
- Inmunodobledifusin
Inmunofluorescencia
Inmunoenzimtica (ELISA)
Radioinmunologa

DETECCION DE ANTICUERPOS
Dificultad de preparacin de antgenos estandarizados
Dbil ttulo de anticuerpos en el curso de las micosis
Utilizacin generalmente para micosis profundas
Reacciones cruzadas
En cryptocosis no tiene utilidad
Candidosis: Actualmente detectan anticuerpos contra el manano, la enolasa y los antgenos del micelio.
Aspergilosis: La deteccin de anticuerpos especficos en suero es, una prueba complementaria clsica para confirmar
el diagnstico de aspergiloma pulmonar y de la aspergilosis broncopulmonar alrgica (ABPA). Las tcnicas empleadas
son: la inmunodifusin doble (IDD) y contrainmunoelectroforesis (CIE)

INCONVENIENTES DE LA INMUNODIFUSION
Es lenta, precisa de una incubacin de hasta 3 das, aunque a las 24 h ya se pueden observar arcos de precipitacin.
Puede producir reacciones cruzadas entre distintas especies de Aspergillus y se extienden a otras especies de hongos e incluso
algunas bacterias.
Esta tcnica no distingue el tipo de anticuerpo especfico presente en el suero (IgG, IgM o IgE).
Tiene una sensibilidad baja, Debido a ste problema esta tcnica no es de utilidad en aspergilosis invasoras.
El factor reumatoide y la protena C-reactiva presentes en el suero pueden causar falsas precipitinas.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Reaccin de identidad: Fusin completa de los anticuerpos del paciente con los antgenos del hongo.
Fusin de los extremos de las bandas precipitantes del suero de referencia y del suero del paciente.
CONSTITUYE UNA PRUEBA POSITIVA. PONE EN EVIDENCIA QUE EL PACIENTE POSEE ANTICUERPOS
ESPECFICOS PARA EL ANTGENO DE UN HONGO EN PARTICULAR.
Reaccin de identidad parcial: Anticuerpos del paciente reaccionan en forma incompleta con el
antgeno de referencia. Esto ocurre por la existencia de fracciones antignicas comunes a varios hongos
que reaccionan parcialmente con los anticuerpos del suero del paciente (histoplasmosis-
paracoccidioidomicosis). NO SE INTERPRETA COMO POSITIVA REALIZAR OTRAS PRUEBAS
COMPLEMENTARIAS COMO LA IEF, FC, ELISA, ETC.

Reaccin de no identidad: Las bandas de precipitacin se entrecruzan. La muestra del paciente presenta
anticuerpos que pueden reaccionar con uno de los mltiples componentes no especficos del antgeno de
referencia.