REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

DE LOS LLANOS OCCIDENTALES
“EZEQUIEL ZAMORA”
-UNELLEZ-

ANÁLISIS RÁPIDO DE QUINCE RESIDUOS DE SULFONAMIDAS EN

SANGRE DE CERDO Y PESCADO MEDIANTE EXTRACCIÓN
AUTOMATIZADA EN LÍNEA DE FASE SALINA ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA.

Elaborado por: Yonielxis

Profesor : Jordi Gámez
Tovar
ASPECTO MAS IMPORTANTE

Resumen

Resultado y
Introducción Materiales y Discusión
Métodos

Conclusiones

• El objetivo de este trabajo fue
desarrollar un método de
extracción en fase sólida (SPE)
automatizado en línea con
cromatografía líquida-
espectrometría de masas en
tándem para la detección de
quince sulfonamidas en
muestras de cerdo y pescado.
OBJETIVOS
Resumen
• Las muestras se extrajeron con
solución de acetonitrilo de ácido
fórmico al 0,2%, se purificaron
mediante dispositivo SPE en línea
con columna HLB, se separaron
mediante columna XBridge C1s,
utilizando solución de ácido
fórmico al 0,1% y acetonitrilo
como fase móvil. Los datos de
espectrometría de masas se
adquirieron bajo el modo de
monitorización de reacciones
múltiples (MRM) usando
electropulverización de ionización
positiva.
MUESTRAS
• En la cuantificación se utilizó el
método estándar interno, se
obtuvo una buena relación lineal
en el rango de 0,1-100 ng / mL y
el coeficiente de correlación fue
superior a 0,9990. Los límites de
detección estaban en el rango de
0,125 a 2,00 µg / kg y los límites
de titulación cuantitativa estaban
en el rango de 0,250 a 5,00 µg /
kg. Las recuperaciones del
método estuvieron en el rango
de 78.3% -99.3%, la desviación
estándar relativa fue menor al
10%. El método fue simple.
Sensibilidad, y podría usarse para
la supervisión y análisis de rutina
de quince sulfonamidas en carne
de cerdo y pescado.
RESULTADO Y
CONCLUSIÓN

Las sulfonamidas:Son derivados
sustituidos de la sulfanilamida, un grupo
de amidas del ácido
paraaminobencenosulfónico. Que son
ampliamente utilizados en medicina
veterinaria para la prevención y terapia
de bacterias. E infecciones por protozoos
debido a su amplio espectro
antibacteriano, bajo precio, propiedades
estables y excelentes efectos
terapéuticos. Sin embargo, los residuos de
sulfonamidas en los alimentos pueden
provocar reacciones alérgicas, micción y
trastornos hematopoyéticos. La
acumulación a largo plazo puede causar
un gran daño a la salud humana porque
puede dañar la función renal. Para
garantizar la seguridad alimentaria de los
consumidores, la Comisión de la UE . la
Administración de Drogas y Alimentos de
los Estados Unidos (FDA). y el
Departamento de Agricultura de China
han establecido el límite máximo de
residuos (LMR) de sulfonamidas.
INTRODUCCIÓN
En los alimentos por separado. Se han
propuesto varios métodos analíticos
para detectar sulfonamidas, como la
electroforesis capilar , la tecnología de
biosensores . Algunos ensayo y
cromatografía líquida de alta
resolución. Cromatografía de gases .
Cromatografía líquida-espectrometría
de masas en tándem, etc. La
electroforesis capilar mostró una
buena capacidad de separación de
sulfonamidas, pero adolecía de
problemas de baja precisión. La
tecnología de biosensores tiene buena
sensibilidad, pero es propensa a falsos
positivos. El inmune ensayo no es
adecuado para análisis multiresiduos y
de confirmación. La cromatografía de
gases es relativamente difícil porque
las sulfonamidas deben volatilizarse
antes del análisis debido a la alta
polaridad y baja volatilidad de las
sulfonamidas.
La cromatografía líquida de alto
rendimiento-espectrometría de
masas en tándem es una técnica
poderosa para el análisis de
sulfonamidas debido a su alta
especificidad y sensibilidad . Los
alimentos de origen animal
tienen matrices complejas. Que
pueden fácilmente causar
interferencia al objetivo y causar
contaminación al instrumento sin
pasos de purificación o métodos
de purificación deficientes Se
han desarrollado algunos
métodos analíticos para
determinar las sulfonamidas en
varias muestras de alimentos,
incluidos el cerdo y el pescado;
sin embargo, la mayoría de los
métodos informados utilizan SPE
fuera de línea. Purificación por
extracción líquido-líquido, o falta
de pasos de purificación de la
muestra.
 MATERIALES Y MÉTODOS

Se
Se adquirieron
adquirieron de de Fisher
Fisher Scientific
Scientific
(Pittsburgh,
(Pittsburgh, EE. UU.). Desionizado
EE. UU.). Desionizado
agua
agua de
de un
un sistema
sistema de
de purificación
purificación
de agua Millipore Milli-Q
(Millipore, Bedford, MA, EE. UU.)

