Síntesis de un polímero magnético de acceso restringido basado en

polianilina para la extracción y cuantificación de antibióticos en leche

Diego Hernando Angulo Flórez1
Edna Carolina Cipagauta Esquivel2
Fundación Universitaria Juan de Castellanos, Universidad de Boyacá
Colombia

En el presente estudio presenta la metodología de determinación de cuatro antibióticos en leche empleando un

polímero conductor de acceso restringido a base de polianilina magnética. El material obtenido se caracterizó por
microscopía electrónica de barrido con espectroscopía de energía dispersiva, termogravimetría, espectroscopía
infrarroja con transformada de Fourier y difracción de rayos X. La preparación de muestra se realizó mediante la
técnica extracción magnética en fase sólida. El método cromatográfico se desarrolló en fase inversa, modo isocrático,
flujo de 1,25 mLmin -1 y detección a 240 nm, la fase móvil compuesta por metanol: tampón fosfato 50 mM pH 6,4
(45:55, v/v). Los parámetros y condiciones optimizadas para la preparación de la muestra fueron: disolvente de lavado
(500 µL de agua), disolvente de elución (800 µL de acetonitrilo/ácido acético (7: 3, v/v)), volumen y pH de la muestra (1
mL y pH 12,5), cantidad de material adsorbente (40 mg RA-MMPAni-HF-CAS) y 60 s de agitación vórtex. El método fue
lineal en el rango 16 a 2000 ngmL -1 con coeficientes de correlación (r) ≥ 0,994 para todos los analitos. El método
desarrollado y validado se aplicó para el análisis de muestras de leche de productores rurales del municipio de Soraca
en Boyacá Colombia.

1
Licenciatura en química, Maestría en docencia de la química, Doctorado en química.
Contacto: dangulo@jdc.edu.co
2
Química de alimentos, Maestría en química.
Contacto: eccipagauta@uniboyaca.edu.co
1. INTRODUCCIÓN

Los antibióticos (ABs) son sustancias que eliminan bacterias y que pueden combatir patologías causadas
por microorganismos que causan infecciones en otros organismos [1]. Aunque pueden usarse
ampliamente contra otros parásitos (protozoos, hongos o helmintos). Pueden ser bactericidas cuando
causan la muerte de bacterias (tetraciclinas, sulfamidas, penicilinas, lincosamidas) [2-5] o bacteriostáticos
(quinolonas, penicilinas de segunda generación) cuando interrumpen su reproducción o inhiben su
metabolismo [6].

Las sustancias antimicrobianas se usan en medicina veterinaria con fines terapéuticos y profilácticos para
tratar o prevenir infecciones. En cualquier caso, los antibióticos deben administrarse bajo el control de un
veterinario y la normativa vigente exige la prescripción de la receta veterinaria [7]. Cuando los antibióticos
se usan correctamente, generalmente combaten las infecciones satisfactoriamente, pero el uso
irresponsable genera resistencia bacteriana, alergias, daños en el tracto gastrointestinal, así como
problemas en el tejido hepático y renal [6-9]. Según lo anterior, el uso de ABs en terapias veterinarias para
tratar infecciones bacterianas es muy común [10-13]. Sin embargo, se debe garantizar la seguridad
alimentaria al tiempo que se garantiza que la calidad de los alimentos, especialmente la leche, es adecuada
para el consumo humano y no presenta ningún riesgo debido a los residuos de ABs en la leche. Para lograr
este objetivo, es importante desarrollar métodos de análisis químicos para identificar y cuantificar los
residuos de los compuestos más comunes presentes en la leche. Entre las técnicas de análisis más
utilizadas se encuentran la cromatografía de gases (GC), la cromatografía líquida de alto rendimiento
(HPLC), algunos métodos analíticos se han desarrollado y validado mediante detección ultravioleta, [12-16]
o detección por arreglo de diodos [14-18]. Ensayos de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS) [18-22]. Otros han utilizado PP para la
cuantificación simultánea de tetraciclinas en muestras de leche [14-22] En general, la mayoría de los
estudios se realizan con SPE convencional, ya sea con C18 tradicional o con MIPs.

