Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica analítica de

separación más utilizada, puede utilizarse para análisis de aminoácidos, proteínas,
fármacos, biocombustibles, drogas, hidratos de carbono, grasas, pesticidas,
contaminantes alimenticios, antibióticos, vitaminas o efluentes, analizar
determinados componentes presentes en un material, o medir la actividad
catalítica de un material según el consumo de sustratos o la aparición de los
productos de reacción, entre otras cosas.

La cromatografía líquida de alta resolución viene desarrollándose a pasos

agigantados, debido principalmente a su versatilidad, alta sensibilidad, fácil
adaptabilidad, precisión, la posibilidad de utilizar especies no volátiles o inestables
térmicamente, y su gran aplicabilidad a sustancias de interés para la industria, la
investigación y en general para la sociedad actual.

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un disolvente líquido que contiene a la

muestra en la forma de una mezcla de solutos. Los tipos de cromatografía líquida
de alta resolución suelen clasificarse con base en su mecanismo de separación o
según el tipo de fase estacionaria. Estos incluyen:

1) Cromatografía de 2) Cromatografía de
3) Cromatografía de
partición, o adsorción o
intercambio iónico o
cromatografía cromatografía
cromatografía iónica
líquido-líquido líquidosólido

4) Cromatografía de 5) Cromatografía de 6) Cromatografía

exclusión molecular afinidad quiral.

Los varios tipos de cromatografía líquida tienden a ser complementarios en su

aplicación.
Principales componentes de un instrumento de un instrumento de HPLC:

La HPCL combina una fase móvil líquida y una fase estacionaria finamente
dividida. Con el fin de obtener velocidades de flujo satisfactorias, el líquido debe
ser presurizado a varios cientos o más de libras por pulgada cuadrada.
Para alcanzar las velocidades de flujo razonables para los empacamientos con
partículas que están en el intervalo de 3 a 10 mm es necesario bombear presiones
de varios cientos de atmosferas, las cuales son comunes en la cromatografía
líquida moderna. Debido a estas altas presiones, los equipos para cromatografía
líquida de alta resolución tienden a ser considerablemente más elaborados y más
costosos que los que se utilizan en otros tipos de cromatografía.
Reservorios de fase móvil y sistemas de tratamiento de disolventes:

 Reservorios de fase móvil y sistemas de tratamiento de

disolventes.
 Sistemas de bombeo
 Sistemas de inyección de muestras
 Columnas para HPLC (Columnas analíticas, precolumnas).
 Control de temperatura de la columna
 Detectores para HPLC
Los instrumentos modernos están equipados con uno o más reservorios de vidrio,
cada uno de los cuales contiene un mínimo de 500 mL de disolvente.
Generalmente se toman precauciones para remover los gases disueltos y el polvo
de los líquidos. Los gases disueltos pueden producir velocidades de flujo no
reproducibles y ensanchamiento de banda. Los instrumentos para eliminar gases
pueden consistir en un sistema de bombeo de vacío, un sistema de destilación, un
dispositivo para agitar o calentar, un sistema de burbujeo en el que los gases
disueltos se eliminan de la disolución por medio de pequeñas burbujas de un gas
inerte que no es soluble en la fase móvil.
Una elución con un solo disolvente o una mezcla de disolventes de composición
constante se denomina elución isocrática. En la elución en gradiente, se utilizan
dos (y a veces más) sistemas de disolventes que difieren de manera significativa
en polaridad y cuya composición es variada durante la separación. Las
proporciones de los dos disolventes se varían de manera preprogamada, algunas
veces de manera continua y otras mediante una serie de pasos.
Además, a menudo están equipados con válvulas de dosificación que introducen
líquidos de dos o más reservorios a velocidades que se pueden variar de manera
continua.
Sistemas de bombeo:
Los requerimientos para las bombas utilizadas en cromatografía líquida incluyen:

La generación de presiones de más de 6000 psi (lb/in2).

Salida libre de pulsos.

Velocidades de flujo de 0.1 a 10 mL/min.

Reproducibilidades de flujo relativas de 0.5% o mejores.

Resistencia a la corrosión por una variedad de disolventes.

