CROMATOGRAFÍA

MÉTODOS DE SEPARACIÓN
MÉTODO FUNDAMENTO

1. SEPARACIÓN DE FASE MECÁNICA

a) Precipitación y filtración
b) Destilación
c) Extracción
d) Intercambio iónico
Diferencia de solubilidad entre los compuestos formados
Diferencia de volatilidad entre los compuestos
Diferencia de solubilidad en dos líquidos inmiscibles
Diferencia en interacción de los reactivos con una resina de intercambio
iónico

2. CROMATOGRAFÍA Diferencia en la velocidad de movimiento de un soluto a través de una

fase estacionaria

3. ELECTROFORESIS Diferencia en la velocidad de migración de especies químicas con carga

eléctrica en un campo eléctrico

4. FRACCIONAMIENTO EN CAMPOS DE Diferencia en la interacción con un campo o gradiente aplicado de

FLUJO manera perpendicular a la dirección de transporte
¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?
Grupo de técnicas analíticas utilizadas en la determinación
de la identidad de especies químicas, la separación de
componentes de una mezcla compleja y la purificación de
compuestos.
Cada analito tiene un rastro distinguible que permite la
detección de su señal particular.
Puede variar de técnica en técnica, pero siempre se basa en
el mismo principio:

TODOS LOS SISTEMAS DE CROMATOGRAFÍA CONTIENEN UNA

FASE ESTACIONARIA Y UNA FASE MÓVIL
El proceso cromatográfico son repetidos procesos de sorción (una sustancia se adhiere a otra) –
desorción (una sustancia se libera desde o a través de una superficie) durante el movimiento de
los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria
(elución), produciéndose la separación debido a las diferencias en las constantes de
distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil.
A la distribución final de los componentes en función de su posición sobre el lecho estacionario,
o del tiempo que le toma eluirse se le denomina CROMATOGRAMA
Principios básicos de una separación

Las metas de la separación analítica suelen ser eliminar o reducir las interferencias a fin de
obtener información analítica cuantitativa a partir de mezclas complejas.
La información obtenida se analiza basándose en la Transformada de Fourier, que es una
transformación matemática empleada para transformar señales entre el dominio del tiempo (o
espacial) y el dominio de la frecuencia.
Las separaciones también permiten la identificación de los componentes separados si se
llevan a cabo las correlaciones apropiadas o si se utiliza una técnica de medición
estructuralmente sensible que puede llegar al nivel de la relación m/z (masa/carga).

MS
GC-MS/MS
FT-ICR-MS
TOF-TOF
IT-TOF
QQQ
CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA-THIN LAYER
CHROMATOGRAPHY (TLC)
La TLC es un método de separación muy versátil
que se utiliza ampliamente para el análisis
cualitativo y cuantitativo de las muestras.
Se basa en el principio clásico de la cromatografía
según el cual, los componentes de una mezcla se
separan entre una fase fija estacionaria y una fase
móvil líquida por afinidades diferenciales entre las
dos fases.
Suele utilizarse para analizar sustancias del tipo:
plaguicidas, esteroides, alcaloides, lípidos,
nucleótidos, glucósidos, carbohidratos y ácidos
grasos.
Placa cromatográfica dentro de una cámara de
elución. El eluyente no debe rebasar en su altura la
línea donde habrá de aplicarse la muestra

En la TLC, la fase estacionaria es una fina capa de

material adsorbente, normalmente gel de sílice u
óxido de aluminio, que recubre una superficie de
placa inerte, normalmente vidrio, plástico o
aluminio. Se deposita una pequeña cantidad de la
muestra en un extremo de la placa de TLC, que se
coloca verticalmente en una cámara cerrada con
un disolvente orgánico (fase móvil).
 La elección del eluyente depende del
componente a separar y del material en que la
separación se lleva a cabo

Principales eluyentes en orden creciente de

polaridad:
• Éter de petróleo
En la elección del eluyente influyen varios factores: • Éter dietílico
• Precio. • Ciclohexano
• Pureza. • Tetracloruro de carbono*
• Volatilidad. • Acetato de etilo
• Presencia de trazas de metales (catalizadores). • Piridina*
Se debe estudiar la polaridad del componente y probar • Cloroformo*
• Diclorometano*
con eluyentes cada vez más polares. • Benceno*
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, • Etanol
• Metanol
podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar • Agua
otros eluyentes más polares, hasta dar con el más • Ácido acético
*COMPUESTOS CANCERIGENOS
apropiado.
La fase móvil se desplaza hacia arriba en la placa por capilaridad y los componentes de la muestra

migran distancias variables en función de sus afinidades diferenciales por las fases estacionaria y

móvil.

Cuando el disolvente llega a la parte superior de la placa, ésta se retira de la cámara de desarrollo y se

seca. Los componentes separados aparecen como puntos en la placa, y se evalúa el factor de

retención (RF) de cada componente.

El factor de retención (Rf) se utiliza para medir el movimiento de los
compuestos a lo largo de la placa de TLC.
Se define como la distancia recorrida por un componente dividido por la
distancia total recorrida por el disolvente. Su valor se encuentra siempre
entre cero y uno.