La extracción de fase sólida magnética (MSPE) es una variante de la SPE convencional que ha atraído gran
atención en la preparación de muestras en los últimos años. Es un nuevo modo de SPE basado en la
adopción de nanopartículas magnéticas (MNP) como adsorbentes, a escala micro o nano y tiene grandes
ventajas en la ciencia de la separación. El adsorbente magnético es un material con un aspecto aglomerado
y se puede dispersar reversiblemente en soluciones o suspensiones aplicando y eliminando un campo
magnético apropiado [23]. Los analitos pueden recogerse fácilmente y eliminarse rápidamente de la
solución utilizando un campo magnético externo sin más centrifugación o filtración, separando
convenientemente los analitos contenidos en las fases de la muestra [24].

Las nanopartículas magnéticas son generalmente un complejo de Fe 3O4-SiO2 y se sintetizan en más de un

paso, que incluye el recubrimiento de nanopartículas de magnetita de sílice (Fe 3O4-TEOS) para su posterior
funcionalización con el material adsorbente apropiado [25]. Los materiales comunes que se utilizan para
recubrir nanopartículas de Fe3O4-SiO2 modificadas para preparar MNP incluyen C18 [26], carbono
nanoporoso [27], nanotubos de carbono, grafeno [25-28], óxido de grafeno (GO) [29, 30], polímero iónico
líquido [31], polímeros con impresión molecular, materiales a base de sílice mesoporosa [32, 33],
materiales orgánicos metálicos (MOF) y polímeros conductores recientemente [34].

El material adsorbente juega un papel clave en esta técnica de extracción. La naturaleza de los adsorbentes
establece su afinidad con los analitos que deben cuantificarse, determinando así la selectividad del método
de extracción [35-37]. Para mejorar la capacidad de extracción, se han introducido muchos tipos de
nanomateriales como adsorbentes en la técnica de extracción. MCP (polímero conductor magnético) tiene
características superiores de mayor capacidad de adsorción y selectividad, estabilidad y operación simple;
exhibiendo una excelente capacidad de purificación en la preparación de muestras [33-36]. La
miniaturización de MSPE se ha desarrollado satisfactoriamente y una de las ventajas de esta variación es el
uso de cantidades mínimas de solventes (μL) y adsorbentes (mg) para extracción con buenas tasas de
recuperación [38]. Otra ventaja del MSPE es la mejora de la eficiencia de extracción al aumentar el contacto
entre los analitos y el adsorbente, logrando una mayor capacidad para la masa de adsorbente utilizada
[39]. Además, los métodos son favorables para facilitar la transferencia masiva de analitos. Su estrategia
promueve la interacción inmediata entre analitos y adsorbentes, reduce el consumo de solventes orgánicos
y acorta el tiempo de preparación de la muestra [40].

Sin embargo, en muestras complejas, las nanopartículas de óxido de hierro puro (Fe 3O4) tienden a
aglomerarse para formar grandes agregados que pueden reducir las propiedades paramagnéticas
intrínsecas de los materiales [31-40]. Por lo tanto, los cambios en el recubrimiento con moléculas de
proteínas apropiadas son cruciales para superar esta deficiencia, lo que permite la exclusión de proteínas
de matriz complejas como los fluidos biológicos y evita la formación de aglomeraciones en el material.

La PAni es un material polimérico obtenido por la polimerización de la anilina. La PAni se considera una
alternativa innovadora a las necesidades tecnológicas debido a su estabilidad y capacidad de
procesamiento. La PAni existe en muchas formas y se clasifica como reducida y neutra es decir que su
estructura puede ser PAni-NH o PAni-NH2+ protonada, dependiendo de la oxidación del átomo de N. Tales
formas se clasifican de acuerdo con sus constantes térmicas de formación de polímeros [41]. La PAni tiene
una estructura simétrica y conjugada, con un gran desplazamiento de carga que se puede funcionalizar con
muchos compuestos de dopaje. La baja solubilidad es el factor principal para su estabilidad conductiva en
diferentes medios, ya sean acuosos, ácidos o alcalinos [42]. La PAni también tiene una alta conductividad,
que cambia rápidamente después de la exposición al vapor de agua en contraste con la lenta disminución
de la conductividad bajo un vacío dinámico [43]. Las diversas aplicaciones de la PAni incluyen el uso como
material adsorbente en la preparación de muestras, que se ha utilizado en el campo de la ciencia de
separación, como material adsorbente con alta capacidad de adsorción, por ejemplo, clorofenoles de aguas
residuales [43]. También se puede usar como material adsorbente en cartuchos de extracción en fase
sólida (SPE), microextracción en fase sólida (SPME), entre otras técnicas, que aún no están disponibles
comercialmente.

