MICROBIOLOGÍA II BLOQUE I: MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

TEMA 1: Métodos de Diagnósticos en Microbiología

El diagnóstico microbiológico sirve para:

- Identificar agente etiológico responsable del proceso infeccioso,

- Establecer la sensibilidad los diferentes antimicrobianos.

1. Toma y transporte adecuado de la muestra (OJO: importante porque depende del todo el proceso)
2. Datos clínicos y demográficos del enfermo
3. Procesamiento de la muestra clínica
4. Interpretación de los resultados.
5. Informe final: rápido, claro, objetico, fiable y eficaz

Existen 2 métodos de diagnóstico microbiológico:

- Directos: IDENTIFICA microorganismo específico causante del daño o patología

o Tradicionales: observación microscópica, cultivo
o Detección de antígenos
o Detección ácidos nucleicos: Hibridación y PCR
- Indirectos: MANIFESTACION PATOLÓGICA por respuesta sistema inmune (Ag, Ac)
o Detección respuesta inmune frente a patógeno

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS en MICROBIOLOGÍA

 MICROSCOPÍA
La microscopía se utiliza en microbiología con dos propósitos:
1. Detección inicial de microorganismos e
2. Identificación preliminar o definitiva de los mismos

El examen microscópico de muestras clínicas permite detectar:

o Células bacterianas
o Hongos (elementos micóticos)
o Parásitos (huevos, larvas o formas adultas)
o Inclusiones víricas presentes en las células infectadas

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 MICROSCOPÍA ÓPTICA (solo títulos)

o Campo brillante (luz): luz pasa a través del condensador hacia la muestra. Imagen se aumenta en
primer lugar a través de las lentes del objetico y a continuación por las lentes oculares
o Campo oscuro: Visualización directa de la muestra. Observación bacterias se ven mal con
microscopía óptica de luz
o Contraste de fase: Diferencias índices de refracción en distintas células, tejidos. Permite examinar los
detalles internos de los microorganismos
o Fluorescencia: Uso colorantes fluorescentes frente a luz ultravioleta. Ejemplo: naranja de acridina
para Borrelia; auramina o rodamina para Mycobacterium; o calcoflúor para hongos.
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Usa haz de electrones, atraviesa la muestra. Muestra previamente teñida con iones metálicos. No
diagnóstico convencional; restringido a laboratorios de investigación o referencia.
- Estudiar la estructura de los virus
- Virus no cultivables
- Virus nuevos; está técnica fue esencial para:
 Detección de virus Ébola
 Identificación inicial del SARS-CoV
 Virus “Norwalk” (norovirus)
o Transmisión
o Barrido
 Métodos de examen:
o EXAMEN DIRECTO

 Fresco o TINCIONES DIFERENCIALES

 KOH (10%)  Tinción de Gram
 Lugol  Tinción de hematoxilina
o TINCIONES ACIDORRESISTENTES férrica
 Tinción de Ziehl-Neelsen  Tinción de metenamina
 Tinción de Kinyo argéntica
 Tinción auramina-rodamina  Tinción de azul o de toluidina
 Tinción acidorresistente  Tinción tricrómica
modificada  Tinción de Wright – Giemsa
o TINCIONES FLUORESCENTES
 Tinción naranja de acridina
 Tinción auramina-rodamina
 Tinción blanca de calcofluor
 Tinción directa con
anticuerpos fluorescente

o EXAMEN DIRECTO: (Se ha saltado la explicación de todos)