𝐝𝐢𝐬𝐭𝐚𝐧𝐜𝐢𝐚 𝐫𝐞𝐜𝐨𝐫𝐫𝐢𝐝𝐚 𝐩𝐨𝐫 𝐞𝐥 𝐜𝐨𝐦𝐩𝐨𝐧𝐞𝐧𝐭𝐞

𝐑𝐟 =
𝐝𝐢𝐬𝐭𝐚𝐧𝐜𝐢𝐚 𝐫𝐞𝐜𝐨𝐫𝐫𝐢𝐝𝐚 𝐩𝐨𝐫 𝐞𝐥 𝐝𝐢𝐬𝐨𝐥𝐯𝐞𝐧𝐭𝐞
EL REVELADO
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos
compuestos, para ello existen dos tipos de métodos.

QUIMICOS: Reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para lo cual se rocía la
placa con los reactivos reveladores.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, que forma complejos coloreados con los componentes
orgánicos (con tonos amarillo-marrón)

Tambien se usa ácido sulfúrico, que reacciona con los

componentes orgánicos produciendo manchas negras tras ser
carbonizadas. Mientras que el permanganato potásico deja
manchas de color amarillo.
El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad
de componente separado.
Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:
• 2,4-dinitrofenilhidracina (para aldehídos y acetonas).
• Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
• Para-dimetilaminobenzaldehido (para aminas).
• Ninhidrina (para aminoácidos).

FISICOS: El más común consiste en añadir al absorbente un indicador fluorescente, de tal forma que, al colocar
la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas
fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta

fluorescencia (aunque no es normal) con
lo que pueden ser detectados
directamente en una lámpara de
ultravioleta.
Aplicaciones de la TLC
La TLC se utiliza ampliamente en muchas industrias y campos de investigación, como los
farmacéuticos, ensayos clínicos, toxicología medioambiental, alimentos, análisis del agua y de
plaguicidas/pesticidas y en la industria cosmética. Las aplicaciones habituales de la TLC son:

•Análisis de residuos farmacológicos y de antibióticos en muestras alimentarias y

medioambientales
•Identificación y cuantificación de colores, ingredientes, conservantes y edulcorantes en
alimentos y cosméticos
•Control de calidad y ensayos de pureza de formulaciones farmacéuticas
•Cribado rápido, de gran rendimiento antes de la HPLC
•Examen de finalización de reacciones químicas
CROMATOGRAFÍA EN FASE
SÓLIDA - SOLID PHASE
CHROMATOGRAPHY (SPC)
La SPC está diseñada para la preparación y la purificación rápida y selectiva de muestras en pequeño
volumen donde se aíslan uno o más analitos de una muestra líquida extrayendo, separando o
adsorbiendo en una fase estacionaria sólida, en ocasiones de manera preparativa para una
cromatografía más compleja como HPLC, GC, MS, TOF, QQQ, etc.
Una SPC cambia la matriz original de una muestra a un entorno de matriz más sencilla, esto hace que
sea más adecuada para la cromatografía analítica posterior y con frecuencia simplifica y mejora el
análisis cualitativo y cuantitativo final.
Un procedimiento óptimo puede permitir:
• Cambiar las matrices de muestra para que
sean más compatibles con el método
ACTIVACIÓN MUESTRA LAVADO ELUCIÓN
cromatográfico deseado.
• Concentrar los analitos (enriquecimiento de
trazas) para aumentar la sensibilidad.
• Eliminar las interferencias que provocan un
elevado ruido de fondo, picos erróneos o
poca sensibilidad durante el análisis
cromatográfico.
• Proteger la columna analítica de los
contaminantes.
• Automatizar el proceso de extracción.
La extracción en fase sólida utiliza membranas o pequeñas columnas de
barril-jeringa o cartuchos desechables.

El dióxido de silicio o sílice en polvo es recubierto o enlazado

químicamente con un compuesto orgánico hidrofóbico para formar la
fase sólida de la fase extractora.

Los compuestos pueden ser no polares, moderadamente polares o

polares. Por ejemplo, un agente empacante común es la sílice unida a un
octadecil (C18).

Los grupos funcionales unidos al empacante atraen compuestos

hidrofóbicos en la muestra por medio de interacciones de van der Waals o
por la extracción de la disolución acuosa.
La SPC es selectiva y versátil, ya que se dispone de
muchos adsorbentes y condiciones de elución
diferentes para diferentes analitos y matrices.
Entre los adsorbentes habituales estan:

• Con contenido de sílice

o Fase inversa (C18, C8, de ciano, fenil)
o Fase normal (sílice, diol, NH2)
o Intercambio iónico (SAX, WCX, SCX)
• Con contenido de carbono
• Con contenido de polímeros
• Florisil® (silicato de magnesio) o alúmina
• Lecho mixto: Combinaciones de casi cualquiera
de los anteriores en capas secuenciales
 Se elimina el exceso del disolvente de Se consigue utilizando un disolvente que
Introducción de la muestra en el anule las interacciones entre el adsorbente
acondicionamiento y el relleno del cartucho cartucho que contiene el
es tratado con una disolución similar a la y dicho analito.
adsorbente acondicionado y que El disolvente empleado deberá tener la
matriz de la muestra (en condiciones de permite que los analitos de interés
polaridad, pH, etc.). Con este equilibrado máxima interacción con el analito y una
sean retenidos en el relleno interacción mínima con algunos
conseguimos maximizar la retención del
analito en el adsorbente. interferentes que podrían haber quedado
atrapados en el adsorbente.

