Métodos diagnósticos moleculares en

tuberculosis
Introducción

MYCOBACTERIUM
 Mycobacterium
• Mycobacterium es un género del orden Actinomycetales
• La principal causa de tuberculosis humana
1. M.Tuberculosis
2. M. bovis
• Son bacterias gran positivas sin embargo casi no responden a la tinción gram debido a la alta
cantidad de lípidos en su pared
• Son un grupo de bacterias alcohol ácido resistente
• Paredes celulares inusuales constituidas por aproximadamente 60 % de lípidos incluyendo una
clase única de cadena muy larga, llamados ácidos micólicos (Acidos grasos hidroxilados)
Procedimiento de tinción
clásica
Ziehl-Neelsen
 Fundamento general de la técnica

• Se utiliza para teñir micobacterias y otros organismos ácido resistente

• Esta tinción demuestra la capacidad de ciertas bacterias de resistir a la decoloración por ácidos y
alcoholes, lo cual se correlaciona con su alto contenido en lípidos en la pared celular y presencia de
ácidos micólicos (estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas) que aumentan el
carácter hidrófobo (propiedades de la pared celular de estos microorganismos).
• Característica propia de Mycobacterium tuberculosis.
• Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los
colorantes con mayor facilidad.
 Tinción Ziehl-Neelsen

• La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada
para la identificación de microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género Apicomplexa,
entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y
Friedrich Neelsen, un patólogo.
 Procedimiento general
• En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico.
Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura
cerosa a temperatura ambiente.
• La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y
las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.
Colorante primario
Tinción fluorescente con Auramina-
Rodamina
 Fundamento
• Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a examinar es elevado. Se
fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias por los
colorantes fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina.
• Estos colorantes se fijan a las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo
oscuro.
• Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramina es que luego los frotis pueden ser reteñidos con
la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina
antes el aceite de inmersión.
 Técnica
1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina previamente filtrado. Mantenerlo así
durante 15 min. No hay que calentar.
5. Lavar con agua destilada.
6. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el decolorante y dejar actuar de 3 a 4 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar de 2 a 4 minutos. El permanganato
se utiliza para eliminar la fluorescencia residual de los desechos de fondo. Pero debe evitarse el tratamiento
excesivo con el contra colorante porque puede rebajar la intensidad fluorescente de los bacilos coloreados.
9. Lavar con agua destilada.
10. Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia

Interpretación:
El agudo contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo oscuro ofrece las grandes
ventajas de una fácil, rápida y completa observación. Puede usarse un objetivo de 25X (100X en la tinción
de Ziehl-Neelsen y similares), para observar el frotis, lo que permite la inspección de un área extensa en
poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mínimo esfuerzo visual y la relativa falta de
Importancia de la agudeza para el color del observador.
Automatización de la técnica
Coloración convencional vs Auramina-Rodamina
Baciloscopia y tinciones ácido resistentes
Diagnostico molecular de la
tuberculosis
Amplificación mediada por transcripción (TMA)
Método rápido e isotérmico basado en la amplificación de rRNA 16S. La transcriptasa inversa se utiliza para
copiar rRNA a un híbrido de ADNc-ARN y posterior método de quimioluminiscencia que detecta el complejo
M. tuberculosis por las sondas de ADN específicas.

• El TMA fue la primera prueba aprobada por la FDA en 1995

Eficiencia en el diagnóstico:
1. Bk positivas: Alta especificidad (95%-100%) y alta sensibilidad (91%- 100%) para muestras respiratorias
2. BK negativas: Sensibilidad puede ser tan variable como del 65%-93% y en muestras extrapulmonares (63%-
100%).
• Inconvenientes: La desventaja más importante es la falta de control interno de amplificación y, en
muchas ocasiones, sin posibilidad de automatización
 Amplificación convencional del DNA por PCR.
• Es una de las técnicas convencionales más antiguas, basada en ADN, amplifica un segmento específico del
gen 16S ARNr, seguida de hibridación y detección colorimétrica.
• Este método puede ser automatizado

