CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA Y COLUMNA

Laura Sofía Caicedo 2242661, Diana Paola Morales 2170864, Sebastián Vargas 2241834
Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

Fecha de realización: 20/03/24

Fecha de entrega: 27/03/24

RESUMEN: La cromatografía es una técnica de separación de componentes en mezclas complejas basada en

diferencias moleculares. Utilizando una fase estacionaria y una móvil, se logró separar los componentes según afinidades
y pesos moleculares. Se emplearon dos técnicas: cromatografía de columna (CC) y cromatografía en capa delgada (CCD)
para separar tintes. Se calcularon los factores de retención (Rf) para evaluar la polaridad relativa de los compuestos,
observando diferencias significativas entre etanol y ácido acético como solventes. Para la pureza se empleó de patrón la
mezcla de tintes, en este caso la fluoresceína se logró un Rf de 0,414 en etanol y 0,270 en agua:ácido acético; para el azul
de metileno se obtuvo 0,365 en etanol y 0,463 en agua:ácido acético. Para el azul de metileno puro en etanol y agua:ácido
acético se obtuvo 0,097 y 0,463 respectivamente. Por otro lado, para las marcas de las fracciones obtenidas en CC se
obtuvo para el azul de metileno un Rf de 0,146 en etanol y 0,583 en agua:ácido acético. Para la fluoresceína se obtuvo
0,756 en etanol y 0,536 en agua: ácido acético. En conclusión, se observó que la polaridad del solvente influye en la
separación, con resultados destacados en la CCD gracias a la efectividad de la CC.

PALABRAS CLAVE: Cromatografía, purificación, polaridad, separación, compuestos.

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probable que los compuestos sean similares o idénticos
[4]
1. INTRODUCCIÓN .

La cromatografía se fundamenta en la separación de La cromatografía de capa delgada y de columna se