Se utilizan dos tipos principales de bombas: las bombas tipo jeringa impulsadas
por tornillos y las bombas de tipo émbolo. Las bombas de tipo oscilante se utilizan
en casi todos los instrumentos comerciales. Las bombas tipo jeringa producen una
salida libre de pulsos cuya velocidad se controla con facilidad. Sin embargo, tienen
una capacidad relativamente baja (alrededor de 250 mL) y son poco prácticas
cuando se deben cambiar los disolventes. La bomba de émbolo consiste en una
pequeña cámara cilíndrica que se llena y se vacía mediante
el movimiento hacia atrás y hacia delante de un pistón.
Sistemas de inyección de muestras:

El método más utilizado para introducir las muestras en

cromatografía líquida se basa en un asa de muestras estos
dispositivos suelen ser parte integral de los equipos para
cromatografía líquida y tienen asas intercambiables capaces
de permitir la elección del tamaño de muestra en un intervalo
que va de 1 a 100 mL o más. La reproducibilidad de las
inyecciones con un asa de muestreo típica es de unas
cuantas décimas de un por ciento relativo. Muchos instrumentos de HPCL
incorporan un sistema de muestreo automatizado con un inyector automático.
Estos inyectores introducen volúmenes variables de manera continua a partir de
contenedores en el sistema de muestreo automatizado.
Columnas para HPLC:

Las columnas para cromatografía líquida suelen construirse de tubería de acero

inoxidable, aunque en ocasiones también se utiliza tubería de vidrio o de
polímeros, tales como la polieteretercetona. Además, también hay columnas de
acero inoxidable recubiertas con vidrio o PEEK disponibles. Cientos de columnas
empacadas de diferente tamaño y con diferentes empacamientos también se
pueden comprar con distribuidores de suministros para HPLC.
Columnas analíticas
La mayoría de las columnas tienen una longitud de entre 5 y 25 cm, y tienen
diámetros internos de 3 a 5 mm. Siempre se utilizan columnas rectas. El tamaño
de partícula más común para los empacamientos es de 3 a 5 mm. Las columnas
más utilizadas tienen de 10 a 15 cm de largo, 4.6 mm de diámetro interno y están
empacadas con partículas de 5 mm. Las columnas de este tipo generan de 40,000
a 70,000 platos/m.
Precolumnas

Se utilizan dos tipos de precolumnas. Se utiliza una precolumna entre el reservorio

de fase móvil y el inyector para acondicionar la fase móvil y se le denomina
columna “de desperdicios”. El disolvente se disuelve parcialmente en el
empacamiento de sílice y asegura que la fase móvil se sature con ácido silícico
antes de entrar a la columna analítica. Esta saturación minimiza las pérdidas de la
fase estacionaria de la columna analítica.
Un segundo tipo de precolumna es la columna de protección, posicionada entre el
inyector y la columna analítica. Una columna de protección es una columna corta
empacada con una fase estacionaria similar a la de la columna analítica. El
propósito de la columna de protección es prevenir que impurezas como los
compuestos altamente retenidos y la materia particulada alcancen y contaminen a
la columna analítica.
Control de temperatura de la columna
Para algunas aplicaciones no es necesario tener un control estricto de la
temperatura y las columnas se operan a temperatura ambiente. Sin embargo,
generalmente se obtienen cromatogramas mejores y más reproducibles cuando la
temperatura de la columna se mantiene constante. Los instrumentos comerciales
más modernos están equipados con calentadores que controlan la temperatura de
las columnas en un intervalo que va desde unas décimas de grado con respecto a
la temperatura ambiente hasta los 150 ºC.
Detectores para HPLC
Un detector de hplc debe tener un volumen interno pequeño (volumen muerto)
para minimizar el ensanchamiento de banda adicional de columna. El detector
debe ser pequeño y compatible con el flujo de líquido. Por desgracia, no existe
ningún sistema de detector universal altamente sensible para cromatografía
líquida de alta resolución, así que el detector utilizado dependerá de la naturaleza
de la muestra. Los detectores más utilizados para cromatografía líquida están
basados en la absorción de radiación ultravioleta o visible.

Cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC)

UPLC es una técnica moderna que da una nueva dirección para líquidos
cromatografía. UPLC se refiere a cromatografía líquida de ultra rendimiento, que
se potencian principalmente en tres áreas: “velocidad, resolución y sensibilidad.
Ultra cromatografía líquida de rendimiento (UPLC) aplicable para partículas
inferiores a 2 µm de diámetro para adquirir una mejor resolución, velocidad y
sensibilidad en comparación con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
En el vigésimo primer centenario las industrias farmacéuticas se están enfocando
en nuevas formas de economizar y acortar tiempo para el desarrollo de fármacos.
El análisis de UPLC en el tiempo medio proporciona el mejor la calidad de sus
productos y los laboratorios analíticos no son una excepción en esta tendencia.

La separación y cuantificación en UPLC se realiza a muy alta presión (hasta a 100

MPa). En comparación con HPLC, a alta presión se observa que no cualquier
influencia negativa en la columna analítica y también otros componentes como el
tiempo y el consumo de disolvente es menor en UPLC.

Para mejorar la eficiencia de la UPLC, las siguientes medidas necesitan a realizar:

1. Empleando altas temperaturas que reducen la viscosidad de la fase móvil y, en

última instancia, caudal si es alto. Se reduce significativamente la contrapresión.

