Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca

Dirección de Laboratorio e Innovación Ambiental

Determinación de sustancias activas al azul de metileno (SAAM) por el SM 5540 C

Santiago Arturo Amaya Atuesta, William Ricardo López

RESUMEN
Se realizó la verificación del método 5540 C del Standard Méthods el cual describe el procedimiento para la determinación y
cuantificación de sustancias activas al azul de metileno en diferentes fuentes de agua como previo a la potabilización, naturales,
residuales domésticas, residuales industriales, humedales, pantanos, vallados, lagos, lagunas y rellenos sanitarios por medio
de análisis espectrofotométrico. En el proceso de verificación se tuvieron en cuenta factores como rango lineal, límite de detección,
límite de cuantificación, repetibilidad de estándares y muestras, precisión intermedia, robustez, rango de trabajo e incertidumbre.
Una vez desarrollados los correspondientes procedimientos para reproducir el análisis en las condiciones del laboratorio de la
Dirección de Laboratorio e Innovación Ambiental de la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca (CAR), se procedió
con el análisis y tratamiento estadístico de los resultados obtenidos, los cuales dieron argumentos para concluir que el
procedimiento se logró reproducir de forma satisfactoria dentro de las condiciones, instalaciones y equipos empleados. Además el
procedimiento puede ser fácilmente replicado por cualquier analista siempre y cuando reciba la capacitación y entrenamiento
debido del proceso.
Palabras clave: [SAAM], [Espectrofotométrico], [LAS], [Azul de metileno], [5540C].

Introducción permitidos para los distintos tipos de tensioactivos

Los surfactantes se describen como sustancias anfífilas
(que posee doble afinidad) debido a que poseen una parte
polar y una apolar, la primera posee afinidad por los
solventes polares como el agua y se denomina como la
parte hidrofílica, por otro lado la parte apolar es la
hidrofóbica o lipofílica. Existen surfactantes aniónicos,
catiónicos y no-iónicos, de los cuales los primeros son los
que componen la mayor parte de la producción anual en el
mundo de estas sustancias y de los cuales se componen
principalmente detergentes sintéticos, aditivos espumantes,
jabones, entre otros [CITATION Ant10 \l 9226 ] Como
consecuencia de su gran producción, es un factor
importante para la sostenibilidad ambiental mantener bajo
control la concentración de estas sustancias en las fuentes
hídricas.
A pesar de que son componentes altamente utilizados en la
industria debido a sus beneficios tanto económicos como
sanitarios, son considerados como un contaminante
importante del recurso hídrico, por tanto se busca
permanentemente que sean fácilmente biodegradables y de
baja toxicidad. A pesar de que en su mayoría, los
tensioactivos pueden ser degradados por actividad
microbiológica, existen algunos que incluso en condiciones
anaerobias pueden mantenerse sin ser degradados, y este es
uno de los criterios más dicientes a la hora de predecir el
comportamiento de una sustancia en el medio ambiente.
Por otro lado, la eco-toxicidad de estas sustancias es un
aspecto relevante por su acción perjudicial en las
membranas celulares, por esto se establecen límites
[CITATION Fra14 \l 9226 ].
Los surfactantes entran en las fuentes de agua tanto limpia
como residual principalmente como descargas de residuos
acuosos de lavados domésticos, residuales y demás
operaciones de limpieza.
Con base en los motivos expuestos, no es de extrañar que
sea de interés para el control del medio ambiente mantener
el registro de los tensioactivos y sus cantidades en las
diferentes fuentes de recurso hídrico presentes en el
planeta, para esto existen métodos de cuantificación
certificados a nivel internacional como los descritos en el
Standard Méthods, más específicamente hablando del
método 5540 C, la cual será la metodología a desarrollar en
este informe de confirmación. Esta metodología es
exclusiva para la determinación de surfactantes aniónicos,
los cuales, como se mencionó anteriormente, componen la
mayoría de los tensioactivos presentes en la industria,
además las concentraciones se presentan como la cantidad
de sustancias activas al azul de metileno (SAAM) como se
verá a continuación[CITATION Eat \l 9226 ].
Metodología
Descripción de la Metodología:
El método desarrollado en la presente confirmación fue el
Standard Méthods 5540 C, el cual se utiliza para la
determinación de surfactantes o tensioactivos aniónicos, los
cuales en su mayoría son sustancias que reaccionan al azul