Pre-tratamiento de la
muestra:
ajuste del pH, centrifugación,
filtración, dilución, etc.
Los analitos son retenidos en el
material adsorbente y se lleva a
cabo una elución secuencial de
los distintos analitos, por
modificación de pH o de la
proporción de disolvente orgánico
del eluyente

Acondicionamiento, donde se pasa el En el lavado se eliminan selectivamente

disolvente a través del cartucho que contiene el
relleno, con el objetivo de eliminar cualquier
posible impureza y solvatar el adsorbente. Esta
etapa permitirá al adsorbente interactuar de
forma más efectiva con el analito objetivo.
las interferencias no deseadas, que no se
han unido al adsorbente pero que
permanecen en el cartucho. Se debe de
cuidar de no eluir el analito de interés.
Aplicaciones de la SPC
Se utiliza con frecuencia en las industrias farmacéutica, clínica y de diagnóstico de alto
rendimiento, forense, medioambiental y alimentaria/agroquímica para análisis relacionados con:

• Compuestos farmacéuticos y metabolitos en líquidos biológicos

• Drogas en los líquidos biológicos
• Contaminantes medioambientales en el agua potable y las aguas residuales
• Plaguicidas, antibióticos o micotoxinas en matrices alimentarias/agrícolas
• Desalado de proteínas y péptidos
• Fraccionamiento de lípidos
• Vitaminas hidrosolubles y liposolubles
Cromatografía de intercambio iónico - Immobilized Metal Affinity
Chromatography (IMAC)
Separación de moléculas según su carga, usada comúnmente para purificar proteínas, péptidos,
aminoácidos o nucleótidos.
Dependiendo de la carga neta de las moléculas a separar, la fase estacionaria debe seleccionarse
en consecuencia. Al ser las muestras mezclas de diferentes compuestos con diferentes cargas, se
usa un gradiente de tampón para eluir cada compuesto diferente por separado
Resinas de intercambio iónico
Las resinas de intercambio iónico sintéticas son polímeros de alta masa molecular que
contienen grandes números de un grupo funcional iónico por molécula.
Hay dos tipos básicos de resinas:

Resinas de intercambio de cationes emiten iones hidrogeno [H+] u

otros iones como intercambio por cationes impuros presentes en el
agua

Resinas de intercambio de aniones despedirá iones hidroxilo [OH-] u

otros iones de carga negativa en intercambio por iones impuros
presentes en el agua
 CROMATOGRAFÍA EN
COLUMNA - COLUMN
CHROMATOGRAPHY (CC)
Método cromatográfico usado para aislar un único compuesto químico de una mezcla.
Esta técnica es ampliamente aplicable, ya que muchos adsorbentes diferentes (en fase normal, en
fase reversa u otras) pueden usarse con una amplia gama de solventes.
La cromatografía en columna puede llevarse a cabo usando la gravedad para mover el solvente, o
usando gas comprimido para empujar el solvente a través de la columna.
La "fase estacionaria" o "adsorbente" usado en
cromatografía en columna es un compuesto
sólido no polar, moderadamente polar o polar.
Por ej, el gel de sílice, seguida por la alúmina
(oxido de aluminio) o el sílice unido a un octadecil
(C18).
Los grupos funcionales unidos al empacante
atraen compuestos hidrofóbicos en la muestra
por medio de interacciones de van der Waals o por
la extracción de la disolución acuosa.
• Se activa la fase sólida para asignarle polaridad.
• La muestra (moléculas) se coloca en el cartucho y se adhiere a la
fase sólida.
• Se forman las interacciones entre moléculas y fase sólida,
dependiente de la afinidad de cada componente de la mezcla.
• Estas moléculas pueden ser desplazadas de la fase sólida
utilizando una fase móvil, normalmente en gradiente.
• El arrastre en cada punto del gradiente fraccionara en grupos las
moléculas de la muestra.
• Las fracciones se recuperan para análisis e identificación.
• Comúnmente las fases solidas se pueden reutilizar siempre y
cuando se laven y mantengan en condiciones idóneas.
La "fase móvil" o "eluyente" es un solvente o mezcla de solventes
usados para mover los compuestos a través de la columna. Se elige
de tal forma que el valor del factor de retención del compuesto de
interés sea aproximadamente de entre 0.2 y 0.3, con el fin de
minimizar el tiempo y cantidad de eluyente necesarios para realizar
la cromatografía.
Para cada separación concreta existe una velocidad de flujo
óptima. Un flujo más rápido del eluyente minimiza el tiempo
necesario para recorrer una columna, reduciendo así al mínimo la
difusión, y resultando en una mejor separación. Sin embargo, existe
un límite para la velocidad de flujo máxima, ya que se requiere un
tiempo finito determinado para que el analito alcance el equilibrio
entre las fases estacionaria y móvil.
La curva de cromatograma típica se aproxima como una curva de
distribución Gaussiana.
Cuanto mayor sea la resolución del cromatograma, mejor será el grado de
separación de las muestras que nos proporciona la columna.
Las curvas separadas en el diagrama representan diferentes perfiles de
concentración de elución de muestra a lo largo del tiempo, en función de
su afinidad con la resina de la columna.
Para calcular la resolución, se requieren el tiempo de retención y el ancho
de la curva.
El tiempo de retención es el tiempo transcurrido desde que la señal es
detectada por el detector hasta que el perfil de concentración de la elución
alcanza su punto máximo, para cada una de las diferentes muestras.
El ancho de la curva es el ancho de la curva del perfil de concentración de
cada muestra en el cromatograma, en unidades de tiempo.
 Un método simplificado para el cálculo de la
resolución del cromatograma consiste en
usar el modelo de platos.
El modelo de platos asume que la columna
puede ser dividida en un cierto número de
secciones o platos, y que el equilibrio de
masas puede ser calculado para cada plato.