.
sulfadimoxina (SDX),
sulfapiri-cenar (SPD), Sulfacetamida
Sulfacetamida (SAA),
(SAA),
sulfametoxipiridazina (SMP), sulfametizol
sulfametizol (SMT),
(SMT), sulfisoxazol
sulfisoxazol
sulfadimidina
sulfadimidina (SDM),
(SDM), (SFZ),
(SFZ), sulfachloropiridazine
sulfachloropiridazine
sulfaphenazolum
sulfaphenazolum (SPA),
(SPA), (SCP), sulfadiazine (SDZ),
sulfadimethoxine
sulfadimethoxine (SDT),
(SDT), Reactivos estándares sulfanil- amidoisoxazol (SMZ),
sulfatiazol (STZ),
13C6-
13C6- sulfametoxazol
sulfametoxazol (13C6-
(13C6-
STX) sulfamonometoxina(SMM),
sulfamonometoxina(SMM),
sulfamerazina
sulfamerazina (SMR),
(SMR),

Se prepararon soluciones
madre
madre de
de quince
quince
sulfonamidas
sulfonamidas en
en metanol
metanol
fueron
fueron suministrados
suministrados por
por con
con una
una concentración
concentración de
de 1
1
el
el Dr.
Dr. mg / mL y almacenado a
Ehrenstorfer(Augsburgo,
Ehrenstorfer(Augsburgo, -20 ° C. Se prepararon
Alemania). soluciones de trabajo con
concentraciones
adecuadas
adecuadas antes
antes de
de usar.
usar.
 Equipos
Equipos que
que utilizaron
utilizaron en
en el
el El pre tratamiento de la muestra se realizó utilizando un Se utilizó el analista 1.5.1 para la
procedimiento de extracción. SPE automatizado sistema (Simbiosis pico, Spark Holland, adquisición de datos,
Emmen, Países Bajos). La La unidad SPE en línea se
La centrífuga refrigerada conectó a bombas LC binarias (Symbio-sis SPH 1240, MultiQuant 3.0.1 se utilizó para
de alta velocidad (CR22N, Spark Holland), que estaba conectado a un tándem el procesamiento de datos,
HITACHI, Alemania). espectrómetro de masas (Triple Quad 6500, AB Sciex, EE. mientras que la versión 1.2.0.0
UU.) equipado con una fuente ESI . se utilizó para controlar la
unidad SPE en línea.
el mezclador de vórtice
(Vortex Genius 3, IKA, Se utilizó el cartucho Oasis HLB
Alemania. (10 mm x 1 mm, Welters, EE.
UU.) Para SPE en línea, y la
separación cromatografía
y el limpiador
ultrasónico (Elmasonic
P300H, Elma,
Alemania. se realizó en una columna
XBridge C13 (4,6 mm x 150
mm, 5 ttm, Waters, EE. UU.)