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de metileno, permitiendo así su cuantificación al
relacionarla con la intensidad del color generado en una
fase orgánica. El método es relativamente sencillo y consta
de una serie sucesiva de extracciones desde un medio
acuoso ácido con exceso de azul de metileno, hacia un
medio orgánico, en este caso cloroformo (CH Cl 3).
Posteriormente el resultado será analizado por medio de
espectrofotometría a 652nm.
Según la norma de referencia [CITATION Eat \l 9226 ], el
método es aplicable para concentraciones que llegan hasta
los 0.025 mg/L, aunque el rango dentro del cual se
trabajará se dará como resultado del análisis de la
linealidad por medio del montaje de curvas de calibración
dentro del proceso de confirmación. Como punto de partida
para este aspecto se tomarán puntos de trabajo que entren
dentro del rango lineal sugerido en el ítem 1.f del método
5540 C del Standard Méthods en donde asegura que el
rango lineal abarca desde los 10 hasta los 200 µg de
estándar de SAAM, el cual es el dodecil sulfato de sodio
(LAS). Este reactivo es el surfactante aniónico mayormente
utilizado en la industria.
Descripción del control operacional:
De forma general para el desarrollo adecuado del método
se debe tener en cuenta que debido a las propiedades
inherentes a los surfactantes, es necesario tomar
precauciones analíticas especiales o como mínimo
conocerlas en caso de que sean requeridas por el proceso.
Evite la formación de espuma porque la concentración de
surfactantes es mayor en la fase de espuma que en la fase
acuosa asociada. En caso de que se presente espuma, dejar
que desaparezca por si sola sin agitarla, también es posible
disolverla por otros medios y volver a mezclar la fase
líquida antes de tomar la muestra. También se puede
enjuagar la pared interna de los materiales a utilizar para
evitar la adsorción de surfactante en ellas. El análisis de
aguas tanto limpias como residuales puede ser llevado a
cabo de forma directa teniendo en cuenta que para efectos
de la presente validación se especificó un volumen de
alícuota de 100 mL de muestra. En caso de que la
concentración supere el rango de trabajo especificado se
deberán hacer diluciones hasta que la concentración entre
dentro del rango del intervalo lineal aceptado y llevando
siempre a un volumen de trabajo de 100 mL.
Además de estos aspectos generales hay factores
adicionales a tener en cuenta que se describirán a
continuación:
1. Limitaciones e interferencias: La presencia de
otras clases de SAAM en las muestras, diferentes
a LAS, presentan interferencias positivas en los
resultados. Sustancias como sulfonatos orgánicos,
sulfatos, carboxilatos, fenoles, tiocianatos,
$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$
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cianatos, nitratos y cloruros inorgánicos, pueden
también transferir azul de metileno a la fase del
cloroformo. Lo anterior debe ser corregido con la
fase de lavado descrita en la marcha analítica más
adelante.
Las interferencias negativas pueden resultar por la
presencia de surfactantes catiónicos u otras
moléculas con dichas características, tales como
aminas, ya que estas compiten con el azul de
metileno en la formación de pares iónicos. Un
caso similar puede ocurrir con el material
particulado dentro de la muestra ya que puede
generar la adsorción de las SAAM. Estas
sustancias pueden ser desorbidas mediante la fase
de agitación con el cloroformo.
Los sulfuros presentes en las muestras de aguas
residuales tratadas sólo con pasos primarios o sin
tratar pueden reaccionar con el azul de metileno
generando productos incoloros, haciendo
imposible el análisis, para mitigar este
inconveniente es necesario agregar peróxido de
hidrógeno.
Se pueden presentar muestras que generen
emulsiones a la hora de realizar la agitación con el
cloroformo, para lo cual es necesario agregar una
cantidad de alcohol isopropílico a la muestra
(<10mL), en caso de que sea necesario usarlo
también se deberá agregar dicha cantidad a los
estándares de control.
2. Preservación de la muestra: La muestra debe ser
tomada en botellas de polietileno o de borosilicato
sin preservante alguno. El volumen de la muestra
debe ser de 500 a 1000 mL, el análisis debe
realizarse en un tiempo máximo de 48 horas, para
el cual se debe aclimatar de forma previa a 20°C
durante 1 hora como mínimo.
Consideraciones de limpieza: Para evitar trazas de diversos
elementos que pueden interferir durante el análisis, es
importante lavar bien el material con agua del grifo, con
una solución de jabón neutro (Extran) y finalmente con
una solución de HNO3 al 10%. Refregar con churrusco
el material para remover posibles residuos internos y
enjuagar varias veces con agua. Por último purgar el
material con agua desmineralizada, dejar escurrir y secar
antes de usarlo. Las garrafas y baldes a usar en el
muestreo deben ser lavados con abundante agua y jabón
neutro, refregar las paredes internas con un churrusco y
enjuagar nuevamente con abundante agua del grifo, por
último purgar con agua destilada y dejar escurrir.
Cualquier procedimiento adicional de limpieza que se
requiera sebe ser consultado en el procedimiento de
limpieza del área de fisicoquímica (GAM-POE-62).
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Equipos, reactivos y materiales:
1. Equipos:
Tabla 1: Equipos utilizados en la metodología.
N° Código Nombre
1 GAM-IS-156 Cuarto frio FRIOTERMICA
2 N.A. Nevera para reactivos a +/-4°C
3 GAM-IS-41 Espectrofotómetro thermo evolution 300
4 GAM-IS-90 Espectrofotómetro thermo evolution 600
5 GAM-IS-36 Balanza Adventure Ohaus
6 GAM-IS-98 Balanza Denver
7 N.A. Cabina extractora de vapores
2. Reactivos:
 Stock de Dodecil sulfato de sodio (LAS).
 Solución indicadora de fenolftaleína
alcohólica; disolver 80 gramos de fenolftaleína
en 100 mL de metanol absoluto.
 Hidróxido de sodio (NaOH) 1N; Disolver 40
gramos de NaOH en agua destilada y llevar a
volumen de 1000 mL. En caso de necesitar una
cantidad diferente realizar los cálculos
necesarios para el volumen que se requiera.
 Ácido sulfúrico ( H 2 SO 4 ) 6N; Diluir 167 mL
de ácido sulfúrico concentrado ( H 2 SO 4 ) en
agua destilada y llevara volumen de 1000 mL.
En caso de necesitar una cantidad diferente
realizar los cálculos necesarios para el volumen
que se requiera.
 Ácido sulfúrico ( H 2 SO 4 ) 6N; Diluir 13.9 mL
de ácido sulfúrico concentrado ( H 2 SO 4 ) en
agua destilada y llevara volumen de 500 mL.
En caso de necesitar una cantidad diferente
realizar los cálculos necesarios para el volumen
que se requiera.
 Cloroformo (CHCl 3); PRECAUCIÓN: el
cloroformo es tóxico y un carcinógeno
potencial. Se deben tomar precauciones con
respecto a su inhalación y exposición como el
manejo de este dentro de una cabina de
extracción y usar elementos de protección
personal tanto para proteger la piel como para
protegerse de la inhalación del reactivo.
 Azul de metileno.
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 Fosfato de sodio monobásico monohidratado
( NaH 2 PO 4).
 Reactivo azul de metileno; disolver 100 mg de
azul de metileno en 100 mL de agua destilada.
Transferir 30 mL a un recipiente volumétrico
de 1000 mL. Añadir 500 mL de agua
aproximadamente, 41 mL de H 2 SO 4 6N y 50
gramos de fosfato de sodio monobásico
monohidratado ( NaH 2 PO 4). Agitar hasta
disolver y llevar a volumen.
 Solución de lavado; agregar 41 mL de
H 2 SO4 6N a aproximadamente 500 mL de
agua en un recipiente volumétrico de 1000 mL,
añadir 50 gramos de fosfato de sodio
monobásico monohidratado ( NaH 2 PO 4).
Agitar hasta disolver y llevar a volumen.
 Metanol absoluto (CH 3 OH );
PRECAUCIÓN: los vapores del metanol son
inflamables y tóxicos, tomar las medidas de
seguridad necesarias como el manejo de este
dentro de una cabina de extracción y usar
elementos de protección personal tanto para
proteger la piel como para protegerse de la
inhalación del reactivo.
 Peróxido de hidrógeno ( H 2 O 2 ).
 Alcohol isopropílico (C 3 H 8 O);
PRECAUCIÓN: los vapores del metanol son
inflamables y tóxicos, tomar las medidas de
seguridad necesarias como el manejo de este
dentro de una cabina de extracción y usar
elementos de protección personal tanto para
proteger la piel como para protegerse de la
inhalación del reactivo.
 Lana de vidrio; pre-enjuagada con CHCl 3
para remover interferencias.
 Agua grado reactivo libre de SAAM.
3. Materiales:
 Balones aforados clase A de 50, 100, 250, 500
y 1000 mL.
 Embudos de separación de 250 mL,
preferiblemente con tapón y llave de paso de
tetrafluoroetileno (TFE) inerte.
 Embudos de filtración de plástico.
 Espátula.
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 Lana de vidrio.  Placa de agitación y agitador magnético.

 Pipetas Volumétricas clase A de 3, 5, 10, 15, 20
y 25 mL.
Preparación de estándares:
 Probetas de 10, 25, 50 y 100 mL. Para esta sección se nombrarán los estándares o patrones a utilizar
 Beacker de 250 mL. en el proceso como lo son los referenciados en la sección de
herramientas de control en los anexos.
 Soporte para los embudos de separación.

Tabla 2: Preparación de estándares

Procedimiento Verificación/ controles/ formatos
Paso
Descripción Qué Cómo Cuándo Registro
N°
Preparación de solución Stock de LAS (1000 mg/L)
Control de preparación de
Pesar 0.50 g de LAS en Llevando seguimiento Cada vez que
1 Peso/ Balanza analítica reactivos y de uso de balanzas
un beacker. mediante registro se prepare
(GAM-FT-28 y GAM-FT-34)
Disolver en agua Determinación de Cada vez que Control de calidad de agua
2 Calidad del agua usada
desmineralizada. conductividad se prepare (GAM-FT-17)
Material volumétrico
Aforar en balón de 500 Realizar el procedimiento de Verificar el material
cumpla con los Mínimo una
3 mL para obtener LAS verificación de material volumétrico de referencia
requisitos de vez al año
de 1000 mg/L volumétrico (GAM-GI-1) (GAM-FT-101)
verificación.
Transferir a un envase Temperatura de
Verificación de temperatura Registro de condiciones de
4 ámbar, y refrigerar refrigeración de Diaria
de la nevera neveras (GAM-FT-157)
(Duración 1 Semana) reactivos
Preparación de solución estándar LAS (100 mg/L)
Material volumétrico
Tomar 10 mL de la Realizar el procedimiento de Verificación de material
que cumpla con los Mínimo una
1 solución Stock de 1000 verificación de material volumétrico de referencia
requisitos de vez al año
mg/L volumétrico (GAM-GI-1) (GAM-FT-101)
verificación.
Aforar en balón de 100 Realizar procedimiento de Mínimo una Verificación de material
mL, completando el verificación de material vez al año volumétrico de referencia
volumen de agua Material volumétrico y volumétrico (FORMATO) (GAM-FT-101)
2 Cada vez que
calidad de agua
Mezclar bien Determinar conductividad del se lean Control de calidad de agua
(Duración 1 día) agua muestras (GAM-FT-17)
Preparación de solución estándar LAS (10 mg/L)
Material volumétrico
Tomar 10 mL de la Realizar el procedimiento de Verificación de material
que cumpla con los Mínimo una
1 solución Stock de 100 verificación de material volumétrico de referencia
requisitos de vez al año
mg/L volumétrico (GAM-GI-1) (GAM-0FT-101)
verificación.
2 Aforar en balón de 100 Material volumétrico y Realizar procedimiento de Mínimo una Verificación de material
mL, completando el calidad de agua verificación de material vez al año volumétrico de referencia

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volumen de agua volumétrico (GAM-GI-1) Cada vez que (GAM-FT-101)

Mezclar bien Determinar conductividad del se lean Control de calidad de agua
(Duración 1 día) agua muestras (GAM-FT-17)

Curva de calibración:
Para la preparación de la curva se debe tener en cuenta que
el rango lineal encontrado durante la validación va desde
0.3 mg/L hasta 4.0 mg/L.