El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de la detección de señal hasta que se alcanza el
punto máximo de la curva de Gauss.

A partir de las variables de la figura anterior, la resolución, el número de plato y altura del plato en el
modelo de platos de la columna se pueden calcular mediante las siguientes ecuaciones:
 𝐑𝐞𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 (𝐑 𝐬 )

𝟐(𝐭 𝐑𝐁 − 𝐭 𝐑𝐀 ) 𝟐
𝐭𝐑 𝐋
𝐑𝐬 = 𝐍= 𝟐 𝐇=
𝐖𝐁 + 𝐖𝐀 𝐖 𝐍
Donde:
𝟒
tRB = tiempo de retención del soluto B
tRA = tiempo de retención del soluto A
WB = ancho de la curva de Gauss para el soluto B
WA = ancho de la curva de Gauss para el soluto A
N = número de plato
H = altura del plato
L = longitud de la columna
CALIBRACIÓN, CUALIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
Las moléculas de referencia son sustancias o materiales con
valores homogéneos y bien establecidos de una o más de sus
propiedades.
Garantizan la precisión de las mediciones mediante la
calibración del método, la validación de una técnica/protocolo
especifico, la estimación de la incertidumbre de las
mediciones o la asignación de valores a los materiales.
Las moléculas de referencia son un componente crucial de la
dinámica de trabajo de los estudios analíticos y de los
esquemas de gestión de calidad más amplios.
La gran mayoría de las sustancias de referencia son de origen sintético, por lo que prácticamente no
contienen isómeros.
Su ensayo es generalmente superior al 99% y normalmente superior al 99.5%, es decir son
moléculas con una elevada pureza.

Las sustancias de referencia del tipo de los

hidrocarburos se envasan en ampollas
perforables. Los ésteres metílicos de ácidos
grasos y otras sustancias de referencia se
suministran en viales de vidrio con tapa de
rosca; y en general se usan materiales
totalmente inertes y que prolongan la vida útil y
estabilidad de las moléculas.
El uso de patrones de referencia externos e internos garantizan una cuantificación fiable.

Cuando se hacen correr los patrones conocidos por separado de la muestra real y la
respuesta se compara con la de la muestra en otro cromatograma, se le denomina patrón de
referencia externo.

Cuando se añade el patrón a la muestra y se analiza simultáneamente, se denomina un

patrón de referencia interno.
SELECCIÓN DE MATERIALES DE REFERENCIA SEGÚN EL PROPÓSITO DE LAS PRUEBAS
TIPO DE PRUEBA USO DE MAT. DE REF. EJEMPLOS REQUISITOS

Cualificación/calibración Establecer el rendimiento del sistema Cualificaciones anuales Trazable

del instrumento Precisión de la medición Calibraciones habituales de la balanza

Calibración Diaria/Semanal Calibraciones de la balanza antes de utilizarla Calificación de idóneo

habitual/idoneidad del Específica del sistema o del método Comprobaciones de rendimiento del sistema para para utilizar
sistema Establecimiento sistemático del LC-UV/MS; GC-FID...
rendimiento

Validación del método Exactitud Control de calidad farmacológico; pruebas Preciso

Precisión medioambientales Trazable
Especificidad e interferencias Patrones de los analitos, interferencias e impurezas
LOD/LOQ y linealidad

Identidad Materias primas entrantes en farmacología,

Comparación de desconocido a
alimentos, etc. Autenticidad
conocido
Pruebas de detección

Contenido o valoración Cuantificación de analitos Límites de plaguicidas/toxinas Certifica el contenido

Control de calidad farmacéutica - contenido de API Trazable

Evaluación de la Control de la estabilidad del producto Control de calidad farmacéutica Estables, homogéneos
estabilidad

Control de calidad interno Precisión del método Cuantificación sistemática de analitos: productos Contenido certificado
farmacéuticos/plaguicidas/diagnósticos Trazable
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES - GAS
CHROMATOGRAPHY (GC)
La GC es una técnica de separación para determinar los diferentes componentes de
una muestra compleja formada por compuestos volátiles y/o semivolátiles.

Se basa en la partición del analito entre una fase móvil en forma de gas inerte y una fase
estacionaria que suele ser o un adsorbente empacado o un líquido adsorbido sobre un
soporte inerte, ambos dentro de una columna o tubo capilar.
El límite de uso depende de la estabilidad térmica de los compuestos a separar, por lo

general deben tener un peso molecular de menos de 1000 kDa a una temperatura

máxima de trabajo de aproximadamente 400 °C.