Eficiencia en el diagnóstico
1. BK positivo (87%-100%) y especificidad esputo BK positivo (91-100%),
2. BK negativo: Sensibilidad (40%-73%),
3. Muestras extrapulmonares :Sensibilidad (27%-98%); Depende del método de extracción usado.
Amplificación de desplazamiento de la hebra(SDA)
• Fue introducido en 1998 como una técnica semi automatizada para la detección rápida del complejo M.
tuberculosis en muestras respiratorias. Es un proceso de amplificación enzimática e isotérmica, para la
generación de múltiples copias de secuencias del gen IS6110 y el gen 16S rRNA, cuyo producto de
amplificación es detectado por el método fluorescente.

BK positivas: Sensibilidad del 90%-100%

BK negativas:30%-85%
 Ensayos en base sólida de hibridización.
• Permite la detección de resistencias de la rifampicina e isoniazida . Esta técnica es específica para
la detección directa de ARN de M. tuberculosis complex y micobacterias no tuberculosas como
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii y Mycobacterium
malmoense, con una buena sensibilidad y especificidad en muestras respiratorias.
 PCR en tiempo real (sigla en inglés RT PCR)
✔ Mayor rapidez y menos problemas de contaminación cruzada.
✔ Numerosas técnicas tales como Cobas Taqman, MTB test (Roche), GeneXpert MTB/Rif (Cepheid
Diagnostics, Ginebra, Suiza) y Light Cycler PCR (Roche) han demostrado alta sensibilidad y
especificidad global, especialmente en muestras respiratorias BK positivas
✔ De acuerdo con los pocos estudios en pediatría el Xpert MTB / RIF es una prueba confiable para el
diagnóstico rápido de tuberculosis en los niños cuando se usa en el esputo inducido, la realización
de dos muestras aumenta sustancialmente el rendimiento diagnóstico de tuberculosis con
baciloscopia negativa.
LAMP (The loop mediate isothermal amplification)
En LAMP, la secuencia objetivo se amplifica a una temperatura constante de 60-65 °C utilizando dos o tres
conjuntos de cebadores y una polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena además de una
actividad de replicación. Típicamente, se usan 4 cebadores diferentes para amplificar 6 regiones distintas en el
gen objetivo, lo que aumenta la especificidad. Un par adicional de "cebadores de bucle" puede acelerar aún más
la reacción. La cantidad de ADN producido en LAMP es considerablemente mayor que la amplificación basada
en PCR.

El producto de amplificación se puede detectar mediante fotometría, midiendo la turbidez causada por
el precipitado de pirofosfato de magnesio en solución como un subproducto de la amplificaciónLa reacción
puede seguirse en tiempo real midiendo la turbidez

Colorantes como SYBR green, se puede utilizar para crear un cambio de color visible que se puede ver a simple
vista sin la necesidad de equipos caros. Las moléculas de colorante se intercalan o etiquetan directamente el
ADN, y a su vez pueden correlacionarse con el número de copias inicialmente presentes; por lo tanto, LAMP
también puede ser cuantitativo. 
LAMP no es útil para la clonación u otras innumerables aplicaciones de biología molecular habilitadas por
PCR. Debido a que LAMP utiliza 4 (o 6) cebadores dirigidos a 6 (u 8) regiones dentro de un segmento
bastante pequeño del genoma, y ​debido a que el diseño del cebador está sujeto a numerosas restricciones,
es difícil diseñar conjuntos de cebadores para LAMP "a simple vista“.
Menos libertad para elegir el sitio objetivo que con la PCR debido a las limitaciones del diseño del cebador.