Tabla 3: Preparación de curva de calibración

Procedimiento Verificación/ controles/ formatos
Paso
Descripción Qué Cómo Cuándo Registro
N°
Preparar embudos de separación para cada
1 N.A: N.A. N.A. N.A.
punto de la curva
Tomar las porciones de LAS de la Material Realizar el
Verificación de
solución estándar de 10 mg/L volumétrico que procedimiento de
Mínimo una vez material volumétrico
2 correspondientes a cada punto (0.0, 0.3, cumpla con los verificación de material
al año de referencia (GAM-
0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 y 4.0) para 100 mL requisitos de volumétrico (GAM-GI-
FT-101)
de solución. verificación. 1)
Adicionar agua a cada embudo hasta
3 completar un volumen aproximado de 100 N.A. N.A. N.A. N.A.
mL
Proceder con la extracción como lo
4 describe la marcha analítica desde el paso N.A. N.A. N.A. N.A.
N°3 en adelante.
Realizar la lectura en el espectrofotómetro Cuando los
La a linealidad de la El valor de r2 debe ser
5 a 652nm colocando cloroformo en la chequeos no den N.A.
curva. mayor o igual a 0.997
celda de referencia o cada 2 meses

Marcha analítica
Tabla 4: Marcha analítica
Procedimiento Verificación/ controles/ formatos
Paso
Descripción Qué Cómo Cuándo Registro
N°
1 Aclimatar la muestra N.A. N.A. N.A. N.A.
Tomar 100 mL de muestra con probeta plástica y Material Realizar el Verificación de
adicionar a un embudo, en otro embudo 100 mL de volumétrico que procedimiento de Mínimo material
2 blanco y en otros la porción de estándar correspondientes cumpla con los verificación de una vez al volumétrico de
al LCM (0.3mg/L) y al patrón de chequeo (1.8 o 3.5 requisitos de material volumétrico año referencia (GAM-
mg/L) según la concentración de las muestras verificación. (GAM-GI-1) FT-101)
3 Adicionar entre 3 y 5 gotas de peróxido de hidrógeno N.A. N.A. N.A. N.A.
30% a cada embudo (tanto muestras como estándares y

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blanco)
4 Añadir unas gotas de fenolftaleína a cada embudo. N.A. N.A. N.A. N.A.
Añadir gota a gota NaOH 1N hasta obtener un color
5 N.A. N.A. N.A. N.A.
rosado permanente.
Añadir gota a gota H2SO4 hasta que el color rosado
6 N.A. N.A. N.A. N.A.
desaparezca por completo
Adicionar 10 mL de Cloroformo y 25 mL de Reactivo
7 N.A. N.A. N.A. N.A.
azul de metileno con probetas plásticas.
8 Agitar el embudo vigorosamente durante 30 segundos. N.A. N.A. N.A. N.A.
Extraer la capa de cloroformo y depositar en un embudo
9 N.A. N.A. N.A. N.A.
de separación vacío y limpio.
Enjuagar el embudo y el tubo de drenado con una
10 N.A. N.A. N.A. N.A.
pequeña cantidad de cloroformo.
Repetir los pasos 8 y 9 otras dos veces agregando
11 N.A. N.A. N.A. N.A.
únicamente 10 mL de cloroformo en cada una.
En el segundo embudo en el que almacenamos el
12 extracto de las 3 agitaciones, añadir 50 mL de solución N.A. N.A. N.A. N.A.
de lavado con probeta plástica.
13 Agitar el embudo vigorosamente durante 30 segundos. N.A. N.A. N.A. N.A.
Material Realizar el Verificación de
Extraer la capa de cloroformo y depositar en un balón volumétrico que procedimiento de Mínimo material
14 aforado de 100 mL clase A, haciendo pasar el extracto a cumpla con los verificación de una vez al volumétrico de
través de un embudo plástico con lana de vidrio. requisitos de material volumétrico año referencia (GAM-
verificación. (GAM-GI-1) FT-101)
Repetir los pasos 13 y 14 otras dos veces agregando 10
15 N.A. N.A. N.A. N.A.
mL de Cloroformo en cada ocasión.
16 Enjuagar el embudo y la lana de vidrio con cloroformo N.A. N.A. N.A. N.A.
Material Realizar el Verificación de
Llevar a volumen con cloroformo el extracto almacenado volumétrico que procedimiento de Mínimo material
17 en el balón aforado y mezclar bien y reposar durante 10 cumpla con los verificación de una vez al volumétrico de
min. requisitos de material volumétrico año referencia (GAM-
verificación. (GAM-GI-1) FT-101)
Leer las muestras y los estándares sobre la curva de
18 calibración a 652 nm antes de 12 horas contra una celda N.A. N.A. N.A. N.A.
de referencia con cloroformo.
19 Realizar los cálculos y reportar los resultados N.A. N.A. N.A. N.A.
Nota 1: Una excesiva agitación en el punto 8 puede Herramientas de control de calidad
provocar emulsión. Para romper las emulsiones se debe
A continuación se describen las herramientas de control de
añadir un volumen menor a 10 mL de propanol. Agregar el
calidad aplicables para el proceso.
mismo volumen a blanco y patrones.
Nota 2: Algunas muestras necesitan más tiempo para
separar luego de la agitación.
Tabla 5: Herramientas de control de calidad
Acciones (en caso de
Herramienta Tipo/valor Frecuencia Descripción
desviación)

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 6 de 28


Patrón de 0.3 mg/L
Cartas de Control
Patrón de 1.8 o 3.5
Curva de calibración
Muestra ciega
Espectrofotómetro
Verificación y uso de
equipos.
Precaución ante
Cambio de matriz
contaminación cruzada
Control de registros
Código
GAM-FT-4
$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$
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Si el blanco o los
Blanco patrones no se
encuentran dentro de
los criterios de
aceptación dados por
la guía de calidad
Se realiza la lectura de 1
analítica del
blanco y 2 patrones por cada
laboratorio se debe
lote.
repetir junto con
mínimo el 20% de las
muestras. Si reitera el
Por lote de 20 muestras
fallo se debe realizar el
procedimiento para
mg/L trabajo no conforme.
Si el resultado no se
Solo aplica cuando el lote encuentra dentro de los
tiene muestras con criterios de aceptación
Dopaje con concentraciones superiores al se debe repetir el
duplicado LCM, de lo contrario solo se dopaje con su
realiza duplicado de una duplicado o solo el
muestra duplicado según sea el
caso.
Se debe repetir la
Cada 2 meses, cambio Se realiza la curva de
curva en caso de que
0.3-4.0 mg/L de analista o de calibración con los puntos
no cumpla con un r2
solución Stock. establecidos.
mayor o igual a 0.997.
De acuerdo a la
Procedimiento de
Interna programación del SIG Aleatoria.
trabajo no conforme.
del laboratorio.
Cada vez que se realiza Se diligencia el formato de
el análisis. uso de espectrofotómetro Si el equipo no está en
óptimas condiciones
no se puede usar y se
debe avisar a apoyo
Balanza con verificación logístico.
Balanza Cada vez que se usa.
diaria.
Se separan las muestras de
Cada llegada de lote de acuerdo a la matriz de donde
N.A.
muestras provengan para realizar la
extracción
Tabla 6: Control de registros
Nombre del formato Almacenamiento
Físico:
Resultados de análisis
\\sdatalab01\DATALAB01\AN\Análisis\E
espectrofotométricos.
spectrofotométricos\Detergentes
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GAM-FT-17 Control de calidad de agua. Físico: Área de DBO.

Digital:
GAM-FT-21 Cartas de control fisicoquímico. \\sdatalab01\DATALAB01\AN\Análisis\E
spectrofotométricos\Detergentes
GAM-FT-25 Control de uso de espectrofotómetros. Físico: Área de Espectrofotometría.
GAM-FT-28 Control de preparación de reactivos. Físico: Área de balanzas.
GAM-FT-34 Control de uso de balanzas. Físico: Área de balanzas.
GAM-FT-83 Cartas control T° y %HR. Físico: En las diferentes áreas de análisis.
Verificación de material volumétrico de
GAM-FT-101 Físico: Archivo de gestión.
referencia.
GEM-FT-157 Cartas control de neveras. Físico: Área de neveras.

