CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA Y COLUMNA

Laura Sofía Caicedo 2242661, Diana Paola Morales 2170864, Sebastián Vargas 2241834
Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

Fecha de realización: 20/03/24

Fecha de entrega: 27/03/24

RESUMEN: La cromatografía es una técnica de separación de componentes en mezclas complejas basada en diferencias
moleculares. Utilizando una fase estacionaria y una móvil, se logró separar los componentes según afinidades y pesos
moleculares. Se emplearon dos técnicas: cromatografía de columna (CC) y cromatografía en capa delgada (CCD) para
separar tintes. Se calcularon los factores de retención (Rf) para evaluar la polaridad relativa de los compuestos, observando
diferencias significativas entre etanol y ácido acético como solventes. Para la pureza se empleó de patrón la mezcla de
tintes, en este caso la fluoresceína se logró un Rf de 0,414 en etanol y 0,270 en agua:ácido acético; para el azul de metileno
se obtuvo 0,365 en etanol y 0,463 en agua:ácido acético. Para el azul de metileno puro en etanol y agua:ácido acético se
obtuvo 0,097 y 0,463 respectivamente. Por otro lado, para las marcas de las fracciones obtenidas en CC se obtuvo para el
azul de metileno un Rf de 0,146 en etanol y 0,583 en agua:ácido acético. Para la fluoresceína se obtuvo 0,756 en etanol y
0,536 en agua: ácido acético. En conclusión, se observó que la polaridad del solvente influye en la separación, con resultados
destacados en la CCD gracias a la efectividad de la CC.

PALABRAS CLAVE: Cromatografía, purificación, polaridad, separación, compuestos.