Debido a que LAMP es isotérmico, lo que erradica la necesidad de costosos termocicladores utilizados en la
PCR convencional, puede ser un método particularmente útil para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas en países de bajos y medianos ingresos.
Es menos sensible (más resistente) que la PCR a los inhibidores en muestras complejas como la sangre,
probablemente debido al uso de una ADN polimerasa diferente (típicamente Bst - Bacillus
stearothermophilus)
Detección exitosa de patógenos de muestras mínimamente procesadas, como sangre tratada con calor, o
en presencia de matrices de muestras clínicas. Esta característica de LAMP puede ser útil en entornos de
bajos recursos o de campo donde una extracción convencional de ADN o ARN antes de las pruebas de
diagnóstico puede no ser práctica.
Detección de mycobacterium
tuberculosis
 1. Detección de mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas
1.1. Técnicas de amplificación no comerciales
Nested-PCR PCR convencional

• IS6110
• MBP64
• rpoB
• hsp65
 1.2 Técnicas de amplificación estandarizados y disponibles comercialmente
• Técnicas de amplificación y revelado automatizado o semiautomatizado

Semiautomátco Automático
AMTD2
COBAS Amplicor

AMTD2 COBAS Amplicor

LCxMTD Amplicor

Mayor
sensibilidad:
Muestras con
baciloscopia
positiva
• Técnicas de amplificación y revelado por hibridación • PCR en tiempo real
en fase sólida
Marcaje con
fluorocromos
Deteccion de Buena sensibilidad
muestra clínica Sondas: TaqMan,
Beacon, FRET

TM PCR kit

Técnicas sensibles
y con buena
especifidad
Identificación
 2. Técnicas de amplificación genómicaAmplificación del gen hsp66
• Polymorphism Restriction Amplification (PRA)

Digestión por 2 enzimas de

restricción

Análisis de polimorfismo en
fragmentos de restricción

• PCR en tiempo real

Identificación a partir de cultivo

sólido o líquido
• Secuenciación
Ilumina sequencing Ion
Torrent

Secuencias más
empleadas:
16S Radn
hsp65

Técnica laboriosa
Nanopor
e
Detección de los mecanismos de resistencia
 3.1. Revelado por electroforesis
Gel de poliacrilamida de alta
resolución ¿Secuencias wild tipe o
mutaciones?
2 variantes

PCR-SSCP Técnica de heterodúplex

Rápido y fácil
 3.2. Revelado por hibridación en fase sólida
2 sistemas comercializados

INNO-Lipa Rif Tb Detecta resistencia a RIF

Detecta resistencia a
GenoType MTBDR-plus RIF e INH

Sondas para las secuencias de los genes rpoB, katG e inhA

Sensibilidad dependiente de la frecuencia con la que se
presentan las mutaciones estudiadas
Epidemiología molecular
 Pirosecuenciación
• Óptimo para secuencias cortas (20-30 bases de ADN)
• Semiautomatizado
• Basada en la detección de pirofosfato liberado cuando se agrega un nucleótido
• Luz emitida por la oxiluciferina, graficada en pirogramas

Mejor alternativa a
técnicas actuales
 Observaciones y conclusiones

• Adicionalmente, se deben incluir las pruebas moleculares para complementar el diagnóstico

clínico, de una manera rápida y sensible, sin reemplazar los métodos convencionales y el
estándar de oro. Por si solos estos diagnósticos moleculares son únicamente presuntivos

• Los pacientes en quienes estas pruebas tienen más utilidad son los pediátricos,
inmunosuprimidos, pacientes con tuberculosis extrapulmonar, paucibacilares y contacto con
pacientes con resistencia confirmada y grupos de riesgo. Una de las limitaciones de las pruebas
moleculares es que no diferencia bacilos muertos de vivos, lo que podría llevar a un falso
positivo; sin embargo, las pruebas que detectan mARN de M. tuberculosis sólo son positivas
cuando la micobacteria está viva, por lo que se utiliza para monitorear la respuesta al tratamiento
antituberculoso.