Se inyecta una pequeña muestra en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura para
vaporizarla.
La corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separa los componentes de la mezcla
por medio de un mecanismo de partición, fragmentado en función de la afinidad a la columna y la
longitud de la misma.
Los componentes ya separados, emergen de la columna a intervalos, según se retención, para pasar
por un sistema de detección.
Gas transportador
Al gas de la fase móvil debe ser químicamente inerte
para transportar los componentes de la muestra y
crear una matriz adecuada para el detector.
El helio es la fase móvil más común, aunque también
se utiliza argón, nitrógeno e hidrógeno.

Las velocidades de flujo en los cromatógrafos de gases se regulan controlando la presión de

entrada del gas. Por lo general, las presiones de entrada van de 10 a 50 psi (lb/in2) por encima
de la presión ambiental, dando velocidades de flujo de 25 a 150 mL/min con columnas
empacadas y de 1 a 25 mL/min con columnas tubulares abiertas.
Sistema de inyección
Se utilizan microjeringas calibradas. Carga mínima de 1 μL y máxima de 20 μL
Una muestra de tamaño adecuado debe ser introducida como un “tapón” de vapor.
Una inyección lenta o muestras de gran tamaño provocan ensanchamiento de banda y
pobre resolución.
El puerto de la muestra generalmente se mantiene a alrededor de 50 ºC por encima del
punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra.
Columna y hornos de columna
Las columnas en la cromatografía de gases son de dos tipos generales: empacadas o capilares.
La longitud va desde menos de 2 m hasta 60 m o más; de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o
teflón. Usualmente se arreglan como bobinas que tienen diámetros de 10 a 30 cm.
La temperatura se debe controlar en unas pocas décimas de grado para un trabajo preciso.

La temperatura óptima de una columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de
separación requerido.
Una temperatura igual o ligeramente por debajo del punto de ebullición de una muestra resulta en un
tiempo de elución razonable (de 2 a 30 min).

Cuando los analitos de una mezcla tienen diferentes

puntos de ebullición, se usa una rampa de temperatura
que va aumentando ya sea de forma continua o por
etapas.
Efecto de la temperatura sobre
cromatogramas de gases
Una temperatura igual o ligeramente por debajo del punto
de ebullición de una muestra resulta en un tiempo de
elución razonable (de 2 a 30 min).
La resolución óptima está asociada con la temperatura
mínima.
El costo de disminuir la temperatura es un aumento en el
tiempo de elución.

a) Isotérmico a 45 ºC (T° constante).

b) Isotérmico a 145 ºC.
c) Programado de 30 hasta 80 ºC (en rampa).
Detectores cromatográficos
✓ Sensibilidad adecuada. Entre 10–8 a 10–15 g soluto/s.

✓ Buena estabilidad y reproducibilidad.

✓ Respuesta lineal a los solutos, que se prolonga a lo largo de varios órdenes de magnitud.

✓ Intervalo de temperatura que va desde temperatura ambiente hasta al menos 400 ºC.

✓ Tiempo de respuesta corto, independiente de la velocidad del flujo.

✓ Alta confiabilidad y facilidad de uso.

✓ Similitud en la respuesta para todos los solutos o, de manera alternativa, una respuesta

altamente predecible y selectiva hacia una o más clases de solutos.

✓ No debe destruir la muestra.

Los detectores monitorizan la corriente que se produce al captar las cargas.
Se mide la corriente en función de la presencia del número de átomos de C por unidad de
tiempo, de modo que es un dispositivo sensible a la masa.
TIPO SISTEMAS APLICABLES LIMITE DE DETECCIÓN
TIPICO
Ionización de flama Hidrocarburos 1 pg/s
Conductividad térmica Detector universal 500 μg/mL
Captura de electrones compuestos halogenados 5 fg/s
Espectrómetro de masas (MS) Ajustable para cualquier especie 0.25 a 100 pg
Termoiónico Compuestos de nitrógeno y fósforo 0.1 pg/s (P)
1 pg/s (N)
Conductividad electrolítica (Hall) Compuestos que contienen halógenos, 0.5 pg Cl/s
azufre o nitrógeno 2 pg S/s
4 pg N/s
Fotoionización Compuestos ionizados por radiación UV 2 pg C/s
Transformada de Fourier IR (FTIR) Compuestos orgánicos 0.2 a 40 ng
Detector de ionización de flama
El efluente de la columna es dirigido a una pequeña flama
de aire/hidrógeno.
Se producen iones y electrones cuando se pirolizan
(degradación térmica de una sustancia en ausencia de
oxígeno).
Los compuestos son detectados al monitorear la
corriente producida al colectar los iones y los electrones.
Para colectar los iones y los electrones se aplican unos
cuantos cientos de volts entre la punta del quemador y el
electrodo colector localizado sobre la flama.
Un detector de conductividad térmica consiste en una fuente calentada eléctricamente cuya
temperatura, a energía eléctrica constante, depende de la conductividad térmica del gas
circundante.
El elemento calentado puede ser un filamento de platino, oro o tungsteno. La resistencia
eléctrica de este elemento depende de la conductividad térmica del gas.
Cuando se eluye una sustancia mezclada con el gas portador, la conductividad térmica varia, y
como consecuencia se produce un cambio de temperatura en el sensor; el cambio de
temperatura se traduce en una variación de una señal eléctrica que se amplifica y registra.
COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS
Las columnas se seleccionan de acuerdo s su polaridad.
Lo semejante disuelve lo semejante, es decir, una fase estacionaria polar interactúa más con
compuestos polares y viceversa.
Tipos de columnas
Tipos de columnas tubulares abiertas
recubiertas con diferentes polímeros
(macromoléculas formadas por unión de
enlaces covalentes):
a) Polidimetil siloxano
b) 5% (fenilmetildimetil) siloxano
c) 50% (fenilmetildimetil) siloxano
d) 50% poli(trifluoropropildimetil) siloxano
e) Polietilenglicol
f) 50% poli (cianopropildimetil) siloxano
Fases estacionarias líquidas
1. Baja volatilidad (idealmente, el punto de ebullición del líquido debe ser por lo menos 100 °C