 Fresco: visualización sin colorantes, principalmente hongos y protozoos. Muestras: heces,
exudado vaginal, sedimento urinario, aspirados y otros orgánicos.
 KOH (10%): disuelve el material proteico y facilita la detección de elementos fúngicos.
Muestras: mucosas gruesas, aquellas con queratina como las uñas, raspados de piel y pelos.
 Lugol: visualización directa de protozoos, huevos y quistes de parásitos en heces
o TINCIONES DIFERENCIALES:
 Tinción de Gram: más utilizada. Detección dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas y
Gram negativas.
 Tinción de Hematoxilina férrica o tricrómica: detección e identificación de protozoos fecales.
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 Tinción de plata o argéntica: detección e identificación de protozoos fecales.
 Tinción de azul o de toluidina: detección elementos fúngicos y bacterias en tejidos
 Tinción de Giemsa o Wright: detección e identificación parásitos sanguíneos e inclusiones
celulares de virus y clamidias
o TINCIONES ACIDORRESISTENTES:
 Tinción de Ziehl-Neelsen: Tiñe micobacterias y microorganismos acidorresistentes
 Tinción de Kinyo: igual que tinción de Ziehl-Neelsen, en frío.
 Tinción auramina-rodamina: visualiza bacilos ácido-resistentes especialmente del género
Mycobacterium, pigmentos también fluorescencia.
 Tinción acidorresistente modificada: agente decolorante débil con las otras tres tinciones
acidorresistentes. Identificación Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora.
o TINCIONES FLUORESCENTES:
 Naranja de acridina: detección bacterias y hongos. Intercalación pigmento en ácido nucleico
 Auramina-rodamina: Igual que tinciones acidorresistentes
 Blanco de calcofluor: detección hongos, Pneumocystis; se une a celulosa y quitina de las
paredes celulares
 Tinción directa con anticuerpos fluorescentes: anticuerpos (Ac) se acoplan con moléculas
fluorescentes; unión específica a un microorganismo; útil detección e identificación
microorganismos
 CULTIVOS
- Mayoría microorganismos son cultivados e identificados en cultivos artificiales o en cultivos celulares
- Medios de cultivo:
 Estado físico del medio: Sólidos, líquidos o semisólidos.
 Uso del medio:
 Básicos (agar nutritivo)
 Enriquecimiento (agar sangre o chocolates)
 Selectivos (MacConkey)
 Diferenciales (SS)
 Identificación (chromagar)
 Conservación
 Transporte (Amies, Cary-Blair)
- Condiciones de incubación (tiempo, temperatura, atmósfera) dependerán de: microorganismos y
medio de cultivo
 CULTIVOS de BACTERIAS

MANUAL AUTOMATIZADO
 Barato  Alto coste
 Aplicable a todas las bacterias  Necesario pruebas complementarias
 Elevada inversión recursos humanos  No aplicable a todos microorganismos
 Disminuye tiempo de detección
 Optimización recursos humanos

- IDENTIFICACIÓN:
o Estudio visual de las colonias:
 Características morfológicas: elevación, bordes,
tamaño, color, tipo de superficie, consistencia,
incrustación en el medio de cultivo
 Comportamiento: en distintos sustratos
incorporados al medio de cultivo (hemólisis,
fermentación de azúcares)

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NO APRENDER
o Pruebas Bioquímicas; estudio del metabolismo:
 Rápidas y sencillas, lectura inmediata: Catalasa, Oxidasa.
 Rápidas, lectura < 6 horas: Hidrólisis de hipurato, PYR, ONPG, Ureasa, Indol.
 Lentas, lectura 18-24h: Óxido-fermentación, reducción nitratos, Kligler, Hidrólisis de
esculina, Coagulasa.
 Basadas en resistencia a sustancias: Optoquina, Bacitracina
o Sistemas comerciales multipruebas:
 Manuales o galerías multipruebas (Batería y API)
 Sistemas cmerciales automatizados: realizan inoculación, incubación o lectura
automatizado; permiten realizar pruebas de sensibilidad a la vez (Microsan Walk-away.
Wider, Vitek)
o MALDI-Toff (matrix assisted lase desorption/ionización time o fligh).
Espectometría de masas
Separa proteínas del microorganismo, creando perfiles proteicos
 CULTIVOS CELULARES PARA DETECCIÓN de VIRUS:
o Visualización de Efecto citopático (ECP):
 Sincitios: resultado de la fusión de células (células gigantes multinucleadas) (Herpesvirus)
 Aparición de cuerpos de inclusión (CMV, Sarampión, Adenovirus)
 Aparición de células redondeadas (Virus de la gripe)
 Degeneración y Lisis celular
o Detección de Ag por técnicas inmunológicas (Shell-vial):
 Con Ac monoclonales específicos
 Técnicas de inmunofluorescencia
o TÉCNICAS
 Técnicas laboriosas y especializadas
 Crecimiento de células in vitro formando una monocapa (capa unicelular)
 Tipos de células para cultivo celular: HeLa, MRC-5, Hep-2 y Vero
 Sólo permite el crecimiento de unas pocas clases de virus
 Frecuente para virus como herpes simples, zóster, adenovirus, citomegalovirus
 Ejemplos:
 SHELLVIAL (Cultivo celular rápido):
o Viales comerciales a los que se añaden las líneas celulares
o Se basa en la centrifugación de la muestra sobre un soporte lenticular
formando monocapas celulares
o Cortos periodos incubación: Resultado en 24-48 horas
o Citomegalovirus, enterovirus, zóster, virus respiratorios (Influenza,
Parainfluenza, Adenovirus)
 CULTIVOS IDENTIFICACIÓN de HONGOS:
o Modo similar a las bacterias
o Identificación muchos hongos por morfología en el cultivo
o Medios; Agar Saboureaud, de maíz, de urea, de malta,…
o Cloranfenicol y Ciclohexamida si muestra contaminada

 TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE Ac-Ag (SEROLOGÍA)

o Método de diagnóstico indirecto

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o Requieren un anticuerpo (Ac) capaz de detectar el antígeno (Ag), o viceversa, que estamos buscando
en la muestra
o Técnicas rápidas
o Evalúa la respuesta humoral frente a la infección
o Permiten cuantificar los Ac existentes.
o Evalúa la respuesta humoral frente a la infección
o Permiten cuantificar los Ac existentes
o Evalúa antecedentes de exposición a agentes infecciosos
o La gran mayoría están automatizadas (<80%)
o Anticuerpos (Ac):
 Pueden detectar, identificar y cuantificar los antígenos (Ag) de virus, bacteria o parásito
 Ac específicos se pueden obtener del suero de pacientes convalecientes o preparar en
animales
 Dos tipos Ac:
 Policlonales, reconocen numerosos epítopos en un Ag.
 Monoclonales, reconocen epítopos individuales en un Ag.
o Diferentes técnicas de detección:
 Aglutinación
 Aglutinación con látex
 Inmunofluorescencia
 Inmunocromatrografía
 Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
 Neutralización
 Avidez de Inmunoglobulina (IgG)
 Western Blot
o AGLUTINACIÓN
Utiliza Ac adheridos a partículas grandes de látex u otras
partículas inertes. Ac-Ag aglutinan y forman grumos de gran
tamaño.
o AGLUTINACIÓN con LÁTEX
 Detección y cuantificación Ag víricos solubles
 Partículas de látex recubiertas Ag
 Ac específicos de un virus hacen que las partículas
de látex recubiertas de Ag víricos se agrupen
 Ej. Factor reumatoide, Ag fúngicos, Ag
estreptocócicos

o INMUNOFLUORESCENCIA
 Reconocimiento microorganismos por Ac específicos marcados con fluoresceína u otras
sustancias fluorescentes
 Directa: un único Ac que se une a Ag.
 Indirecta; dos Ac; Ac primario reconoce y une Ag; Ac secundario marcado reconoce
(Ac primario-Ag)

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o INMUNOCROMATROGRAFÍA
 Migración de una muestra a través de una
membrana de nitrocelulosa
 Muestra añadida en zona del conjugado, formado
por Ac específico contra epítopos del Ag a
detectar y un reactivo de detección.
 Si muestra con Ag problema, éste se unirá al
conjugado; complejo inmune migrará por
membrana de nitrocelulosa
 Si no, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse

o ENZIMOINMUNOANÁLISIS (ELISA)
 El marcaje se hace con un enzima. Se puede marcar tanto el
antígeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias)
 Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo-enzima,
se añade un sustrato que es catalizado por el enzima
transformándose en un compuesto coloreado que permite
la medida de la actividad enzimática con ayuda de un
espectrofotómetro

o NEUTRALIZACIÓN
 Ac se unen a estructuras bacterianas o víricas
 Análisis de inhibición de Ac; aprovecha especificidad Ac para
evitar una infección
 Identifica la cepa del agente responsable de la infección
habitualmente de la infección, habitualmente un virus, o
cuantifica las respuestas de Ac a una cepa específica de un
virus

o AVIDEZ DE INMUNOGLOBULINA (IgG)