moléculas en una mezcla mediante su interacción con
una fase estacionaria, ya sea sólida o líquida, mientras se
desplazan a través de una fase móvil [1]. La interacción
entre estas fases y las sustancias de la mezcla es crucial
para la separación. Además de separar las moléculas, la
cromatografía se emplea como método analítico
cuantitativo, buscando lograr una separación eficiente en
un tiempo adecuado. La fase móvil, que lleva consigo la
mezcla, fluye a través de la estructura cromatografía y
retiene el material de la fase estacionaria. Esta última
está fijada en la columna y puede ser polar en la
cromatografía de fase directa o no polar en la fase
inversa [2].
El factor de retención, Rf, es un parámetro cuantitativo
que indica la distancia recorrida por un compuesto en
particular en un solvente específico. Comparar los
valores de Rf entre un compuesto desconocido y uno
conocido puede ayudar a determinar su similitud o
identidad. Si los valores de Rf son cercanos o iguales, es
emplea en múltiples industrias para separar y analizar
diversos compuestos. En la industria farmacéutica, se
utiliza para el desarrollo y control de calidad de
medicamentos. En la industria alimentaria, ayuda a
analizar la composición y calidad de los alimentos. En la
industria química, se utiliza en la síntesis y control de
calidad de productos químicos. También es esencial en
la monitorización ambiental, identificación forense de
sustancias y caracterización de productos petrolíferos en
la industria petroquímica [4].
La cromatografía es una herramienta esencial en la
química y otras disciplinas científicas, ya que su objetivo
es permitir un análisis detallado de las mezclas, facilitar
el seguimiento de reacciones químicas y proporcionar
información valiosa para el desarrollo de procesos y
productos.
2. METODOLOGÍA
Cromatografía de Columna:
Se colocó un poco de algodón en la parte inferior de una
columna de vidrio. Luego se añadió sílica gel hasta una
altura de aproximadamente 4 cm y se agregó una capa
fina de algodón en la parte de arriba. Después, se golpeó
suavemente la columna para compactar bien la fase
estacionaria sin dejar espacios vacíos y se humedeció
toda la columna con etanol continuando con el golpeó
nuevamente para eliminar cualquier burbuja de aire
atrapada. Una vez instalado el montaje se permitió que el
etanol goteara moderadamente y se recogió esta primera
fracción. Cuando el disolvente estuvo a unos 2-3 mm por
encima de la fase estacionaria, se adicionó la mezcla de
tintes disueltos más etanol poco a poco hasta introducirla
completamente en la sílica gel. Se siguió añadiendo
etanol casi hasta llenar la columna y se recogió la
primera fracción coloreada que eluyó. Luego se cambió
el eluyente a una mezcla 1:1 de agua y ácido acético sin
dejar que la columna se secara. Se recogió la siguiente
fracción coloreada que apareció y finalmente, se recogió
la última fracción incolora que salió.
Cromatografía de capa delgada:
Se prepararon dos cámaras, una con etanol y otra con la
mezcla 1:1 de agua y ácido acético. Se trazaron líneas
horizontales a 0,5 cm de los bordes en dos placas de
sílica gel. Se colocaron un punto de la mezcla de tintes
original en un extremo de cada placa y un punto de las
fracciones coloreadas obtenidas en la columna en el otro
extremo. Luego, se introdujo cada placa en su respectiva
cámara con el disolvente por debajo de las manchas
aplicadas. Se permitió que los eluyentes ascendieran por
capilaridad hasta la línea superior trazada en las placas.
Por último, se retiraron las placas para dejarlas secar y se
calculó el Rf para cada mancha coloreada.
3. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS
Se llevo a cabo la siguiente ecuación para hallar el factor
de retención de los compuestos.
Distancia recorrida por el compuesto
Rf = Ec.1
Distancia recorrida por el disolvente
Para calcular el factor de retención, se midió la distancia
recorrida por el disolvente, la cual fue de 4,1 cm para
cada placa y luego se tomaron las medidas del recorrido
de cada compuesto. Los datos se tomaron en la tabla 1.
Tabla 1. Datos de factor de retención en ambos beakers.
4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La cromatografía es una técnica que consiste en la
separación de diferentes componentes en mezclas
complejas, para identificar y determinar las cantidades y
cualidades de los elementos.
Se basa en el principio en el que las moléculas en la
mezcla aplicadas sobre la superficie o en fase
estacionaria sólida, se separan entre sí mientras se
mueven con ayuda de una fase móvil, en el proceso de
separación se incluyen características moleculares
relacionadas con la absorción, partición, afinidad o
diferencias entre sus pesos moleculares, debido a estas
diferencias algunos componentes que se encuentran en la
mezcla permanecen más tiempo en la fase estacionaria y
se mueven lentamente en el sistema, este proceso tiene
una fase estacionaria y una fase móvil [5]. En la fase
estacionaria los componentes de la mezcla están
retenidos en el soporte adecuado, y en la fase móvil, el
compuesto químico fluye hasta arrastrar la muestra,
obligando a atravesar la fase estacionaria.