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1. INTRODUCCIÓN
La cromatografía se fundamenta en la separación de
moléculas en una mezcla mediante su interacción con una
fase estacionaria, ya sea sólida o líquida, mientras se
desplazan a través de una fase móvil [1]. La interacción
entre estas fases y las sustancias de la mezcla es crucial
para la separación. Además de separar las moléculas, la
cromatografía se emplea como método analítico
cuantitativo, buscando lograr una separación eficiente en
un tiempo adecuado. La fase móvil, que lleva consigo la
mezcla, fluye a través de la estructura cromatografía y
retiene el material de la fase estacionaria. Esta última está química y otras disciplinas científicas, ya que su objetivo
fijada en la columna y puede ser polar en la cromatografía
de fase directa o no polar en la fase inversa [2].
El factor de retención, Rf, es un parámetro cuantitativo
que indica la distancia recorrida por un compuesto en
particular en un solvente específico. Comparar los valores
de Rf entre un compuesto desconocido y uno conocido
puede ayudar a determinar su similitud o identidad. Si los
valores de Rf son cercanos o iguales, es probable que los
compuestos sean similares o idénticos [4].
La cromatografía de capa delgada y de columna se emplea
en múltiples industrias para separar y analizar diversos
compuestos. En la industria farmacéutica, se utiliza para
el desarrollo y control de calidad de medicamentos. En la
industria alimentaria, ayuda a analizar la composición y
calidad de los alimentos. En la industria química, se
utiliza en la síntesis y control de calidad de productos
químicos. También es esencial en la monitorización
ambiental, identificación forense de sustancias y
caracterización de productos petrolíferos en la industria
petroquímica [4].
La cromatografía es una herramienta esencial en la
es permitir un análisis detallado de las mezclas, facilitar
el seguimiento de reacciones químicas y proporcionar
información valiosa para el desarrollo de procesos y
productos.
2. METODOLOGÍA
Cromatografía de Columna:
Se colocó un poco de algodón en la parte inferior de una
columna de vidrio. Luego se añadió sílica gel hasta una
altura de aproximadamente 4 cm y se agregó una capa fina
de algodón en la parte de arriba. Después, se golpeó
suavemente la columna para compactar bien la fase
estacionaria sin dejar espacios vacíos y se humedeció toda
la columna con etanol continuando con el golpeó
nuevamente para eliminar cualquier burbuja de aire
atrapada. Una vez instalado el montaje se permitió que el
etanol goteara moderadamente y se recogió esta primera
fracción. Cuando el disolvente estuvo a unos 2-3 mm por
encima de la fase estacionaria, se adicionó la mezcla de
tintes disueltos más etanol poco a poco hasta introducirla
completamente en la sílica gel. Se siguió añadiendo etanol
casi hasta llenar la columna y se recogió la primera
fracción coloreada que eluyó. Luego se cambió el
eluyente a una mezcla 1:1 de agua y ácido acético sin
dejar que la columna se secara. Se recogió la siguiente
fracción coloreada que apareció y finalmente, se recogió
la última fracción incolora que salió.
Cromatografía de capa delgada:
Se prepararon dos cámaras, una con etanol y otra con la
mezcla 1:1 de agua y ácido acético. Se trazaron líneas
horizontales a 0,5 cm de los bordes en dos placas de sílica
gel. Se colocaron un punto de la mezcla de tintes original
en un extremo de cada placa y un punto de las fracciones
coloreadas obtenidas en la columna en el otro extremo.
Luego, se introdujo cada placa en su respectiva cámara
con el disolvente por debajo de las manchas aplicadas. Se
permitió que los eluyentes ascendieran por capilaridad
hasta la línea superior trazada en las placas. Por último, se
retiraron las placas para dejarlas secar y se calculó el Rf
para cada mancha coloreada.
3. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS
Se llevo a cabo la siguiente ecuación para hallar el factor
de retención de los compuestos.
Distancia recorrida por el compuesto
Rf = Distancia recorrida por el disolvente Ec.1
Para calcular el factor de retención, se midió la distancia
recorrida por el disolvente, la cual fue de 4,1 cm para cada
placa y luego se tomaron las medidas del recorrido de
cada compuesto. Los datos se tomaron en la tabla 1.
Tabla 1. Datos de factor de retención en ambos beakers.
4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La cromatografía es una técnica que consiste en la
separación de diferentes componentes en mezclas
complejas, para identificar y determinar las cantidades y
cualidades de los elementos.
Se basa en el principio en el que las moléculas en la
mezcla aplicadas sobre la superficie o en fase estacionaria
sólida, se separan entre sí mientras se mueven con ayuda
de una fase móvil, en el proceso de separación se incluyen
características moleculares relacionadas con la absorción,
partición, afinidad o diferencias entre sus pesos
moleculares, debido a estas diferencias algunos
componentes que se encuentran en la mezcla permanecen
más tiempo en la fase estacionaria y se mueven
lentamente en el sistema, este proceso tiene una fase