en el método y según el intervalo lineal de trabajo

Diseño experimental
Validación:
Para la etapa de validación o confirmación de la
metodología se llevó a cabo un plan que contemplaba los
pasos y requisitos que se planteaban para cumplir las
exigencias tanto de la norma de referencia [CITATION Eat \l
9226 ] como las del manual de calidad del laboratorio
GAM-MC-3. Los análisis desarrollados se llevaron a cabo
con el fin de obtener de forma cuantitativa los
requerimientos generales para la aplicación del método SM
5540 C dentro del laboratorio de la Dirección De
Laboratorio E Innovación Ambiental de la Corporación
Autónoma Regional de Cundinamarca (DLIA-CAR),
dichos requisitos se enumeran a continuación junto con su
procedimiento específico propuesto;
1. Rango Lineal: Se realizaron varias curvas de
calibración con puntos de concentraciones que
permitan cubrir el rango sugerido en la literatura
(0.4 a 2mg/L). Se aplicará prueba de ringbom para
determinar la linealidad y el intervalo lineal con
ayuda del coeficiente de correlación r 2.
2. Límite de detección: Se realizaron análisis de
repetibilidad con blancos de agua destilada para su
posterior análisis en las correspondientes plantillas
estadísticas (GAM-FR-28).
3. Límite de cuantificación: Se seleccionó el patrón
de concentración más bajo dado como referencia
$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$
propuesto. Se realizó un ensayo de repetibilidad y
su respectivo análisis estadístico por medio de las
correspondientes plantillas (GAM-FR-28) para
determinar si cumple con los requisitos para
especificarse como límite de cuantificación.
4. Repetibilidad: Se definieron patrones que se
encuentren dentro del rango lineal de forma que se
abarquen concentraciones bajas, medias y altas de
muestras. Se eligieron muestras que cumplan con
el mismo requisito de los patrones, es decir, que
abarquen todas las posibles concentraciones de la
curva de calibración o intervalo lineal. A dichos
patrones y muestras se les realizaron análisis de
repetibilidad para asegurarnos con base en los
resultados estadísticos que cumplían con los
requisitos de comparación.
5. Repetibilidad intermedia: Se realizó con los
mismos patrones y muestras elegidas para el punto
anterior, pero en este caso los análisis los llevó a
cabo un analista diferente con el fin de realizar
una comparación entre ambos grupos de muestras
y determinar si cumple o no con los requisitos
estadísticos según la plantilla (GAM-FR-28).
6. Recuperación: Se realizó un montaje con las
muestras de concentración alta, media y baja
seleccionadas para los puntos anteriores,
agregando una cantidad conocida del patrón de
referencia LAS para evaluar los resultados de
recuperación obtenidos y determinar si son
estadísticamente repetibles con base en los
resultados de la plantilla (GAM-FR-28).
7. Rango de trabajo: Se realizaron ensayos de
repetibilidad de una muestra con alto contenido de
SAAM para determinar la cantidad de diluciones
que se pueden realizar a una muestra sin
comprometer la validez del resultado. Los
resultados se analizarán por medio de la plantilla
de análisis estadístico (GAM-FR-28) para
determinar si cumplen o no con los requisitos
especificados.
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8. Incertidumbre: Se determinaron las fuentes
correspondientes de incertidumbre con base en la
plantilla para la determinación de las mismas
(GAM-FR-28).
Análisis y discusión de resultados
Al inicio del proceso de verificación de la metodología SM
5540C para el análisis y cuantificación de sustancias
activas al azul de metileno SAAM, se planteó un plan que
se siguió al pie de la letra de inicio al fin, y al cual no fue
necesario realizarle cambio alguno a lo largo del desarrollo
y cumplimiento del mismo.
Se plantearon las partes pertinentes para demostrar la
solidez del método, dichas partes vienen acompañadas de
resultados que las sustentan, tal y como pone a
continuación:
1. Rango Lineal: Si bien en la literatura sugirieron
un rango de 0.4 a 2 mg/L para una alícuota de
muestra de 100mL, se procedió con la ampliación
a ambas partes de la curva manteniendo la
alícuota. Por medio de los resultados descritos en
los anexos se encontró linealidad en un rango de
0.3 a 4 mg/L, lo que nos permitió establecerlo
como intervalo o rango lineal para el proceso.
2. Límite de detección: Una vez se analizaron los
blancos para la determinación de este parámetro,
se encontró que para el espectrofotómetro Thermo
evolution 300, el límite de detección instrumental
a aplicar sería de 0.1042 mg/L.
3. Límite de cuantificación: Para este paso como se
mencionó en el diseño experimental, se seleccionó
el punto más bajo del intervalo lineal obtenido
(0.3 mg/L) para llevar a cabo una repetibilidad de
al menos 7 datos y obtener así que tanto el
coeficiente de variación como el porcentaje de
error se mantienen por debajo del límite permitido
(10%), siento 4.933 y 1.835% respectivamente los
resultados obtenidos.
4. Repetibilidad: En esta sección se llevaron a cabo
los análisis de repetibilidad tanto a 3 estándares
propuestos (0.3, 1.8 y 3.5mg/L), los cuales no se
encuentran como puntos de la curva de
calibración, a excepción del LCM, como a 3
muestras de matriz tanto residual como
superficial. Para estos análisis se detallan los
resultados obtenidos en la sección de anexos. Por
otro lado lo que nos interesa para fines aplicables,
es que tanto los coeficientes de variación como los
porcentajes de error se mantienen dentro del límite
$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$
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máximo de 10%, dando así argumento para la
aceptación de los resultados.
5. Repetibilidad intermedia: Una vez realizada la
repetibilidad del analista 1 para los estándares y
las muestras era necesario realizar los mismos
análisis por parte de un analista diferente para
evaluar si el procedimiento permite obtener los
mismos resultados de forma reproducible. Una
vez analizados los resultados mediante la plantilla
estadística por medio de las pruebas t y f, se
encontró como conclusión que todos los grupos de
datos comparados son estadísticamente iguales.
6. Recuperación: Este aspecto fue evaluado para las
mismas muestras para las que se llevó a cabo el
análisis de repetibilidad de muestra, dando como
resultados recuperaciones del 99.46, 98.43 y
98.74% para las muestras de concentración baja,
media y alta respectivamente.
7. Rango de trabajo: Para la determinación de este
aspecto fue necesario conseguir una muestra de
concentración extremadamente alta tomando
como base los históricos del laboratorio, la
concentración de la muestra luego de la
repetibilidad arrojó un promedio de 89.148 mg/L,
este
8. resultado fue calculado por medio de la
multiplicación del resultado de la máxima
dilución posible, la cual para el caso en cuestión
es de 50 veces, es decir 1 parte de muestra en 50
de solución.
9. Incertidumbre: Para el cálculo de la incertidumbre
se tomaron en cuenta diferentes fuentes, sin
embargo las más relevantes fueron las curvas de
calibración y el análisis de repetibilidad, con los
cuales se obtuvo un valor de incertidumbre
expandida (Uexp) de 0.129, dando como resultado
la siguiente expresión para la incertidumbre:
Ecuación (1):
Xreal=X ± ( Uexp∗X )
Dónde Xreal es la concentración final, X es la
concentración obtenida del análisis y Uexp es la
incertidumbre expandida encontrada en la
confirmación del método.
A continuación se resumen los resultados más
relevantes de la verificación.
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Tabla 7: resumen de resultados

Límite de detección del
0,1042 mg/L
método
Límite de cuantificación del
0,3 mg/L
método
  Bajo Medio Alto
Repetibilidad (Patrones)
%CV|%Error 4,933|1,835 4,670|2,869 3,621|2,016 Estadísticamente
Repetibilidad intermedia   Bajo Medio Alto comparables
(Patrones) %CV|%Error 6,814|3,808 3,303|2,016 2,794|2,578
  Bajo Medio Alto
Repetibilidad (Muestra)
%CV 3,397 1,524 3,600 Estadísticamente
Repetibilidad intermedia   Bajo Medio Alto comparables
(Muestra) %CV 3,683 1,571 4,384
Porcentaje de recuperación Baja Media Alta  
  99,46% 98,43% 98,74%  
Rango de trabajo 0,3 - 4,0 mg/L de SAAM con hasta 50 diluciones
Incertidumbre mg/L de SAAM real = SAAM ± (SAAM*0,129) mg/L
del estándar inferior, pues presentaron mayor
aportación que las demás fuentes al resultado final
a) Ecuaciones de la combinada.

A continuación se presenta la ecuación utilizada  Gracias al análisis del rango de trabajo se logró
para el cálculo de la concentración de las muestras determinar que el método puede ser realizado
con base en la curva de calibración. obteniendo resultados confiables aún para
concentraciones tan altas que requieran hasta 50
diluciones.
Ecuación (2):
 Se deben tener en cuenta para todos los lotes de
mgLAS |−B|
L
=
A
∗d( ) análisis la verificación de la vigencia de la curva
de calibración por medio del montaje de 2
estándares que se compongan del límite de
Además de la ecuación 1 y 2 presentadas cuantificación y un estándar cuya concentración
anteriormente, se emplearon ecuaciones para el se asemeje a las de la mayoría de las muestras
cálculo de la incertidumbre que se describen y presentes en el lote.
mencionan en el documento interno GAM-GI-2.
Control de Cambios
Conclusiones
Revisión Descripción del Autor/Memoran Fecha
 El procedimiento fue satisfactoriamente replicado cambio do/Acta
en las condiciones del laboratorio, con el uso de
los equipos y reactivos proporcionados por el
mismo.
Nota: Para precauciones de seguridad y manejo ambiental
 Tanto la repetibilidad como la reproducibilidad
ver GAM-GI-8 Guía de trabajo seguro y manejo
fue estadísticamente aprobada, dando como
ambiental.
conclusión que el procedimiento lo puede realizar
de forma correcta cualquier analista que cumpla
con el debido entrenamiento para la realización de
la metodología. Referencias Bibliográficas
 Las fuentes de incertidumbre más relevantes
fueron la curva de calibración y la repetibilidad
Eaton, A., Rice, E., & Baird , R. (2017). Standard Methods for the examination of water and wastewater.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 10 de 28

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Malagón, A. S. (2010). Determinaciónd e tensioactivos aniónicos en matrices ambientales. Comportamiento del jabón en
una parcela agrícola. Granada: Departamento de química analítica de la Universidad de Granada.