superior a la temperatura máxima de funcionamiento de la columna).

2. Estabilidad térmica.

3. Químicamente inerte.

4. El tiempo de retención para un analito en una columna depende de su constante de

distribución, la cual a su vez está relacionada con la naturaleza química de la fase

estacionaria líquida.

5. El analito debe mostrar un grado de compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria.

Se muestran las fases estacionarias más ampliamente utilizadas tanto para columnas
empacadas como para tubulares abiertas, en orden creciente de polaridad, que pueden
proporcionar separaciones satisfactorias para el 90% o más de las muestras.
En la elución los solutos son lavados a través de la fase
estacionaria

Existen dos modalidades de elución:

• Isocrática: las condiciones cromatográficas permanecen

constantes durante la separación (flujo y composición).

• En gradiente: las características de la elución se van

modificando durante la separación. Con ello puede
conseguirse una mejor resolución de mezclas
complejas.
Aplicaciones de la GC

Análisis ambiental: En el control de contaminantes ambientales como los dibenzofuranos, dioxinas,

herbicidas, azufre, pesticidas, fenoles y clorofenoles en aire, suelo y agua.

Análisis de alimentos: Para detección del deterioro o la contaminación de alimentos, en el análisis

de una amplia gama de aceites como el de lavanda, oliva, menta verde y aceites esenciales,
perfumes, fragancias, alérgenos, mentol y jarabes.

Farmacéutica: En investigación y desarrollo, producción y control de calidad, identificando

impurezas en ingredientes farmacéuticos activos.

Aplicaciones industriales: Para el análisis de gases inorgánicos y solventes aromáticos, detección

de impurezas y alérgenos en cosméticos, y en la síntesis de acetato de celulosa, polietileno,
polivinilo y fibras sintéticas.
¿QUÉ COMPONE A UN CROMATOGRAMA?
El tiempo muerto, tM, (tiempo vacio), es el tiempo que le toma a una especie
quimica no retenida atravesar una columna cromatográfica, proporciona una
medida de la velocidad de migración promedio de la fase móvil.
El tiempo de retención, tr, es el tiempo entre la inyección de la muestra y la
aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica.
Análisis cualitativo
La cromatografía de gases permite establecer la
pureza de compuestos orgánicos.
Los contaminantes, cuando están presentes, se
revelan por la presencia de picos adicionales en el
cromatograma.
El área bajo la curva de estos picos extraños
proporciona estimaciones aproximadas del grado
de contaminación.
La técnica también es útil para evaluar la eficiencia
de los procesos de purificación.
Análisis cuantitativo
Técnica veloz, simple, bajo costo relativo, amplia
aplicabilidad en las separaciones y alta capacidad de
proporcionar información acerca de las especies
separadas.
Se basa en la comparación de la altura o el área de un
pico de un analito contra uno o más estándares que se
prepara una serie de disoluciones que se aproximan a
la composición de la muestra desconocida, lo que
permite obtener gráficos y ecuaciones de la recta con
los cuales hacer cálculos.
¿Cómo se puede influir sobre la separación?
Muestra idéntica analizada con diferentes fases estacionarias (fases ligadas de silanos
monofuncionales patentados – análogo del metano, derivado del silicio, SiH4), pero con la misma
temperatura, fase móvil y gradiente.
Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y temperatura, pero con
diferentes fases móviles a diferente pH (mismo gradiente).
Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y fase móvil, pero con diferentes
temperaturas (mismo gradiente).
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN – HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
La HPLC hace uso de alta presión (alrededor de
7000 psi/400 bares) para generar el flujo necesario
en la separación de moléculas pequeñas capaces
de solubilizarse en un líquido.
Consiste en una fase estacionaria empacada
(columna) con tamaño de partícula de alrededor de
1.5 - 5 micras y el flujo a presión de una fase móvil.
La muestra se fragmenta en la columna de acuerdo
a las interacciones no-covalentes de los
compuestos y su afinidad por la resina de la
columna.
La fase móvil arrastra la muestra por interacciones
químicas.
En 2004, se produjeron nuevos avances en los
instrumentos y la tecnología de las columnas para
lograr aumentos muy significativos en la resolución, la
velocidad y la sensibilidad de la cromatografía líquida.
Fueron necesarias columnas con partículas más
pequeñas (0.2 - 1.7 micras) e instrumentos con
capacidades especializadas diseñados para
suministrar la fase móvil a alrededor de 15 000 psi/1000
bares para alcanzar un nuevo nivel de rendimiento.
Por lo que se creó un nuevo sistema de manera integral
para realizar la cromatografía líquida de ultra-alta
resolución, ahora conocida como tecnología UPLC.
VENTAJAS
✓ Amplio rango de aplicabilidad debido a la alta disponibilidad de equipos, columnas y demás materiales.