2. La característica única del análisis UPLC está interconectada esqueletos y rutas

de flujo interconectadas (poros pasantes) que se encuentran en columnas
monolíticas hacen UPLC técnica diferente a la HPLC. En cromatograma UPLC se
comprueba que se encuentran mejor resolución y separación en comparación con
HPLC junto con un rendimiento más sensible análisis, reduce el consumo de
disolvente y tiene un alto velocidad de análisis
Instrumentación

A. Inyección de muestra

B. Columnas UPLC

C. Detectores

A. Inyección de muestra

En UPLC, la introducción de muestras es fundamental. Inyección convencional

Las válvulas, ya sean automáticas o manuales, no están diseñadas ni
endurecidas. trabajar a extrema presión. Para proteger la columna de extremos
fluctuaciones de presión, el proceso de inyección debe estar relativamente libre de
pulsos y el volumen barrido del dispositivo también debe ser mínimo para reducir
la posible propagación de la banda. Un ciclo de inyección rápido es necesario para
aprovechar al máximo la velocidad que ofrece UPLC, que en el turno requiere una
gran capacidad de muestra. Inyecciones de bajo volumen con traspaso mínimo
también son necesarios para aumentar la sensibilidad Existen también enfoques
de inyección directa para muestras biológicas.

B. Columnas UPLC

La resolución aumenta en una columna empaquetada de partículas de 1,7 μm

porque la eficiencia es mejor. Separación de los componentes de una muestra.
requiere una fase ligada que proporcione retención y selectividad.
Hay cuatro fases unidas disponibles para separaciones UPLC:

(i) ACQUITY UPLCTM BEH C8 (alquilo de cadena lineal columnas),

(ii) ACQUITY UPLCTM BEH C18 (alquilo de cadena lineal columnas),

(iii) ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (polar integrado columna de grupo) y

(iv) ACQUITY UPLC BEH Fenilo (grupo fenilo unido a la funcionalidad sililo con un
alquilo C6)

C. Detectores

Los detectores que se utilizan en el análisis UPLC es un detector UV / Visible. La

detección de analitos se basa convencionalmente en la absorbancia que es
detectores de sensibilidad a la concentración. En UPLC el volumen de la celda de
flujo tendría que reducirse para mantener la concentración y la señal.

Según la ley de Beer, las celdas de flujo convencionales de menor volumen.

También reduzca la longitud de la ruta de la que depende la intensidad de la
señal. Una reducción en la sección transversal significa que la trayectoria de la luz
se reduce y la transmisión cae al aumentar el ruido.

Ventajas de UPLC

• Requiere menos tiempo de ejecución y mejora la sensibilidad.

• Proporciona la selectividad, sensibilidad y rango dinámico de Análisis LC.
• En cromatograma se obtienen picos resueltos.
• Se aplican métodos de residuos múltiples.
• Análisis rápido, cuantifique con precisión analitos y relacionados productos.
• Usos de partículas finas (2μm) para empaque de fase estacionaria agiliza el
análisis.
• Se reducen tanto el tiempo como el coste.
• El consumo de solventes es menor.
• Se analizan más productos con los recursos existentes
• Aumenta el rendimiento de las muestras y permite a los fabricantes para
producir más material que satisfaga o excede las especificaciones del
 producto, eliminando potencialmente variabilidad, lotes fallidos o la
necesidad de volver a trabajar el material.
• Ofrece análisis en tiempo real en sintonía con la fabricación de procesos.
• Asegura la calidad del producto final, incluido el lanzamiento final de
pruebas

Desventajas de UPLC

En el análisis UPLC, la principal desventaja es la vida de columnas, durante el

análisis se desarrolló alta presión debido a que tamaño de partícula. El aumento
de presión reduce la vida útil de las columnas. Debido a una mayor presión
requiere más mantenimiento y reduce la vida de las columnas de estos tipos.
Usando la fase estacionaria de la partícula tamaño 2μm realiza un mejor análisis
sin los efectos adversos de alta presión.

Aplicaciones

En la industria farmacéutica, la demanda de análisis UPLC es muy alta, debido a

las características únicas de UPLC como alta resolución en cromatograma,
análisis de tiempo corto que hacen más trabajo analítico en menos tiempo con
datos valiosos, fiables y auténticos. El científico puede generar datos más precisos
por UPLC de manera más rápida.
El análisis UPLC se puede usar para:

1. Análisis de aminoácidos.

2. Análisis de la medicina natural y la fitoterapia.

3. Análisis de fármacos en plasma humano (por ejemplo, levofloxacina y

metabolitos).

4. Estudio de la metabonómica.

Bibliografía

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