Finalmente los materiales de acceso restringido (RAM) se nombran así por sus tamaños de poro muy
pequeños y que pueden alcanzar el orden de los nanómetros (nm). Por lo tanto, los componentes más
grandes, como las proteínas, se retienen en la fase estacionaria [44]. En 2005, Rbeida y otros realizaron un
análisis de atropina, un alcaloide que puede usarse como antídoto en caso de desintoxicación de
insecticidas organofosforados y gases contaminantes, presentes en el plasma humano y, para ello, la
necesidad de preparación y limpieza de muestras uso un material de acceso restringido. Por lo tanto, la
estabilidad y la selectividad del analito en el proceso de aislamiento depende del tamaño de la cavidad y del
tipo de unión. Una de las ventajas de la RAM es la recuperación de material, es decir, puede usarse varias
veces [45].

2. MÉTODO

2.1 Reactivos y solventes

Estándar analítico TMP 98.85% -99.33% (estándar farmacéutico secundario, material de referencia
certificado de Shandong pharm® (Shandong, SD, China)), estándar analítico DOX 88.45% (estándar
farmacéutico secundario, material de referencia certificado Norbrook® (Newry, EE. UU., Irlanda-Reino
Unido), estándar analítico DOX 88.77% (Estándar farmacéutico secundario, material de referencia
certificado por Huashu pharm® (Shijiazhuang, HEB, China)) y estándar analítico PCN 96.99% (Estándar
farmacéutico secundario, material de referencia certificado por Sandoz® ((Holzkirchen BV, Alemania)) y
utilizado como se recibió. Solvente grado HPLC, tolueno, acetona, tetrahidrofurano suministrado por JT
Baker® (Ciudad de México, MX, México). Reactivo anilina pureza 98% obtenido de Sigma-Aldrich®
(Steinheim, Alemania) y los reactivos de dimetacrilato de glicerol y
2-hidroxietilmetacrilato se obtuvieron de Sigma-Aldrich® (Steinheim, Alemania). El agua se purificó
utilizando un sistema Millipore Milli-Q Plus (Bedford MA, EE. UU.) Hierro (III) cloruro hexahidrato EMSURE®
ACS, Reag (Barueri - SP, Brasil). Tetrahidrato de cloruro de hierro (II) EMSURE® ACS, Reag (Barueri - SP,
Brasil). Hidróxido de amonio (NH4OH 2.8% (v / v)) TOTAL® (Curitiba - PR, Brasil). Ortosilicato de tetraetilo
(TEOS) Sigma-Aldrich® (Steinheim, Alemania) Todos los demás productos químicos utilizados en grado
analítico con la mayor pureza disponible.

2.2 Soluciones de stock y trabajo

Las soluciones madre de TMP, DOX, OXY y PCN se prepararon disolviendo la cantidad exacta
(aproximadamente 10 mg corregida de acuerdo con el grado de pureza) de cada medicamento en 10 ml
de metanol para obtener una concentración final de 1 mg mL-1) Las soluciones madre se almacenaron a -
20 ºC. La solución stock de trabajo para todos los ABs (TMP, DOX, OXY y PCN) se preparó diluyendo las
soluciones estándar en metanol para dar como resultado concentraciones entre 8-1000 ng mL-1. Estas
soluciones se utilizaron para fortalecer las muestras de leche basadas en el MRL.
2.3 Instrumentación y condiciones de separación

Para el análisis cromatográfico, se utilizó un sistema HPLC Agilent modelo 1290 (Agilent Technologies, Palo
Alto, CA, EE. UU.), Compuesto por una bomba cuaternaria (G1311 B), un termostato modelo 1290
(G1330B), un inyector automático modelo 1260 Hip ALS (G1367E), un modelo de horno de columna 1290
O TCC (G1316C) y un detector modelo 1290 VL + DAD (G1315C). Todas las separaciones de analitos se
realizaron en la columna analítica Phenomenex® Gemini C18 (150 mm × 4,60 mm, 5 µm) (Torrance, CA,
EE. UU.). La fase móvil consistió en una mezcla de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 50 mM:
metanol (55: 45, v / v). La fase móvil se bombeó a un caudal de 1,25 ml min-1 y los datos cromatográficos
se obtuvieron a 240 nm utilizando un detector DAD. Todos los procedimientos cromatográficos se
realizaron a 25 °C y el volumen de inyección fue de 20 µL para patrones y muestras. El sistema de datos
de cromatografía Open LAB de Agilent se utilizó para controlar el sistema HPLC y para la adquisición de
datos.