✓ Alta precisión en sus resultados (±0.5 % o menor).

✓ Variedad de técnicas, entre las cuales están la cromatografía por partición, adsorción, intercambio iónico
y exclusión molecular.

✓ Fácil manipulación de los gradientes generados en la fase móvil.

✓ No es destructiva, es decir, los compuestos separados en la columna pueden ser recuperados.

✓ Tiempo de separación menor a 30 min por muestra analizada.

✓ Alta reproducibilidad en los análisis cuantitativos.

✓ Alto poder de separación con detección sensible.

✓ La operación es flexible, personalizable y automatizada.

✓ No está restringida por la volatilidad o estabilidad térmica de la muestra.

Las principales fuerzas que actúan en las moléculas son:
✓ Las fuerzas de dispersión de London (multipolos temporales)
✓ Las interacciones dipolo
✓ Las interacciones por puente de hidrógeno
✓ Interacciones dieléctricas
✓ Interacciones electroestáticas

Este método tiene cinco pasos:

✓ Evaluar la composición de la muestra y determinar las metas de separación
✓ Pretratamiento de la muestra
✓ Selección del modo de operación y el tipo de HPLC
✓ Selección del detector
✓ Selección de las condiciones de separación
 COMPONENTES
Reservorios de fase móvil
Para lavado y elución de muestras, conectado a un sistema de tratamiento de disolventes:
generalmente desgasificador para remover los gases disueltos y el polvo de los líquidos.

El burbujeo es un proceso en el que los gases disueltos se eliminan de un disolvente por medio de
burbujas de un gas inerte e insoluble.
Fase móvil
La fase móvil (eluyente) se mueve a través de un
sistema de bombas que proporcionan alta presión
para generar un caudal especifico en mL/min.
La utilización de presión incrementa la velocidad
lineal de los compuestos dentro de la columna y
reduce así su difusión dentro de la misma,
mejorando la resolución de la cromatografía.
Los disolventes más utilizados son el agua, metanol
y acetonitrilo. El agua puede contener tampones,
sales o compuestos como el ácido trifluoroacético,
que ayudan a la separación de los compuestos.
La elución isocrática en es aquella en la cual la
composición de disolvente permanece constante.
La elución en gradiente suele mejorar la eficiencia
de separación (reduce el tiempo de retención), de la
misma manera en que programar la temperatura
ayuda en la cromatografía de gases.
Por ejemplo, una elución en gradiente puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de
forma lineal hasta un 50% en 25 minutos.
El gradiente utilizado varía en función de la
hidrofobicidad del compuesto.
Sistema de bombeo

Hay que tener en cuenta que se utilizan tubos y conectores de

alta presión para interconectar los componentes de la bomba, el

inyector, la columna y el detector para formar el conducto para

la fase móvil, la muestra y las bandas compuestas separadas.

1) La generación de presiones de más de 6000 psi

2) Salida libre de pulsos

3) Velocidades de flujo de 0.1 a 10 mL/min

4) Reproducibilidades de flujo relativas de 0.5% o mejores

5) Resistencia a la corrosión por una variedad de

disolventes
Sistemas de inyección de muestras

Tamaño de muestra en un intervalo que va de 1 a 100 μL

Uso de jeringas peristálticas
Sistema de purga para evitar entrada de aire a la columna y para
recuperación de la muestra posterior al análisis
Columnas
Cuando la muestra entra en la trayectoria del flujo,
la fase móvil transporta la muestra hasta la
columna, donde se produce la separación.

Pueden funcionar a temperatura ambiente, pero

generalmente se controlan mediante termostato y
se guardan dentro de un compartimento de columna
con control de temperatura. Es esencial un control
adecuado de la temperatura de la columna para
mantener la precisión del tiempo de retención, la
selectividad y la eficacia de separación.
Hardware para columnas de HPLC
El tubo de la columna y los conectores deben contener el material de relleno cromatográfico (fase
estacionaria) que se utiliza para realizar la separación.
Debe soportar la contrapresión creada tanto durante la fabricación y el uso, además, debe
proporcionar una trayectoria de flujo bien controlada (sin fugas, con un volumen mínimo y sin volumen
muerto) para la muestra en su entrada y las bandas de analito en su salida, y ser químicamente inerte
en relación con el sistema de cromatografía (fases de muestra, móvil y estacionaria).

Longitud de columna y potencia de separación Tamaño de partícula y potencia de separación

mecánica (mismo tamaño de partícula) mecánica (misma longitud de columna)
La composición química de la fase estacionaria
dicta la afinidad de los componentes de la
muestra a la hora de pegarse o conservarse en la
columna según la fase móvil va empujando la
muestra a través de la columna.

Como resultado, los componentes de la muestra

atraviesan la columna y eluyen a diferentes
velocidades.