estacionaria y una fase móvil [5]. En la fase estacionaria
los componentes de la mezcla están retenidos en el
soporte adecuado, y en la fase móvil, el compuesto
químico fluye hasta arrastrar la muestra, obligando a
atravesar la fase estacionaria.
Se utilizaron para esta práctica dos técnicas,
cromatografía de columna (CC) y cromatografía en capa
delgada (CCD) para separar dos tipos de tintes el tinte A
contenía azul de metileno en etanol y el tinte B era una
mezcla de tintes con fluoresceína, azul de metileno en
etanol. Estas dos técnicas difieren ya que la cromatografía
de capa delgada es una técnica más rápida y sencilla, la
separación de sus componentes se basa en la diferencia de
sus afinidades hacia las fases, permite rápidamente
visualizar la presencia de diferentes compuestos en una
mezcla y proporciona una idea general del proceso, sin
embargo esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su
purificación y separación ya que es más eficiente para
muestras pequeñas, por otro lado la cromatografía por
columna tiene una mayor capacidad de resolución y de
procesar cantidades mayores de muestra, permite separar
y purificar compuestos complejos con una alta eficiencia,
los componentes de la muestra se separan en función de
sus diferencias en la afinidad hacia la fase estacionaria y
la fase móvil, se recolectan en fracciones separadas y
permite una separación y una purificación más eficiente
de los compuestos en cantidades mayores en comparación
a la otra [6].
La cromatografía de columna permite aislar compuestos
de una mezcla, se realiza mediante el uso de una columna
de vidrio el cual en su interior lleva un soporte sólido
adsorbente que actúa como fase estacionaria, para esta
fase se usó sílica, por su capacidad de interactuar con los
compuestos y su porosidad [7]. Se adiciono la fase móvil,
en este caso el etanol, la fase móvil tiene un factor crucial
en este proceso ya que este influye directamente en la
resolución cromatografía, durante la cromatografía de
columna esta fase afecta la pureza y rendimiento de la
fracción recolectada, en la fase móvil se elige un solvente
el cual se usa para transportar la muestra a través de la
fase estacionaria, el solvente debe tener la capacidad de
disolver la muestra y tener en cuenta propiedades
fisicoquímicas como su polaridad volatilidad, una buena
elección es esencial para la separación de los
componentes, una fase móvil optimizada va a permitir una
mejor resolución y separación de la muestra [8], por otro
lado facilita la recolección completa de las fracciones,
este implica la recuperación de los componentes
deseados, minimizando la contaminación cruzada entre
las fracciones.
Se observo que el tinte se dividió en dos colores, uno azul
y uno amarillo, el tinte de color azul se quedó fijo mientras
el tinte de color amarillo empezaba a descender, la
afinidad de los componentes de la muestra, y su velocidad
de desplazamiento están influenciadas por la polaridad del
disolvente usado, esto indico que los reactivos fueron
convenientes ya que se tenía un solvente de baja polaridad
y un absorbente con alta actividad, en este caso la
sustancia color amarillo formada por el tinte tenía una
polaridad menor en comparación a la sustancia azul
formada por el tinte. Una vez completada la elución de la
sustancia amarilla, se sustituyó el disolvente por una
mezcla de agua-ácido acético, considerada mucho más
polar que el etanol [9], con una fuerte capacidad de elución,
esta combinación arrastra consigo la muestra la cual ya no
se encuentra unida a la fase estacionaria, permitiendo
separar eficazmente la separación de ambos compuestos.
Posterior a esto, la cromatografía de capa delgada se
emplea para monitorear reacciones químicas, y su
principio se basa en el fenómeno de la capilaridad. En este
procedimiento, un solvente se mueve ascendiendo a
través de una placa de sílica adsorbente, y los
componentes de la mezcla se desplazan a través de la
placa de acuerdo con su polaridad. Los elementos menos
polares tienen una tendencia a avanzar primero, mientras
que aquellos con mayor polaridad lo hacen más
lentamente [10]. Esta separación ocurre debido a las
variaciones en la fuerza de absorción de los componentes.
Se calculó el factor de retención (Rf), el cual es una
medida que se usa para cuantificar la separación de
componentes en una muestra, cuánto más fuertes sean las
interacciones del analito con la superficie, mayor será la
retención y mayor será el factor de retención, este dato se
puede usar como una herramienta para predecir y mejorar
los resultados obtenidos en la separación por
cromatografía [11], estos valores brindan información
sobre la polaridad relativa de los compuestos, entre mayor
sea el valor del Rf, menor será la polaridad del compuesto
y cuanto más se acerque el valor a 1, más interacción
tendrá con la fase móvil, cuanto más cerca esté de 0, más
interacción tendrá con la fase estacionaria también se
puede usar para evaluar la pureza de los compuestos
después de la purificación ya que si se observan múltiples
manchas en la CCD puede indicar presencia de
impurezas, los datos de Rf pueden proporcionar
información sobre la interacción de los compuestos con la