Ruiz, F. R. (2014). Comportamiento ambiental de tensioactivos comerciales: biodegradabilidad, toxicidad y ozonización.

Granada: Departamento de ingeniería química de la Universidad de Granada.

ANEXOS – \\sdatalab01\DATALAB01\AN\Datos análisis\Surfactantes\SAAM

INFORMACIÓN DE SOPORTE

Linealidad y sensibilidad

A continuación se presentan las curvas de calibración utilizadas para el análisis de sensibilidad y linealidad. Se
partió de la propuesta de un intervalo lineal que abarcaba las concentraciones desde 0.3 mg/L hasta 4 mg/L, los
resultados fueron los siguientes.

Tabla 8: Datos de curvas de calibración para análisis de linealidad y sensibilidad

Concentración
Elemento curva 1 curva 2 curva 3 promedio
mg/L
0,00 -0,0010 0,0000 0,0000 -0,00033
0,30 0,0660 0,0670 0,0720 0,06833
 
0,50 0,1140 0,1120 0,1250 0,11700
1,00 0,2470 0,2780 0,2620 0,26233

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1,50 0,4360 0,4140 0,4210 0,42367

2,00 0,5280 0,5670 0,5630 0,55267
3,00 0,8670 0,8380 0,8700 0,85833
4,00 1,1580 1,1250 1,15800
1,1910
pendiente 0,293611441 0,2846797 0,29901855 0,29243657
2
r 0,997543733 0,9994047 0,998982 0,99930264

1.39500

1.19500
f(x) = 0.29 x − 0.02
0.99500 R² = 1
Absorbancia

0.79500

0.59500

0.39500

0.19500

-0.00500
-0.01 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50
Concentración
Ilustración 1: gráfico de linealidad del promedio de las curvas de calibración.

Se debe tener en cuenta que a pesar de que en la metodología de referencia SM 5540C, indican que como base
para la aceptación de la linealidad, el coeficiente de correlación lineal r 2 debe resultar mayor o igual a 0.995,
dentro del manual de calidad del laboratorio se especifica un valor mayor, el cual es de 0.997 como mínimo,
cumpliendo así de forma implícita con el requisito de la norma.
De esta forma también logramos identificar que el intervalo o rango lineal propuesto para el desarrollo del
método permite obtener resultados confiables y repetibles.

Además del intervalo o rango lineal, podemos usar los resultados de las curvas realizadas para calcular el rango
de sensibilidad sobre el cual debería oscilar toda curva de calibración realizada dentro de las mismas
condiciones con el mismo equipo dentro del laboratorio, el anterior junto con los datos de la curva se presentan a
continuación:
Tabla 9: Resultados análisis de sensibilidad
Pendiente Intercepto Coef. Correlación Límite Sup. Límite Inf.
0,2924 -0,0196 0,9993 0,3071 0,2778

Límite De Detección

Se realizaron análisis de repetibilidad con blancos de agua destilada para su posterior análisis en las corres-
pondientes plantillas estadísticas (GAM-FR-028). Los resultados de la plantilla estadística se presentan a
continuación:

Tabla 10: Resultados Límite de detección

Condición Blancos
1 0,078
2 0,083

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3 0,076
4 0,094
5 0,079
6 0,084
7 0,074
8 0,073
9 0,079
10 0,087
11 0,095
x 0,082
s 0,0074
s2 0,0001
%CV 9,069
n datos 11
Dato Xmin 0,073
Dato Xmax 0,095
Tbajo 1,27
Talto 1,70
Trechazo 2,24
Total Datos 11

LDI 0,1042

Para esta etapa se usaron 11 datos como tamaño de muestra, lo cual es apropiado para cumplir con el mínimo
de datos exigidos para un análisis de repetibilidad dentro de lo establecido por el laboratorio (n=7). Los
resultados de la prueba T por otro lado son satisfactorios indicando que la dispersión de los datos se mantiene
dentro de los límites de aceptación con una confianza del 99%, teniendo en cuenta además que el coeficiente de
variación se encuentra por debajo del 10%.

Límite De Cuantificación

Se seleccionó el patrón de concentración más bajo dado como referencia en el método y según el intervalo lineal
de trabajo propuesto. Se realizó un ensayo de repetibilidad y su respectivo análisis estadístico por medio de las
correspondientes plantillas (GAM-FR-028) para determinar si cumple con los requisitos para especificarse como
límite de cuantificación.

Tabla 11: Resultados límite de cuantificación

Condición LCM
Conc. Esperada 0,300
  Std bajo 1
1 0,283
2 0,326
3 0,311
4 0,313
5 0,326
6 0,288
7 0,297
8 0,311
9 0,292
10 0,310
x 0,306

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 13 de 28

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s 0,0151
s2 0,0002
%CV 4,933
%Error 1,835
n datos 10
Dato Xmin 0,283
Dato Xmax 0,326
Tbajo 1,51
Talto 1,37
Trechazo 2,18

Teniendo en cuenta que los resultados arrojan un coeficiente de variación y porcentaje de error global
aceptables podemos continuar con el análisis dentro del cual podemos detallar de forma específica la
separación de cada resultado respecto al valor teórico de la siguiente manera:

Tabla 12: % de error de los resultados respecto al esperado (0.3 mg/L)

Concentració
%Error
n
0,283 5,7%
0,326 8,5%
0,311 3,5%
0,313 4,3%
0,326 8,7%
0,288 4,1%
0,297 0,9%
0,311 3,6%
0,292 2,8%
0,310 3,2%

Los datos de la tabla anterior se presentan en la siguiente gráfica a través de la cual observamos la diferencia en
la magnitud del error de cada valor respecto a la concentración esperada, sin embargo ninguna supera el 10%
de error permitido por el laboratorio.

LCM
0.450

0.400
Concentración

0.350

0.300

0.250

0.200
0 2 4 6 8 10 12
Muestra

Ilustración 2: %Error del LCM

De lo anterior podemos concluir que es aceptable tomar 0.3 mg/L como límite de cuantificación del método a
trabajar.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 14 de 28

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Repetibilidad

Se definieron patrones que se encuentren dentro del rango lineal de forma que se abarquen concentraciones
bajas, medias y altas de muestras. Se eligieron muestras que cumplan con el mismo requisito de los patrones,
es decir, que abarquen todas las posibles concentraciones de la curva de calibración o intervalo lineal. A dichos
patrones y muestras se les realizaron análisis de repetibilidad para asegurarnos con base en los resultados
estadísticos que cumplían con los requisitos de comparación.

Esta sección se dividió en 2 partes principalmente, las cuales abarcan tanto repetibilidad de estándares como de
muestras.

 Repetibilidad de estándares:

A continuación se mostrará de forma gráfica el comportamiento de los resultados de la repetibilidad realizada

para 3 concentraciones de LAS diferentes que se encuentran dentro del rango lineal establecido.

4.000
3.500
3.000
Concentración

2.500
2.000
(mg/L)

1.500
1.000
0.500
0.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

P0,3mg/L S P1,8mg/L S P3,5mg/L S

Ilustración 3: Concentración de repetibilidad de estándares analista 1

En la gráfica anterior se muestran los valores de concentración obtenidos para cada uno de los estándares en
un tamaño de muestra de n=10, de tal forma que no solo se pueda ver el valor de concentración sino también
que entran todos los resultados dentro de 2 desviaciones estándar. Para verificar que los resultados cumplan
además con el mínimo de %CV (10%) se muestran en la siguiente gráfica los valores de %CV puntuales para
cada resultado con base en la desviación del grupo completo, concluyendo de esta manera que los resultados
fueron satisfactoriamente repetibles por un analista.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 15 de 28

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15.000%
13.000%

% Coeficiente d variación
11.000%
9.000%
7.000%
5.000%
3.000%
1.000%
-1.000% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

P0,3mg/L S P1,8mg/L S
P3,5mg/L S Límite de %CV
Ilustración 4: %CV de repetibilidad de estándares analista 1

 Repetibilidad de muestras:

A continuación se procederá con ilustrar de la misma forma que en la repetibilidad de estándares, pero en este
caso tomando como referencia los resultados obtenidos por medio del análisis a 3 muestras diferentes que no
solo abarcan concentraciones dentro del rango lineal establecido, sino que además son de matrices tanto
residual y superficial.