Preparación de
muestras
Se pesaron dos gramos de muestra y se
transfirieron a un recipiente de 50 ml. tubo
centrífugo. Después de agregar 50 p., De 100
ng / mL interno soluciones estándar de 13C6-
STX, 5 mL de acetonitrilo con 0.2% FA, agitar y
mezclar durante 1 min, y luego someter a
ultrasonidos durante 30 min. ple se centrifugó a
8000 r / min durante 5 min. Después de
desengrasar, el sobrenadante se filtró y se
transfirió a un vial de muestra listo para SPE en
línea.
Instrumentos.
Condiciones SPE en línea.
El cartucho SPE en línea se acondicionó con
1000 IA Metanol y 1000 ILL de agua a un
caudal de 3500 µL / min, A Luego se cargó una
porción de 100 pl de extracto de muestra en el
cartucho. bridge utilizando 1000 µl de agua
como disolvente de transferencia a 1000 µL /
min. La El cartucho SPE se lavó sucesivamente
con 1000 pi de agua. A 3500 µl / min. Una vez
completado el procedimiento de lavado, lugar
en la pinza izquierda del intercambio automático
de cartuchos, el cartucho se movió
automáticamente a la abrazadera del lado
derecho, donde los analitos diana se eluyeron
en la columna LC a 200! IL metanol a 100111 /
min. Al mismo tiempo, se colocó un cartucho
nuevo. Colocado en la abrazadera del lado
izquierdo, y la siguiente secuencia de
extracción fue iniciado.
Separación cromatografía.
La separación cromatografía se realizó en un C18
columna. La temperatura de la columna era de 35 ° C, el
volumen de inyección El volumen fue de 50 µL, agua que
contenía 0,1% (V / V) FA (fase A)
Y acetonitrilo (fase B) se utilizaron como fase móvil.
Objetivo Los compuestos se separaron con un gradiente
de elución, la elución las condiciones fueron las
siguientes: 0-0,05 min, 0,6-0,5 ml / min, 98% de A; 0,05-
2,00 min, 0,5 ml / min, 98% A; 2,00-2,05 min, 0,5-0,6 ml /
min, 98% de A; 2,05-10,30 min, 0,6 ml / min 98% -5% de
A; 10.30-12.30 min, 0.6 mL/min, 5% A; 12.30-12.40 min,
0.6 mL/min, 5%-98% A; 12.40-15.00 min, 0.6 mL/min,
98% A.
Detección por espectrometría de masas.
El análisis de EM se realizó utilizando una fuente de ESI
en positivo modo de ionización. Las condiciones
optimizadas de la espectrometría de masas fueron los
siguientes: el voltaje de ionización fue de 5,5 kV, la
temperatura de la fuente La temperatura era de 500 ° C,
la presión del gas de cortina era de 30 psi, la presión del
gas del nebulizador era de 40 psi, la presión del gas
auxiliar era de 45 psi, el tiempo fue de 20 ms. Los
parámetros de espectrometría de masas de los analitos
 Todas las sulfonamidas contienen grupos polares, de acuerdo con compuestos
Aún se evaluaron varios parámetros
similares. principios de pasibilidad, son más fáciles de disolver en polares
clave para validar un procedimiento
orgánicos disolventes. Este experimento investigó el efecto de extracción SPE en línea apropiado. Para el
cuando se utilizaron acetonitrilo y metanol como disolvente de extracción cartucho HLB, cuanto mayor sea la
Cuando se utilizó metanol como disolvente de extracción, la extracción La polaridad del solvente de elución, el
solución era relativamente turbia y la recuperación fue menor que eso. De objetivo más fácil será eludido, pero
acetonitrilo. La mayoría de las proteínas presentes en la carne de cerdo y el también eliminará las impurezas. Se
pescado fueron precipitadas en presencia de acetonitrilo. El efecto de compararon metanol y acetonitrilo
extracción de acetonitrilo con diversas concentraciones de ácido fórmico (0, como disolvente de elución. El
resultado se muestra en la Fig. 1.
0,1%,0,2%, 0,5%, 1%).
Excepto para SFZ y SMZ, el efecto
de elución del metanol fue mejor
que el del acetonitrilo. Por tanto, se
utilizó metanol como disolvente de
elución en este experimento.
Optimización de
 Linealidad. disolventes de
 Sensibilidad extracción.
 Recuperación
y precisión. Optimización
 Comparación de las
 Con métodos condiciones
estándar. SPE en línea.
Resultados y
discusión
Validación del
método
Este experimento utiliza el
sistema SPE automático en línea
Optimización de Simbiosis Pico, que consta de un
Optimización de las condiciones de dispositivo SPE en línea y
los parámetros la cromatografía cromatografía líquida. Mitografía,
de líquida. las muestras purificadas por SPE
espectrometría en línea fueron directamente
de masas. inyectado en la columna de LC
para el análisis, lo que daría
como resultado la dispersión de
Las soluciones estándar internas (100 ng / los objetivos para la solución de
mL) directamente en la masa
elución, por lo que la dilución
espectrómetro a una velocidad de 5 p, L / para disminuir el porcentaje de
min. Se encontraron iones precursores en metanol usando la fase móvil era
Ql MS full scan y dos fragmentos se
necesaria para hacer que el pico
seleccionaron utilizando iones de producto.
del compuesto objetivo se
Modo de escaneo. Se utilizó el modo de enfoque en el frente de la
monitorización de reacciones múltiples
columna de LC umn.
(MRM) para monitorear el precursor al
producto de las transiciones de iones .
 Tabla: 3 Se estudio el rango lineal
TABLAS y gráficos Utilizados preparando una curva de calibración con
una concentración rango de 0.1-100 ng /
mL para cada sulfonamida, y una buena
linealidad relación con los coeficientes
Tabla 1 : para las sulfonamidas en los Parámetros de espectrometría de de correlación (R2) entre 0,9992 y Se
alimentos de origen animal estipulado por la masas de analitos. alcanzó 0,9999 para quince
UE, los EE. UU. y China. sulfonamidas en su respectivo rango
lineal.

NOTA:

Las tablas y grafico que se muestran en la

laminas son los resultados de los diferentes
procesos que realizaron los autores en la
investigación. El cual utilizaron diferentes
software para obtener los resultados .

Efecto de diferentes caudales de elución sobre

las recuperaciones de quince sulfonamidas.
 CONCLUSIONES

En este experimento, se desarrolló un método LC-MS / MS rápido y sensible

para analizar quince sulfonamidas basado en la técnica SPE en línea, y se
utilizó un estándar interno marcado con isótopos en el análisis cuantitativo. La
linealidad, sensibilidad, exactitud y precisión
Se investigó la aplicación del método y el método desarrollado se ha utilizado
con éxito para la detección de quince sulfonamidas en muestras de cerdo y
pescado.
GRACIAS POR SU atención