 Diferencia infección pasada de infección reciente
 Medida directa de la fuerza de la unión Ag-Ac.
 IgG (Ac) en infecciones recientes (agudas), con baja avidez por
Ag; unión rota si en solución urea
 Alta avidez, infección pasada (>4 meses)
 Baja avidez, infección aguda o reciente

o WESTERN BLOT
 Identificar proteínas específicas mediante técnicas en tres etapas:
 Separación por tamaño
 Transferencia a un soporte sólido
 Visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de Ac primarios o
secundarios apropiados
 Transfiere proteínas víricas separadas por
electroforesis según su peso molecular o su carga a
una membrana
 Cuando se expone al suero del paciente, las proteínas
inmovilizadas capturan los Ac antivíricos específicos
 Se visualizan mediante Ac antihumanos conjugados
con enzimas
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o Ejemplos:
 Infecciones respiratorias: neumococo, Legionella; virus respiratorios, Mycoplasma,
Chlamydia y Coxiella. Infecciones gastrointestinales: Toxina A y B de Clostridium difficile.
Virus (rotavirus, adenovirus, calicivirus y astrovirus). Giardia, Criptosporidium. VIH.
Malaria (inmunocromatografía).
 Pneumocitosis: Pneumocytis carinii. Rickettiosis. Sífilis (inmunofluorescencia).
 Meningitis: meningococo A,B,C, neumococo, H. influenzae y Criptococo (aglutinación).
 Herpesvirus, Parvovirus B19 (enzimoinmunoanálisis, inmunofluorescencia, Western Blot)
 Toxoplasmosis (avidez inmunoglobulina)
 TÉCNICAS GENÉTICAS:
o Aplicación en todos los campos de la Microbiología: bacterias, virus, parásitos, hongos.
o A partir de cepas y muestras
o Técnicas automatizadas, más rápidas
o Dos tipos de técnicas:
 Técnicas de amplificación
 Técnicas de hibridación
o Utilidad:
 Detección e identificación de microorganismos directamente en las muestras clínicas
 Cuantificación del número de virus: carga viral
 Detección de factores de virulencia
 Determinación de resistencia a los antimicrobianos
 Estudios de epidemiología molecular (genotipos)
o PCR:
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR: Polymerase Chain Reaction) es una técnica de
amplificación de secuencias de DNA in vitro
 Permite identificar con alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o investigación científica
 Proceso automatizado mediante el termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos
de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción
 ADN polimerasas replica hebras de ADN
 Se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recién
formadas entre sí tras cada fase de replicación
 Hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente
 Factores a tener en cuenta:
 Cebadores (primers)
 Selección de la Tª de renaturalización
 Concentración de elementos de la reacción (Mg, ADN-polimerasa, dNTP, Primers,
pH)
 Si partimos de ARN, la PCR requiere de un paso previo de transformación del ARN en ADNc
complementario mediante una transcriptasa inversa (DNA-pol-RNA-dependiente)
 Nested-PCR:
 Amplificación fragmento de ADN seguida de
amplificación fragmento interior por cebador
interno
 Ventajas:
o Gran sensibilidad
o Control de la especificidad

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o Dilución de los productos de inhibición

 PCR múltiple:
 Uso simultáneo varios juegos de cebadores para distintos fragmentos de ADN
 Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en un único tubo diferentes
diana, permitiendo la detección de distintos genes de interés.
 PCR a tiempo real o PCR cuantitativa:
 Tiempo muy reducido (30 min)
 Cuantifica ADN que se va formando al mismo tiempo que va teniendo lugar la PCR
 Diversos métodos para la detección mediante colorantes intercalados (SYBR Green,
sondas fluorescentes tipo molecular beacons, TaqManoFRET)
o HIBRIDACIÓN:
 Agregación sondas de ADN (fragmentos ADN pequeño) a las cadenas de ADN
desnaturalizadas, permitiéndose su hibridación (unión) a la secuencia idéntica o casi idéntica
de la muestra
 Las sondas de ADN se
marcan con nucleótidos
radiactivos o modificados
para detectarlas y
cuantificarlas

o Aplicaciones:
 Detección e identificación de virus, bacterias, hongos y parásitos directamente de la muestra
o colonia
 VIH (carga viral y resistencias a antivirales)
 Virus hepatitis (carga viral y genotipo)
 Detección de resistencias a antimicrobianos