Repetibilidad de muestras Analista 1

3.500
3.000
2.500
Concentración

2.000
(mg/L)

1.500
1.000
0.500
0.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2761 S 3030 S 2706 S

Ilustración 5: Concentración de repetibilidad de muestras analista 1

Tal y como sucedió con el caso de los resultados de la repetibilidad de estándares, los datos obtenidos por
medio de este análisis se mantienen agrupados dentro de 2 desviaciones estándar respecto al grupo de datos
completo de cada muestra.

También fue posible obtener resultados que se encuentran muy por debajo del límite de %CV, lo que nos
permite asegurar que al igual que para el caso de los estándares, la repetibilidad de las muestras fue
satisfactoria y presenta resultados muy por debajo del límite de aceptación máximo.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 16 de 28

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Repetibilidad de muestras Analista 1

15.00%

% Coeficiente d variación
13.00%
11.00%
9.00%
7.00%
5.00%
3.00%
1.00%
-1.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2761 S 3030 S
2706 S Límite de %CV
Ilustración 6: %CV de repetibilidad de muestras analista 1

Repetibilidad intermedia

Se realizó con los mismos patrones y muestras elegidas para el punto anterior, pero en este caso los análisis los
llevó a cabo un analista diferente con el fin de realizar una comparación entre ambos grupos de muestras y
determinar si cumple o no con los requisitos estadísticos según la plantilla (GAM-FR-028).

Como sucedió en el caso de la repetibilidad mencionada en el punto anterior, en la repetibilidad intermedia

también fue necesario dividir en dos partes el contenido, abarcando así repetibilidad intermedia como resultado
de estándares y de muestras. Las anteriores se describen a continuación.

En las tablas y gráficos ulteriores haremos referencia al analista 1 por medio de una “S” y al analista 2 por medio
de una “R”.

 Repetibilidad intermedia de estándares:

Tabla 13: Análisis estadístico de repetibilidad intermedia de estándares

Condición P0,3 S P0,3 R P1,8 S P1,8 R P3,5 S P3,5 R
Conc. Esperada 0,300 0,300 1,800 1,800 3,500 3,500
  Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Ensayo 5 Ensayo 6
1 0,283 0,334 1,944 1,786 3,761 3,696
2 0,326 0,333 1,841 1,886 3,410 3,580
3 0,311 0,323 1,841 1,831 3,432 3,683
4 0,313 0,296 1,896 1,721 3,597 3,423
5 0,326 0,336 1,948 1,834 3,703 3,534
6 0,288 0,296 1,796 1,702 3,512 3,459
7 0,297 0,321 1,951 1,787 3,707 3,659
8 0,311 0,297 1,699 1,809 3,617 3,677
9 0,292 0,307 1,746 1,871 3,559  
10 0,310 0,271 1,854 1,769 3,408 3,603
x 0,306 0,311 1,852 1,800 3,571 3,590
s 0,0151 0,0212 0,0865 0,0594 0,1293 0,1003
s2 0,0002 0,0005 0,0075 0,0035 0,0167 0,0101
%CV 4,933 6,814 4,670 3,303 3,621 2,794
%Error 1,835 3,808 2,869 0,027 2,016 2,578
n datos 10 10 10 10 10 9
Dato Xmin 0,283 0,271 1,699 1,702 3,408 3,423

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 17 de 28

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Dato Xmax 0,326 0,336 1,951 1,886 3,761 3,696

Tbajo 1,51 1,89 1,76 1,64 1,26 1,67
Talto 1,37 1,14 1,15 1,45 1,47 1,05
Trechazo 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,11
Dato R1 0,2271551 0,3956223 1,4885259   3,8568514 3,2098281
Dato R2 0,2509007 0,3898094 1,9631716   3,3875563  
Total Datos 12 12 12 10 12 10
             
s2 0,000339 n1+n2-2 0,005506 n1+n2-2 0,013584 n1+n2-2
t 0,719 18 1,571 18 0,367 17
tcritico 2,100 a 2,100 a 2,110 a
p valor 0,4812 3 0,1337 3 0,7179 3
Estadísticamente Estadísticamente Estadísticamente
Resultado
Iguales Iguales Iguales
             
F 1,983 indicador 2,116 indicador 1,661 indicador
Fcritico 2,978 10 2,978 10 3,137 10
a 2 10 2 10 2 9
p valor 0,3225   0,2794   0,4862  
Estadísticamente Estadísticamente Estadísticamente
Resultado
Iguales Iguales Iguales

En la tabla anterior se presentan los resultados obtenidos en las repetibilidades realizadas tanto por el analista 1
“S” como por el analista 2 “R” para estándares especificados (bajo, medio y alto) para un mínimo de 7 datos. En
los análisis podemos ver según la prueba T y F que tanto la dispersión de los resultados como los valores de los
mismos son comparables y estadísticamente iguales con una confianza del 95% en ambas pruebas, razón por la
cual se puede asegurar que independientemente de la persona que lleve a cabo el análisis, si es debidamente
capacitado, los resultados deberían seguir siendo confiables.

4.000

3.500

3.000

2.500
Concentración

2.000
(mg/L)

1.500

1.000

0.500

0.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

P0,3mg/L S P1,8mg/L S P3,5mg/L S P0,3mg/L R P1,8mg/L R P3,5mg/L R

Ilustración 7: Concentraciones de repetibilidad intermedia de estándares

Con la gráfica anterior o Ilustración 7, lo que podemos identificar es que además de concentrarse en la misma
zona los grupos de datos tanto de analista 1 como analista 2 para cada estándar, también se mantiene la
totalidad de los datos de cada grupo dentro de un mínimo de 2 desviaciones estándar.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 18 de 28

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 Repetibilidad intermedia de Muestras:

Tabla 14: Análisis estadístico de repetibilidad intermedia de muestra

Condición 2761 S 2761 R 3030 S 3030 R 2706 S 2706 R
Conc. Esperada            
  Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Ensayo 5 Ensayo 6
1 0,611 0,588 1,724 1,716 2,855 3,040
2 0,680 0,657 1,804 1,788 2,943 3,001
3 0,657 0,651 1,784 1,765 3,001 2,928
4   0,666 1,791 1,810 3,014 3,155
5 0,674 0,633 1,766 1,781 3,115 3,062
6   0,647 1,791 1,770 3,053 2,772
7 0,639 0,625 1,783 1,782 2,794 2,854
8 0,656 0,636 1,804 1,784 2,893 2,916
9 0,655 0,661 1,759 1,741 3,102 3,154
10 0,677 0,621 1,745 1,742 3,045 2,854
11 0,677   1,732      
12 0,636   1,763      
x 0,656 0,639 1,771 1,768 2,982 2,974
s 0,0223 0,0235 0,0270 0,0278 0,1073 0,1304
s2 0,0005 0,0006 0,0007 0,0008 0,0115 0,0170
%CV 3,397 3,683 1,524 1,571 3,600 4,384
n datos 10 10 12 10 10 10
Dato Xmin 0,611 0,588 1,724 1,716 2,794 2,772
Dato Xmax 0,680 0,666 1,804 1,810 3,115 3,155
Tbajo 2,03 2,15 1,71 1,87 1,75 1,55
Talto 1,06 1,18 1,25 1,51 1,25 1,39
Trechazo 2,18 2,18 2,29 2,18 2,18 2,18
Dato R1 0,6908721          
Dato R2 0,6876516          
Total Datos 12 10 12 10 10 10
             
2
s 0,000525 n1+n2-2 0,000748 n1+n2-2 0,014257 n1+n2-2
t 1,725 18 0,235 20 0,148 18
tcritico 2,100 a 2,090 a 2,100 a
p valor 0,1016 3 0,8164 3 0,8836 3
Estadísticamente Estadísticamente Estadísticamente
Resultado
Iguales Iguales Iguales
             
F 1,113 indicador 1,059 indicador 1,475 indicador
Fcritico 2,978 10 2,753 10 2,978 10
a 2 10 2 12 2 10
p valor 0,8762   0,9123   0,5718  
Estadísticamente Estadísticamente Estadísticamente
Resultado
Iguales Iguales Iguales

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 19 de 28

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3.500

3.000

Concentración 2.500

2.000
(mg/L)

1.500

1.000

0.500

0.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2761 S 3030 S 2706 S 2761 R 3030 R 2706 R

Ilustración 8: Concentraciones de repetibilidad intermedia de muestra

Como ocurrió para los resultados obtenidos en la repetibilidad intermedia de estándares, en el caso de las
muestras, se consiguieron las mismas conclusiones, ya que como se observa en la tabla 14, los resultados
comparativos de las pruebas T y F demostraron que los grupos muestrales son estadísticamente iguales para
una confianza del 95%, razón por la cual podemos concluir de nuevo que el procedimiento es confiable
independientemente del analista que lo desarrolle, haciendo la salvedad de que el analista debe estar
completamente capacitado para desarrollar el procedimiento.