Como regla general, a medida que aumenta la temperatura de la

columna, disminuye la retención de los analitos, lo que conlleva una
separación más rápida.
¿Cómo elegir la columna de HPLC adecuada?
✓ Propiedades fisicoquímicas de la muestra
✓ Composición química de la fase estacionaria
✓ Composición de la fase móvil
✓ El caudal
✓ La temperatura de la columna

Todo esto determina la velocidad a la que los componentes se desplazan a través de la

columna.
Se puede elegir entre varias sustancias químicas para la fase estacionaria y entre distintas
dimensiones de columna, como la longitud, el diámetro interior y los tamaños de las
partículas complementarias.
Métodos de detección en la HPLC
Tras la elución de la columna, la fase móvil transporta las bandas o analitos separados hasta el
detector, el último componente en la HPLC. Si bien existen muchos métodos de detección en la
HPLC, no es posible detectar el total de analitos posibles.
Funcionamiento de los detectores para HPLC
Funcionan mediante la conversión de una propiedad
fisicoquímica de un analito en una señal eléctrica en un
sistema de celdas de flujo.

Un detector «ve» una muestra y envía señales en puntos

temporales consecutivos a lo largo del ciclo de la
muestra.

La intensidad de la señal debe correlacionarse con la

cantidad (ya sea de masa o de concentración) de la
muestra detectada en el punto temporal determinado, lo
que permite la cuantificación e identificación de los
analitos separados teniendo en cuenta el factor de
tiempo.
Tipos de HPLC
Cromatografía de fase normal
Normal phase HPLC (NP-HPLC) separa los compuestos sobre la base de su polaridad, utiliza una fase
estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que
aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.

Cromatografía de fase inversa (o reversa)

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad
moderada. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas
de carácter polar eluyen más rápidamente.
La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las
fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase
estacionaria apolar.
Cromatografía de exclusión molecular
También conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su
tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución, de forma que se suele utilizar en los
pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y
la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.
Cromatografía de intercambio iónico
La retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la
columna.
Cromatografía enantiomérica
Permite separar un tipo concreto de estereoisómeros que son especialmente difíciles de segregar, los
enantiómeros. Los enantiómeros, también llamados isómeros ópticos, se caracterizan por ser entre sí imágenes
especulares no superponibles, de igual forma que lo son la mano izquierda con respecto a la derecha. Estos
compuestos comparten las mismas propiedades físicas, por lo que no se ven afectados por la mayoría de los
métodos de separación, incluidas las técnicas cromatográficas tradicionales.
¿Qué sucede en el interior de la columna?
Rendimiento de la separación – Resolución
El grado en el que se separan dos compuestos se denomina resolución cromatográfica. Los dos factores
principales que determinan la resolución o el poder de separación total que se puede lograr con una columna
de HPLC son: el poder de separación mecánica, creado por la longitud de la columna, el tamaño de la partícula
y la uniformidad del lecho rellenado, y el poder de separación químico, creado por la competencia
fisicoquímica para compuestos entre el material de relleno y la fase móvil.
Potencia de separación mecánica – Eficacia
Si el lecho de una columna es estable y está relleno de manera uniforme, su capacidad de separación mecánica
está determinada por la longitud de la columna y el tamaño de las partículas. La potencia de separación
mecánica, también llamada eficacia, a menudo se mide y se compara mediante un número de platos teóricos.
Potencia de separación química – Selectividad
La elección de una combinación de la composición química de las partículas (fase estacionaria) y la
composición de la fase móvil (el sistema de cromatografía) determinará el grado de poder de separación
química (cómo se cambia la velocidad de cada analito). Optimizar la selectividad es el medio más eficaz para
crear una separación.
 𝐭 𝐫𝟐 − 𝐭 𝐫𝟏
𝐑𝐬 =
𝟏
∗ 𝐖𝐛𝟐 + 𝐖𝐛𝟏
𝟐
La resolución indica la capacidad de una columna para separar los picos de interés. Permite

saber si se ha conseguido la separación en la línea base o no.

La resolución indica la capacidad de una columna para separar los picos de interés. Sobre la
resolución influyen la eficiencia (N), la selectividad (α) y la retención (k).

✓ Debe tener como mínimo un valor igual a 1 para que se produzca una separación medible
y se pueda realizar una cuantificación adecuada.

✓ Se necesita un valor igual a 0.6 para que se pueda distinguir un valle entre dos picos de la
misma altura.

✓ Para los métodos más robustos normalmente se requieren valores iguales o superiores a
1.7.

✓ Se considera que un valor igual a 1.6 se corresponde con una separación en línea de base
y garantiza unos resultados cuantitativos de precisión máxima.
 𝟏 𝛂−𝟏 𝐤
𝐑𝐬 = 𝐍∗ ∗
𝟒 𝛂 𝟏+𝐤

EFICIENCIA SELECTIVIDAD RETENCIÓN

La resolución se puede aumentar mejorando cualquiera de esos parámetros:

✓ La selectividad es el parámetro con mayor influencia sobre la resolución. Con pequeñas variaciones
de selectividad se pueden conseguir grandes cambios en las resoluciones.
✓ La retención únicamente influye de manera significativa cuando el valor del parámetro k es bajo.
✓ La eficiencia indica el poder de separación de la columna.