fase estacionaria. Si los compuestos tienen valores de Rf
muy altos o bajos en una fase estacionaria particular.
La placa de sílica se utiliza como fase estacionaria, y se
pudo observar una separación o distorsión de los colores,
este fenómeno se debe a que la mezcla de tintes está
compuesta por sustancias de diferente polaridad, a medida
que la fase móvil asciende a través de la placa se separan
por su polaridad, los compuestos más polares tienen una
mayor afinidad por la sílica y se mueven más lentamente
a través de la placa [12].
En la mezcla de tintes, se observó una alteración en los
colores. La primera muestra en aparecer fue la de tinte
azul, que mostró un valor de Rf de 0,365 en etanol y de
0,463 en ácido acético. Esto indica que el etanol es más
polar que el ácido acético, lo que resulta en un
desplazamiento menor del tinte azul en el etanol en
comparación con el ácido acético. Posteriormente, la
muestra de color amarillo mostró un valor de Rf de 0,414
en etanol y de 0,270 en ácido acético. Esto sugiere que el
etanol posee una menor polaridad, lo que resulta en un
desplazamiento mayor del tinte amarillo en el etanol en
comparación con el ácido acético.
El azul de metileno puro en etanol tuvo un valor de Rf de
0,097 y en ácido acético de 0,463, lo que quiere decir que
es más polar en etanol y por lo tanto tuvo un menor
desplazamiento a comparación del ácido acético. El azul
de metileno puede formar interacciones iónicas y enlaces
de hidrógeno con solventes polares, en este caso el ácido
acético es más polar, lo que resulta en una mayor
solvatación y migración.
La muestra del tinte color amarillo, tomada de la CC, tuvo
un valor de Rf en etanol de 0,756 y en ácido acético de
0,536; lo que quiere decir que en etanol tiene una menor
polaridad, y un mayor desplazamiento a comparación que
en ácido acético.
La muestra del tinte de color azul, tomada de la CC tuvo
un valor de Rf en etanol de 0,146 y en ácido acético de
0,585, lo que quiere decir que en etanol es más polar a
comparación que en ácido acético, por lo tanto, avanza
más en ácido acético.
Por último, se observó que la marca patrón de
fluoresceína y de azul de metileno tomada de la elución
de la CC se asemeja en la distancia de la fluoresceína y
azul de metileno de la mezcla de tintes como se observa
en la tabla 1, deduciendo que las dos fracciones se
extrajeron con una alta pureza y efectividad.
5. PREGUNTAS
Las preguntas que se respondieron para este informe
fueron las siguientes:
• Compare y contraste la cromatografía de capa
delgada y la cromatografía de columna en
términos de su aplicación práctica en el
seguimiento de reacciones químicas y la
purificación de compuestos orgánicos.
• Discuta la importancia de la selección de la fase
móvil en la resolución cromatográfica durante la
cromatografía de columna y cómo esto afecta la
pureza y rendimiento de la fracción recolectada.
• Discuta los métodos para evaluar el rendimiento
y la pureza de los compuestos separados mediante
cromatografía de columna. ¿Cómo se pueden
utilizar los datos de Rf obtenidos de la
cromatografía de capa delgada para predecir y
mejorar los resultados de separación en
cromatografía de columna?
6. CONCLUSIONES
Se identificó la técnica cromatográfica como una
herramienta fundamental para el seguimiento de
reacciones químicas y separación de mezclas. Además, se
establecieron diferencias entre las distintas técnicas
cromatográficas utilizadas para la purificación de
sustancias orgánicas.
La cromatografía es una técnica invaluable para la
separación y análisis de mezclas complejas. A través de
métodos como la cromatografía de columna y la
cromatografía en capa delgada, se pueden distinguir y
cuantificar los componentes de una muestra según sus
propiedades fisicoquímicas. Mientras que la
cromatografía en capa delgada destaca por su rapidez y
simplicidad, la cromatografía de columna ofrece una
mayor capacidad de resolución y purificación,
especialmente adecuada para muestras más grandes y
complejas. Ambas técnicas tienen sus ventajas y
limitaciones, pero en conjunto proporcionan herramientas
poderosas para los análisis químicos y bioquímicos en una
amplia gama de campos científicos y aplicaciones
industriales.
El factor de retención (Rf) es una medida importante en
cromatografía que indica la polaridad relativa de los
componentes de una muestra y su interacción con la fase
estacionaria y móvil. Valores más altos de Rf indican una
mayor afinidad por la fase móvil, mientras que valores
más bajos sugieren una mayor retención en la fase
estacionaria. En la cromatografía de capa delgada con
sílica como fase estacionaria, se observó una separación
de colores debido a las diferencias de polaridad de los McGraw-Hill. Santa Fe, México. p.p 531-536. ISBN:
componentes de la mezcla de tintes. 978-607-15-0928-4.

El análisis del Rf proporcionó información valiosa para [10] Bele, A. A., & Khale, A. (2011). An overview on thin
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[7] Schiel, J. E., Mallik, R., Soman, S., Joseph, K. S., &
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[9] Chang, R., & K, Goldsby (2013). Química. 11a ed.