Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Agronomía
Ingeniería en Industrias Alimentarias

Análisis avanzado de alimentos

Evidencia 3

Aplicaciones de los métodos espectrofotométricos (UV–visible)

Grupo: I5A

24/Noviembre/2021
Responder a los siguientes cuestionamientos
 
1. ¿Cuáles son las condiciones que generalmente se requieren en la
determinación de iones inorgánicos al hacer uso de técnicas de
espectrofotometría UV-visible?

Se debe hacer uso de un reactivo que forme un compuesto coloreado con la

especie que se quiere determinar. Este compuesto debe ser estable en cuanto a
las condiciones de la medición, puede ser un complejo, un producto absorbente
(ej. Laca) o un producto oxidado o reducido. Por ejemplo, unos de lis reactivos
más usados para la determinación de iones inorgánicos son; 1,10-Fenantrolina,
bañofenantrolina, ditiol, cuproína, neocuproína, amarillo de tiazol, griess, N-N-
Dimetil-p-fenilendiamina y cloranilato de sodio.

2. ¿Cuáles son los fundamentos para determinar clorofila en plantas y

azúcares reductores por espectrofotometría UV-visible?

La clorofila de las plantas se determina moliendo material vegetal fresco y

extrayendo el pigmento en un disolvente orgánico. Por lo tanto, los compuestos
biológicos orgánicos deben de convertirse en especies coloreadas para su
determinación, esto puede ser mediante una reacción redox como la que tiene
lugar entre azucares reductores (aldosas y cetosas) y el molibdato de amonio (que
produce azul de molibdeno), el ácido pícrico (se reduce a ácido picrámico) o el
ácido úrico (se reduce a heteropoliácido fosfomolibdato). Al igual que los azúcares
reductores, también pueden determinarse mediante la reducción del
hexacianoferrato (III) a (II) y la posterior formación de azul de Prusia (método de
Park y Johnson).

3. Mencione la importancia de las reacciones de derivatización en la

determinación de aminoácidos (e.g., fenilalanina y triptófano) por
espectrofotometría UV-visible

Los aminoácidos se pueden determinar fácilmente por la espectroscopía UV-

visible, sin embargo, un inconveniente que tienen es que pueden tener
interferencias en cuanto a las especies presentes en ellas. Es por eso, por lo que
las reacciones de derivatización tienen cierta importancia en la determinación de
aminoácidos, para que no existan interferencias o haya un mínimo de ellas. Por
ejemplo, para el caso de determinación de aminoácidos en hidrolizados de
proteínas, se hace el uso de ninhidracorbato el cual se reduce a hidridantina
debido al ácido ascórbico, donde básicamente da como resultado un producto
coloreado con una máxima absorbancia (405 y 475 nm).

4. En la cuantificación directa de proteínas por el método de Warburg y

Christian. Indique en que se basa esta cuantificación. Asimismo,
mencione una estrategia con la que comúnmente se lleva correcciones
de interferencias en la lectura.
Su fundamento se basa en que el triptófano y la tirosina absorban la radiación
ultravioleta al máximo (280 nm), generando unas concentraciones bastante
constantes en las proteínas.
Sin embargo, pueden existir ciertas interferencias en cuanto a los ácidos nucleicos
y sus bases nitrogenadas ya sea en forma libre o como nucleótido, ya que
necesitan correcciones porque estos también absorben en la región de medición
(260 nm). Por lo tanto, se debe determinar experimentalmente la relación
A280/A260 para las diferentes muestras que contienen diferentes proporciones de
ácido nucleico para calcular el factor de corrección que se multiplica por A280,
para poder determinar así la concentración de la proteína.

5. En la cuantificación de proteínas hay tres métodos de

espectrofotometría ampliamente utilizados (Biuret, Lowry y Bradford).
¿Cuáles son las diferencias que tienen estos métodos?