Se utilizaron para esta práctica dos técnicas,
cromatografía de columna (CC) y cromatografía en capa
delgada (CCD) para separar dos tipos de tintes el tinte A
contenía azul de metileno en etanol y el tinte B era una
mezcla de tintes con fluoresceína, azul de metileno en
etanol. Estas dos técnicas difieren ya que la
cromatografía de capa delgada es una técnica más rápida
y sencilla, la separación de sus componentes se basa en
la diferencia de sus afinidades hacia las fases, permite
rápidamente visualizar la presencia de diferentes
compuestos en una mezcla y proporciona una idea
general del proceso, sin embargo esta técnica tiene
limitaciones en cuanto a su purificación y separación ya
que es más eficiente para muestras pequeñas, por otro
lado la cromatografía por columna tiene una mayor
capacidad de resolución y de procesar cantidades
mayores de muestra, permite separar y purificar
compuestos complejos con una alta eficiencia, los
componentes de la muestra se separan en función de sus
diferencias en la afinidad hacia la fase estacionaria y la
fase móvil, se recolectan en fracciones separadas y
permite una separación y una purificación más eficiente
de los compuestos en cantidades mayores en
comparación a la otra [6].
La cromatografía de columna permite aislar compuestos
de una mezcla, se realiza mediante el uso de una
columna de vidrio el cual en su interior lleva un soporte
sólido adsorbente que actúa como fase estacionaria, para
esta fase se usó sílica, por su capacidad de interactuar
con los compuestos y su porosidad [7]. Se adiciono la
fase móvil, en este caso el etanol, la fase móvil tiene un
factor crucial en este proceso ya que este influye
directamente en la resolución cromatografía, durante la
cromatografía de columna esta fase afecta la pureza y
rendimiento de la fracción recolectada, en la fase móvil
se elige un solvente el cual se usa para transportar la
muestra a través de la fase estacionaria, el solvente debe
tener la capacidad de disolver la muestra y tener en
cuenta propiedades fisicoquímicas como su polaridad
volatilidad, una buena elección es esencial para la
separación de los componentes, una fase móvil
optimizada va a permitir una mejor resolución y
separación de la muestra [8], por otro lado facilita la
recolección completa de las fracciones, este implica la
recuperación de los componentes deseados,
minimizando la contaminación cruzada entre las
fracciones.
Se observo que el tinte se dividió en dos colores, uno
azul y uno amarillo, el tinte de color azul se quedó fijo
mientras el tinte de color amarillo empezaba a
descender, la afinidad de los componentes de la muestra,
y su velocidad de desplazamiento están influenciadas por
la polaridad del disolvente usado, esto indico que los
reactivos fueron convenientes ya que se tenía un
solvente de baja polaridad y un absorbente con alta
actividad, en este caso la sustancia color amarillo
formada por el tinte tenía una polaridad menor en
comparación a la sustancia azul formada por el tinte.
Una vez completada la elución de la sustancia amarilla,
se sustituyó el disolvente por una mezcla de agua-ácido
acético, considerada mucho más polar que el etanol [9],
con una fuerte capacidad de elución, esta combinación
arrastra consigo la muestra la cual ya no se encuentra
unida a la fase estacionaria, permitiendo separar
eficazmente la separación de ambos compuestos.
Posterior a esto, la cromatografía de capa delgada se
emplea para monitorear reacciones químicas, y su
principio se basa en el fenómeno de la capilaridad. En
este procedimiento, un solvente se mueve ascendiendo a
través de una placa de sílica adsorbente, y los
componentes de la mezcla se desplazan a través de la
placa de acuerdo con su polaridad. Los elementos menos
polares tienen una tendencia a avanzar primero, mientras
que aquellos con mayor polaridad lo hacen más
lentamente [10]. Esta separación ocurre debido a las
variaciones en la fuerza de absorción de los
componentes.
Se calculó el factor de retención (Rf), el cual es una
medida que se usa para cuantificar la separación de
componentes en una muestra, cuánto más fuertes sean
las interacciones del analito con la superficie, mayor será
la retención y mayor será el factor de retención, este dato
se puede usar como una herramienta para predecir y
mejorar los resultados obtenidos en la separación por
cromatografía [11], estos valores brindan información
sobre la polaridad relativa de los compuestos, entre
mayor sea el valor del Rf, menor será la polaridad del
compuesto y cuanto más se acerque el valor a 1, más
interacción tendrá con la fase móvil, cuanto más cerca
esté de 0, más interacción tendrá con la fase estacionaria
también se puede usar para evaluar la pureza de los
compuestos después de la purificación ya que si se
observan múltiples manchas en la CCD puede indicar
presencia de impurezas, los datos de Rf pueden
proporcionar información sobre la interacción de los
compuestos con la fase estacionaria. Si los compuestos
tienen valores de Rf muy altos o bajos en una fase
estacionaria particular.
La placa de sílica se utiliza como fase estacionaria, y se