2.4 Síntesis de los materiales.

La PAni con en el recubrimiento de nanopartículas magnéticas se preparó mediante polimerización

química en diferentes etapas. Primero, se sintetizaron nanopartículas de Fe 3O4 usando 15 mmol de
FeCl3.6H2O y 10 mmol de FeCl2.4H2O se disolvieron en 80 ml de agua destilada a 80 °C, obteniendo una
solución amarilla clara, luego se añadieron 50 ml de Solución de NH4OH al 28% (v/v) por gateamiento en
la solución obtenida, bajo agitación durante 30 minutos y control de temperatura fijado a 80 ºC. El
precipitado negro obtenido (nanopartículas de Fe 3O4) se filtró y se lavó repetidamente con agua ultrapura
hasta que el pH de los lavados viró neutro. Finalmente, el precipitado se secó a 60 °C durante 24 h.
Posteriormente se debió funcionalizar las nanopartículas, se pesó en un vaso de precipitados de 500 ml,
2,5 g de Fe3O4, luego se añadieron 250 ml de una solución de etanol: agua (5: 1, v / v) y se llevaron al
ultrasonido durante 20 minutos. Posteriormente, 41,7 ml de solución de NH 4OH al 2,8% (v / v) y 4 ml de
TEOS se añadieron a la solución sonicada anteriormente de forma rápida. La solución permaneció bajo
agitación constante durante 12 h. El sólido marrón obtenido (Fe 3O4-SiO2) se filtró y se lavó repetidamente
con agua ultrapura hasta que el pH de los lavados se tornó neutro, después de lo cual el producto fue
secó a
60 °C durante 24 h.

Ya con las partículas magnéticas modificadas se completó la funcionalización con la anilina para obtener
un polímero mesoporos magnético, este material se obtuvo mediante un procedimiento que se llevó a
cabo mediante disolver en un vaso de precipitados de 1000 mL 5 g de Fe 3O4-SiO2 en 700 ml de agua
ultrapura y esta suspensión se sonicó durante 20 minutos y luego se llevó al agitador magnético durante
30 minutos, en seguida 5 g de cloruro de benzalconio (BAC) (tensioactivo) previamente disuelto en 50 ml
de HCl 1 M fueron agregados conjuntamente con 5 ml de anilina destilada. La solución permaneció bajo
agitación constante en un baño de hielo y se añadieron al medio de reacción por goteo 200 ml de una
solución de persulfato de amonio (que se obtuvo disolviendo 15 g de persulfato de amonio en 200 ml de
HCl 1 M). Durante 6 h para obtener un sólido negro que se secó a 60 ° C durante 24 h. cómo se puede
apreciar en la figura 1.
 Figura 1. Esquema de la síntesis de la MMPAni

A partir de la MMPAni, se procedió a la obtención del material de acceso restringido, la síntesis del
material se realizó disolviendo 5 g de MMPAni mezclado con 4,6 ml de metacrilato de 2-hidroxietilo y 0,59
ml de dimetacrilato de glicerol en 175 ml de cloroformo. El proceso de disolución y mezcla se realizó en
ultrasonido durante 10 min. El producto obtenido (RA-MMPAni-HM) se secó a 60 ° C durante 24 h. Para el
recubrimiento del material se procedió a añadir en un vaso de precipitados de 500 ml, 1,0 g de RA-
MMPAni-HM y 20 ml de una solución de caseína (CAS) al 1% (p / v) y posteriormente se agitó en vortex
durante 1 minuto. Después de eso, la solución se dejó reposar durante 30 minutos y el exceso se eliminó
por decantación. Posteriormente, se añadieron 5 ml de glutaraldehído y se agitó vorticialmente durante 1
min, luego se dejó reposar durante 5 h y se eliminó el exceso. En seguida, se añadieron 10 ml de solución
de NaBH4 al 1% (p / v), se agitó vorticialmente durante 1 minuto y se dejó en reposo durante 15 minutos,
luego se eliminó el exceso. El precipitado se secó a 60 °C en un horno durante 24 h enseguida fue se
lavado con una solución de agua: metanol (1:1, v / v). Al final, el RA-MMPAni-HM-CAS se secó a 60 °C en un
horno durante 24 h. Como se puede detallar en la figura 2