Biuret – las proteínas (o sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos)
reaccionan con cobre para formar un complejo coloreado, cuya absorción (454
nm) en presencia de un exceso de cobre es proporcional a la cantidad de proteína
presente. Un inconveniente que tiene este método es que es muy sensible.
Lowry – permite determinar las proteínas a nivel de microgramos por mililitro,
aunque de igual manera se ha usado para células completas. Aquí se involucran
dos reacciones: el de la proteína con solución alcalina de cobre (reacción de
Biuret) y la reducción del reactivo de Folin Ciocalteau por residuos de tirosina y
triptófano de la proteína. Sin embargo, como es un método más exacto, este es
aún más sensible que el de Biuret. Al igual tiene más interferencias o limitaciones,
particularmente con sales de amonio, glicina y mercaptanos, además de que
también pueden influir las variaciones del contenido de tirosina y triptófano de la
proteína, por lo que este método es más practico para determinar cambios de
concentración que las concentraciones absolutas de proteína.
Bradford – Este se basa en la absorbancia de Coomassie Brilliant Blue, dando
como resultado un cambio de espectro del tinte de 465-595 nm, donde los 595 nm
son proporcionales a la concentración de la proteína. Su inconveniente es que
puede tener interferencias de los tensioactivos y la alcalinidad de la solución. En
cambio, su ventaja es que es rápida y eficiente.

6. En los ensayos enzimáticos utilizando espectrofotometría UV-visible.

¿Cuáles son las dos formas en las que se pueden llevar estos tipos de
análisis? Asimismo, incluya un ejemplo de una técnica para la
determinación de una enzima.

Las formas en las que se puede llevar a cabo la espectrofotometría UV-visible en

el análisis enzimático son: mediante la determinación directa de la concentración
del producto de reacción una vez que este completada la reacción, este
procedimiento debe ser rápido. Y midiendo la velocidad de la reacción, donde esta
debe estar relacionada con la concentración de la sustancia (sustrato usado) o el
cofactor, activador o inhibidor. En este procedimiento debe ser lento. Para las dos
formas de análisis los espectros del reactivo A y del producto B deben ser
diferentes. Básicamente el procedimiento implica medir la disminución de la
absorbancia de A o el aumento de B. Cabe recalcar que los métodos
espectrofotométricos se pueden utilizar tanto para enzimas disueltas como
inmovilizadas.
Ejemplo de una técnica para la determinación de una enzima:
Uno de los métodos analíticos más utilizados en bioquímica es el de la prueba
óptico - enzimática. Este se basa en la determinación de un substrato o una
actividad enzimática de una reacción específica, acoplada a un sistema redox, en
la que NAD+, así como el NADP+ se reducen a NADH y NADPH, respectivamente
o se oxidan (caso inverso). Con la reducción del NADP+ a NAD (P) H + H+
aparece un nuevo máximo a 340 nm, por la reducción de anillo aromático de la
piridina que hace parte de la molécula de la Nicotinamida. Este cambio o
desaparición de la absorción a 340 nm, hace posible su uso en la prueba óptico-
enzimática. Esta prueba se lleva a cabo con base en la especificidad del substrato
y en la mayoría de los casos es muy sensible y por lo tanto muy específica.
La prueba óptica enzimática, permite el reconocimiento, la determinación
cuantitativa de substratos y actividades enzimáticas que con la nicotinamida
adenina dinucleótido (donadores de hidrógeno, coenzima) actúan como aceptores
directos, después del acoplamiento con ayuda de la reacción enzimática indirecta.
La transformación permite ser seguida fácilmente con la medida de la absorción
de la forma reducida de la piridina dinucleótido. Cuando se utilizan fotómetros con
lámpara de mercurio se puede seguir la reacción a 366 nm. El coeficiente de
extinción para NADH y NADPH a 366 nm es igual a 3.4X10 -3 M-1 cm-1.
Bibliografía
F. Sánchez Rojas, C. Bosch Ojeda, J.M. Cano Pavón. Spectrophotometry | Biochemical
Applications. Editor(s): Paul Worsfold, Colin Poole, Alan Townshend, Manuel Miró.
Encyclopedia of Analytical Science (Third Edition). Academic Press, 2019. Pages
205-213. ISBN 9780081019849. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409547-
2.00501-1.

MÉTODOS SELECTOS DE BIOQUIMICA EXPERIMENTAL UNIVERSIDAD NACIONAL

DE COLOMBIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA HUMBERTO MIGUEL

ZAMORA ESPITIA BOGOTÁ, COLOMBIA 2008 CONTENIDO. (n.d.).

http://ciencias.bogota.unal.edu.co/fileadmin/Facultad_de_Ciencias/Publicaciones/

Archivos_Libros/Libros_Quimica/Metodos_selectos/MSBE.pdf