Recuperación

Se realizó un montaje con las muestras de concentración alta, media y baja seleccionadas para los puntos
anteriores, agregando una cantidad conocida del patrón de referencia LAS para evaluar los resultados de
recuperación obtenidos y determinar si son estadísticamente repetibles con base en los resultados de la plantilla
(GAM-FR-028). Para cada muestra se agregó una cantidad de LAS (a partir de una concentración de 10 mg/L,
siendo necesario realizar dos diluciones en serie de 1:10 cada una, a partir del patrón madre de 1000 mg/L)
acorde a la escala de concentración que presentaba la muestra, dado que se agregó para la muestra superficial
o de baja concentración (2761) una concentración de 0.5 mg/L, para la residual de media concentración (3030)
una concentración de 1.0 mg/L y para la residual de concentración alta (2706) una concentración de 1.0 mg/L.
Los resultados se detallan a continuación:

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 20 de 28

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4.5 110

4
105
3.5

3 100

% de recuperación

Concentración
2.5
95

(mg/L)
2

1.5 90

1
85
0.5

0 80
2761 3030 2706

%Recuperación Concentración inicial Concentración final

Ilustración 9: Relación de concentración y recuperación por muestra

Como demuestra la gráfica, para las 3 muestras empleadas el resultado de la recuperación fue muy cercano al
100%, resultado que cumple a cabalidad con el rango de recuperación exigido de 80-110%.por medio de lo
anterior logramos concluir que la metodología permite realizar un análisis de recuperación preciso, tomándose
así este parámetro como un control para la verificación del correcto funcionamiento del método.

Robustez

Se realizó un análisis de robustez por medio de diferentes equipos, en este caso los resultados si bien fueron
repetibles en cada equipo por separado, se presenta una clara diferencia entre los resultados encontrados
obtenidos por medio de los dos equipos como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 15: Resultados ensayo de robustez en SAN++

3030 por 3030 por
Condición
5540C  SAN++ 
  Ensayo 3 Ensayo 4
1 1,669 0,400
2 1,634  0,400
3 1,538 0,370
4 1,631 0,360
5 1,665 0,360
6 1,624 0,400
7 1,664 0,400
8  1,609 0,370
x 1,629 0,383
s 0,0430 0,0191
s2 0,0018 0,0004
%CV 2,637 4,990
n datos 8 8

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 21 de 28

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La diferencia se pudo atribuir a múltiples factores como lo son la cantidad de alícuota empleada para cada
análisis, ya que para el análisis por flujo continuo, se usa una alícuota considerablemente menor que para la
metodología en espectrofotómetro SM 5540C. Por otro lado los reactivos utilizados difieren, creando una brecha
que impide la comparación de los resultados por medio de dichos métodos.

En este punto debemos considerar que si bien el análisis de comparación no fue satisfactorio en este caso, los
resultados de las repetibilidades realizadas por diferentes analistas (las cuales además fueron realizadas en días
diferentes) fueron completamente comparables, es decir, el método se puede considerar robusto teniendo en
cuenta los resultados presentados en las secciones anteriores.

Rango de trabajo

Se realizaron ensayos de repetibilidad de una muestra con alto contenido de SAAM para determinar la cantidad
de diluciones que se pueden realizar a una muestra sin comprometer la validez del resultado. Los resultados se
analizarán por medio de la plantilla de análisis estadístico (GAM-FR-028) para determinar si cumplen o no con
los requisitos especificados.

Se solicitó una muestra con base en los resultados históricos del laboratorio, de tal forma que la muestra
contuviera la mayor cantidad posible de SAAM. Una vez conseguida esta muestra se procedió con realizar la
máxima cantidad de diluciones permitidas de tal forma que la lectura resultante arrojara un resultado dentro de
los alrededores de la mitad de la curva de calibración, tal como sugieren las BPL. Una vez realizado un estimado
de la concentración de la muestra de forma cualitativa, se determinó que serían necesarias aproximadamente 50
diluciones para obtener el resultado esperado, los resultados de dicho análisis de repetibilidad se presentan en
la siguiente tabla.

Tabla 16: Concentración de repetibilidad de rango de trabajo

Condición 3172 3172 50D
1 94,070 1,881
2 92,460 1,849
3 85,335 1,707
4 88,754 1,775
5 83,819 1,676
6 88,526 1,771
7 89,917 1,798
8 93,106 1,862
9 88,693 1,774
10 90,506 1,810
11 85,789 1,716
12 88,802 1,776
x 89,148 1,783
s 3,1391 0,0628
s2 9,8538 0,0039
%CV 3,521 3,521
n datos 12 12
Dato Xmin 83,819 1,676
Dato Xmax 94,070 1,881
Tbajo 1,70 1,70
Talto 1,57 1,57
Trechazo 2,29 2,29

Con los resultados observados en la tabla previa podemos observar el claro cumplimiento del coeficiente de
variación respecto a los límites especificados, es decir, el conjunto de datos no presenta una dispersión

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relevante, como consecuencia de lo anterior podemos asegurar que con 50 diluciones, los resultados se
mantienen coherentes y repetibles, es decir, es posible realizar el análisis de muestras que contengan dicha
cantidad de SAAM por el método desarrollado en la verificación actual por medio de hasta 50 diluciones hechas
a la misma.

Análisis de sublación

Se llevó a cabo además de los factores incluidos anteriormente, una prueba para determinar la necesidad de
aplicación de una etapa de limpieza preliminar a las muestras de forma previa al análisis llamada sublación, la
cual consiste en hacer pasar a través de la muestra un flujo de nitrógeno burbujeado a través de etil acetato para
almacenar las sustancias activas al azul de metileno en una fase orgánica final que será evaporada dejando una
lámina con dichas sustancias para ser solubilizadas posteriormente en agua dejándola así lista para su posterior
análisis.

A continuación se presentan los resultados de repetibilidad de dicho análisis realizado a una muestra residual:

Tabla 17: Resultados repetibilidad columna de sublación

Condición 3030sinsub 3030consub
Conc. Esperada    
  Ensayo 1 Ensayo 2
1 1,669 1,707
2  1,634 1,505
3 1,538 1,566
4 1,631 1,469
5 1,665 1,539
6 1,624 1,534
7 1,664 1,542
8 1,609  1,476
x 1,629 1,542
s 0,0430 0,0745
s2 0,0018 0,0055
%CV 2,637 4,830
n datos 8 8

1.750 12.00%
1.700
10.00%
1.650
Concentración (mg/L)

1.600 8.00%
1.550
% de error

6.00%
1.500
1.450 4.00%
1.400
2.00%
1.350
1.300 0.00%
1 2 3 4 5 6 7 8

3030sinsub 3030consub %Error

Ilustración 10: Diferencia de concentraciones con y sin columna de sublación

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 23 de 28

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Los datos presentados en la tabla 17 corresponden a dos análisis de repetibilidad comparando los resultados
para identificar si la concentración resultante de la una lectura realizada a una muestra no tratada previamente
con la columna de sublación diferiría en suficiente medida con la de una lectura realizada a la misma muestra
ahora tratada con la columna, de esta manera logramos observar que los resultados son prácticamente iguales;
como se evidencia en la gráfica, la diferencia entre los resultados de los análisis no excede un 10% de error, es
decir que la disminución de la concentración por eliminación de impurezas luego de la sublación es mínima, y
por consecuencia no debería ser rentable el uso de dicha columna teniendo en cuenta los siguientes aspectos
identificados dentro del proceso de verificación;

a) Tiempos de operación sumamente largos por cada muestra.

b) Alto consumo de reactivos e insumos de laboratorio.
c) Se requiere una completa disposición del personal que la manipulará, lo que le impediría al analista a
cargo realizar cualquier otra actividad.
d) Es sólo un proceso de limpieza, lo que implica que después de esto se debe realizar el procedimiento
para la cuantificación de las muestras de forma normal.
e) Según la literatura el procedimiento de sublación limita la cuantificación a surfactantes disueltos debido a
la filtración preliminar, los surfactantes adsobidos en partículas quedarán en el filtrado y no será posible
realizar su cuantificación.
f) Es necesario conocer la concentración aproximada de las muestras para elegir el volumen a ingresar en
la columna de sublación, lo que implica realizar una cuantificación preliminar a la muestra para obtener
dicha información, retrasando el proceso en mayor medida.