pudo observar una separación o distorsión de los colores,
este fenómeno se debe a que la mezcla de tintes está
compuesta por sustancias de diferente polaridad, a
medida que la fase móvil asciende a través de la placa se
separan por su polaridad, los compuestos más polares
tienen una mayor afinidad por la sílica y se mueven más
lentamente a través de la placa [12].
En la mezcla de tintes, se observó una alteración en los
colores. La primera muestra en aparecer fue la de tinte
azul, que mostró un valor de Rf de 0,365 en etanol y de
0,463 en ácido acético. Esto indica que el etanol es más
polar que el ácido acético, lo que resulta en un
desplazamiento menor del tinte azul en el etanol en
comparación con el ácido acético. Posteriormente, la
muestra de color amarillo mostró un valor de Rf de
0,414 en etanol y de 0,270 en ácido acético. Esto sugiere
que el etanol posee una menor polaridad, lo que resulta
en un desplazamiento mayor del tinte amarillo en el
etanol en comparación con el ácido acético.
El azul de metileno puro en etanol tuvo un valor de Rf
de 0,097 y en ácido acético de 0,463, lo que quiere decir
que es más polar en etanol y por lo tanto tuvo un menor
desplazamiento a comparación del ácido acético. El azul
de metileno puede formar interacciones iónicas y enlaces
de hidrógeno con solventes polares, en este caso el ácido
acético es más polar, lo que resulta en una mayor
solvatación y migración.
La muestra del tinte color amarillo, tomada de la CC,
tuvo un valor de Rf en etanol de 0,756 y en ácido acético
de 0,536; lo que quiere decir que en etanol tiene una
menor polaridad, y un mayor desplazamiento a
comparación que en ácido acético.
La muestra del tinte de color azul, tomada de la CC tuvo
un valor de Rf en etanol de 0,146 y en ácido acético de
0,585, lo que quiere decir que en etanol es más polar a
comparación que en ácido acético, por lo tanto, avanza
más en ácido acético.
Por último, se observó que la marca patrón de
fluoresceína y de azul de metileno tomada de la elución
de la CC se asemeja en la distancia de la fluoresceína y
azul de metileno de la mezcla de tintes como se observa
en la tabla 1, deduciendo que las dos fracciones se
extrajeron con una alta pureza y efectividad.
5. PREGUNTAS
Las preguntas que se respondieron para este informe
fueron las siguientes:
 Compare y contraste la cromatografía de capa
delgada y la cromatografía de columna en
términos de su aplicación práctica en el
seguimiento de reacciones químicas y la
purificación de compuestos orgánicos.
 Discuta la importancia de la selección de la fase
móvil en la resolución cromatográfica durante la
cromatografía de columna y cómo esto afecta la
pureza y rendimiento de la fracción recolectada.
 Discuta los métodos para evaluar el rendimiento
y la pureza de los compuestos separados
mediante cromatografía de columna. ¿Cómo se
pueden utilizar los datos de Rf obtenidos de la
cromatografía de capa delgada para predecir y
mejorar los resultados de separación en
cromatografía de columna?
6. CONCLUSIONES
Se identificó la técnica cromatográfica como una
herramienta fundamental para el seguimiento de
reacciones químicas y separación de mezclas. Además,
se establecieron diferencias entre las distintas técnicas
cromatográficas utilizadas para la purificación de
sustancias orgánicas.
La cromatografía es una técnica invaluable para la
separación y análisis de mezclas complejas. A través de
métodos como la cromatografía de columna y la
cromatografía en capa delgada, se pueden distinguir y
cuantificar los componentes de una muestra según sus
propiedades fisicoquímicas. Mientras que la
cromatografía en capa delgada destaca por su rapidez y
simplicidad, la cromatografía de columna ofrece una
mayor capacidad de resolución y purificación,
especialmente adecuada para muestras más grandes y
complejas. Ambas técnicas tienen sus ventajas y
limitaciones, pero en conjunto proporcionan
herramientas poderosas para los análisis químicos y
bioquímicos en una amplia gama de campos científicos y
aplicaciones industriales.
El factor de retención (Rf) es una medida importante en
cromatografía que indica la polaridad relativa de los
componentes de una muestra y su interacción con la fase
estacionaria y móvil. Valores más altos de Rf indican
una mayor afinidad por la fase móvil, mientras que
valores más bajos sugieren una mayor retención en la ISBN: 958-41-0132-3.
fase estacionaria. En la cromatografía de capa delgada
con sílica como fase estacionaria, se observó una [9] Chang, R., & K, Goldsby (2013). Química. 11a ed.
separación de colores debido a las diferencias de McGraw-Hill. Santa Fe, México. p.p 531-536. ISBN:
polaridad de los componentes de la mezcla de tintes. 978-607-15-0928-4.

El análisis del Rf proporcionó información valiosa para [10] Bele, A. A., & Khale, A. (2011). An overview on
comprender y optimizar los procesos cromatográficos, thin layer chromatography. International journal of
tanto para la separación como para la purificación de pharmaceutical sciences and research, 2(2), 256. DOI:
compuestos. http://dx.doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.2(2).256-
67.
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