La columna de sublación presenta muchos inconvenientes para su aplicación de forma generalizada, lo que se
sugiere para este caso con base en la información obtenida a partir de los ensayos preliminares es que
solamente se haga uso de esta para los casos en los que la naturaleza de la muestra la hagan imposible de
analizar por el método 5540 C aun realizando la mayor cantidad de diluciones posibles.

Condiciones de trabajo

A partir del procedimiento realizado para la verificación del método, no se encontró ningún inconveniente
respecto a las condiciones utilizadas. Puesto que la normativa de referencia no sugiere ni hace la indicación de
alguna condición ambiental específica a controlar, se procede con la especificación de las trabajadas durante el
procedimiento en el laboratorio.

 Temperatura ambiente (20°C)

 Trabajo en cabina de extracción y con máscara antigases.

Las anteriores se presentan debido a que el cloroformo es un reactivo volátil y tóxico, el cual es necesario
mantener bajo control durante su uso, otros parámetros como humedad relativa o presión no serán
especificadas debido a la mínima relevancia dentro del procedimiento.

Incertidumbre
Definición del Mensurando

El mensurando objetivo en este proceso de verificación son las sustancias activas al azul de metileno, la cual es
una sustancia cuya presencia y cantidad se pueden determinar por medio de análisis de laboratorio, para
efectos del presente documento, por medio de un análisis espectrofotométrico UV visible, a través del cual se
logra calcular de forma cuantitativa la presencia del mensurando en cuestión gracias a una curva de calibración
hecha con estándares conocidos que relacionan directamente con el mensurando.

El espectrofotómetro realiza el cálculo por medio de la absorbancia de la muestra a 652 nm, usando la siguiente
ecuación:

Ecuación (2):

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 24 de 28

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mgLAS |−B|
L
=
A( )
∗d

En donde Abs es la absorbancia de la muestra leída por la muestra, A es la pendiente de la curva de calibración
realizada previamente, B es el punto en el que la curva de calibración cruza por el eje “y”, y d es el factor de
dilución que se aplica a la muestra (si se realiza).

Para obtener una descripción más detallada del modelo matemático utilizado a la hora del cálculo de
incertidumbre, remitirse al documento interno GAM-GI-02 (guía para el cálculo de la incertidumbre).

Descripción del método

Tomar 100 mL de muestra y

Leer curva de calibración en
Preparar curva de calibración
el espectrofotómetro y
con estándar de LAS.
almacenar en base de datos.
Adicionar peróxido de
preparar 100 mL de
hidrógeno y ajustar pH a cada
estándares de chequeo y
muestra, blanco y estándar
blanco. Vertir lo anterior en
con fenolftaleina, NaOH y
embudos de separación de
H2SO4.
250 mL.

Agregar 10 mL de cloroformo Extraer el cloroformo y Repetir la extracción dos

Agitar vigorosamente durante
y 25 mL de reactivo azul de depositar en embudos veces más agregando en cada
30 segúndos y dejar reposar.
metileno a cada embudo. limpios. ocasión 10 mL de cloroformo.

Aforar con cloroformo los

Agregar 50 mL de solución de
lavado al cloroformo en el
nuevo embudo y agitar 30
segundos.
Extraer el cloroformo en un
Repetir la extracción dos balones, homogeneizar y leer
balón aforado a través de
veces más agregando en cada en espectrofotómetro sobre
lana de vidrio en un embudo
ocasión 10 mL de cloroformo. la curva de calibración luego
plástico.
de 10 minutos.

Ilustración 11: Diagrama de flujo del proceso

Fuentes de incertidumbre
Por medio de la revisión de la metodología y los puntos más críticos a partir de los cuales cualquier cambio
presentaría una diferencia relevante en los resultados, se logró identificar 3 puntos clave a tener en cuenta
dentro del proceso. En primer lugar está la medición del volumen de la muestra, debido a que para hacer
homogéneo y repetible el proceso, debemos tomar el mismo volumen para el análisis, o bien llevar un volumen
menor de la muestra a 100 mL en caso de realizar una dilución, la cual nos lleva al siguiente punto crítico
identificado; para este caso se tuvo en cuenta la mayor dilución posible según lo arrojaron los resultados de la
confirmación. Por último pero más importante, la incertidumbre debida a curva de calibración, en este caso se
está abarcando la preparación del patrón madre, ya que a partir de ese reactivo se realiza la curva de
calibración, si el proceso no se realiza de forma correcta, los resultados de dicha falta de rigurosidad se verán
reflejados en la curva de calibración, y como consecuencia, los resultados arrojados de las muestras serán poco
confiables.

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 25 de 28

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Incertidumbre
por volumen
Incertidumbre de muestra.
por dilución de
la muestra

Incertidumbre
por curva de
calibración

Incertidumbre combinada
Ilustración 12: Fuentes de incertidumbre

Cálculo de incertidumbres por fuentes

Tabla 18: Cálculo de incertidumbre tipo A

Tipo A. por repetibilidad del método de ensayo

Proceso no Proceso
Patrón inferior (LCM) 0,3mg/l
predecible predecible
x 0,305505177 Umet Urel Urel
s 0,0151 Proceso no predecible 0,04933 0,1614641 0,051059447
n 10 Proceso predecible 0,01560

Tabla 19: Cálculo de incertidumbre tipo B

Tipo B. por caracteristicas del método

1. Volumen de muestra:

Vol medido(mL) 100 Uvol

Desviación 0,5000 0,20412 Ucvol Urel
0,2129358 0,002129358
Dif Temp / Area
5 Utem
(°C)
coefexpación (1/°C) 0,00021 0,06062

2. Por dilución de la muestra:

Dif Temp / Area coefexpación

5 0,00021
(°C) (1/°C)

Volumen tolerancia
Uvol.T Utem Ucvol Urel Urel proceso
medido(mL) (mL)
Tomado 2,000 0,01 0,004082 0,001212 0,004259 0,00213 0,00286
Aforado 100,00 0,1000 0,040825 0,060622 0,073087 0,00073

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 26 de 28

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3. Por la curva de calibración:

X (conc.) X (calculada) y1 (señal) y2 (señal) y3 (señal) yprom

Pto 1 0,000 0,066 -0,001 0,000 0,000 0,000
Pto 2 0,300 0,301 0,066 0,067 0,072 0,068
Pto 3 0,500 0,467 0,114 0,112 0,125 0,117
Pto 4 1,000 0,964 0,247 0,278 0,262 0,262
Pto 5 1,500 1,516 0,436 0,414 0,421 0,424
Pto 6 2,000 1,957 0,528 0,567 0,563 0,553
Pto 7 3,000 3,002 0,867 0,838 0,870 0,858
Pto 8 4,000 4,027 1,158 1,125 1,191 1,158

b m Varx
1 -0,02455259 0,2936114 0,00328
2 -0,01257004 0,2846797 Ucalib
3 -0,02174102 0,2990186 0,05727
promedio -0,01962122 0,2924366

Varb 3,92655E-05 Urel

Varm 5,24359E-05 0,0594
covbm -2,4814E-05
Vary 0,000240333

Incertidumbre expandida y expresión final

A continuación se presentan los resultados de las fuentes de incertidumbre de forma resumida, junto con el valor
de incertidumbre expandida y la expresión final de la misma.

Tabla 20: Expresión final de incertidumbre

Tipo A
Volumen de Dilución Curva de
repetibilida
U combinada: muestra muestra Calibración
d
2,61E-03 4,53E-06 8,18E-06 3,53E-03

U combinada: 0,07840974

Factor de
1,65
cobertura

U exp: 0,129

En este caso se tuvo en cuenta un facto de cobertura de 1.65 debido a que para el presente análisis, según lo
analizado previamente, las fuentes de incertidumbre que más influencian sobre el resultado final presentan una
distribución rectangular debido a que se implementan de forma crítica elementos de medición de volumen
preciso, es decir que los resultados no van a tener una agrupación de distribución normal ni triangular.
Por último, como se mencionó en la sección de resultados del documento, la ecuación que describe la expresión
en la que resulta la concentración teniendo en cuenta la incertidumbre en el método es la siguiente:

Ecuación (1):

Xreal=X ± ( Uexp∗X )

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 27 de 28

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Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Santiago Arturo Amaya Atuesta

Cargo: Contratista Analisis Cargo:

Edwin Giovani García Masmela

Fecha: 30-08-2019 Fecha: Director Técnico DLIA

$str_codigo$ V$str_version$ $str_fechaAprobacion$ Página 28 de 28