Figura 2. Esquema de la síntesis de la RA-MMPAni-HM-CAS

2.5 Caracterización de la RA-MMPAni-HM-CAS

Se realizaron análisis IRTF, MEV, TGA, DRX, hidrofobicidad y exclusión de proteínas. Los análisis IRTF se
realizaron en el espectrómetro (Bomem Hartmann & Braun, serie MB, Quebec, Canadá) operando entre
4000 y 400 cm-1, con una resolución de 4 cm-1 utilizando el método KBr convencional. La estructura
morfológica del RA-MMPAni-HM-CAS fue investigada por MEV y las imágenes se obtuvieron usando un
microscopio Hitachi Analytical Table Top TM3000 (Hitachi, Tokio, Japón) con un voltaje de aceleración que
oscila entre -5 kV o 15 kV. Los TGA del RA-MMPAni-HM-CAS se obtuvieron mediante el instrumento de
análisis térmico, instrumento TA, New Castle, DE, EE. UU.) Con una velocidad de calentamiento de 10 °C
min-1 con flujo de nitrógeno de 50 ml min-1, utilizando el rango de 25 a 800 °C. Los análisis de rayos X del
RA-MMPAni-HM-CAS se realizaron en el equipo Shimadzu®, modelo XRD-6000 (Shimadzu®, Chiyoda-ku,
Tokio, Japón) con radiación CuKα (λ = 1.54 A°). Los análisis se realizaron en el rango de 2θ operando entre
5 y 75°. La evaluación de la hidrofobicidad de los materiales se evaluó dejando caer una gota de agua
suponiendo que la superficie de los materiales evaluados es lisa, y luego se midió el ángulo de contacto de
la gota con la superficie, en función de θ. Los estudios de exclusión de proteínas se realizaron mediante
espectroscopia de absorción molecular en la región UV utilizando un espectrofotómetro UV-vis Varian-
Agilent Cary 5000 (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE. UU.) Y una cubeta de cuarzo con
trayectoria óptica de 10 nm. Los datos fueron adquiridos entre el rango de 200 a 400 nm.

2.6 MSPE empleando RA-MMPAni-HM-CAS

Este procedimiento se desarrolla a partir de la colocación de 40 mg de RA-MMPAni-HM-CAS en un tubo de

ensayo de vidrio convencional (Figura 4A). Luego, el material se activó con 1 ml de agua y el sistema se
acondicionó usando agitación vorticial durante 60 s. El proceso de extracción y separación de los ABs se
realiza al acercarse a un imán (Figura 4B). Los ABs se recogen en otro tubo de ensayo para el
procedimiento de secado y resuspensión.

Se evaluaron siete parámetros para la optimización del MSPE: disolvente de lavado, volumen del
disolvente de lavado, elución y volumen del disolvente, pH y volumen de la muestra, cantidad de material
adsorbente (RA-MMPAni-HM-CAS) e influencia de la agitación en el vortex (cinética). Las condiciones para
preparar muestras optimizadas fueron: una alícuota de 1 ml de leche enriquecida (pH ajustado a 12.5 con
NH4OH) con 150 ng mL-1 de ABs, 500 μL de agua Milli-Q (solvente de lavado), 700 μL de acetonitrilo: ácido
acético (7:3, v/v) (solvente de elución), 40 mg de RA-MMPAni-HM-CAS y 60 s de vortex. Luego, la solución
eluyente se evaporó para secar en una corriente de nitrógeno y los analitos se resuspendieron en 150 µl
de metanol. Finalmente, se inyectó una alícuota de 20 μl en el sistema de HPLC.

Figura 3. (A) Tubo de ensayo que contiene la muestra y el material RA-MMPAni-HM-CAS después del vortex y (B)
aproximación del súper imán, (C) Separación del material
RA-MMPAni-HM-CAS después del vortex

2.7 Aplicación del método en muestras reales

Para la aplicación del método, se recolectaron 20 muestras reales (50 ml de leche) de supermercados
locales y distribuidores certificados de leche ubicados en la ciudad de Tunja, Boyacá, Colombia. Las
muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se almacenaron en tubos Falcon a -20 ºC.

3. RESULTADOS Y ANÁLISIS

3.1 Condiciones cromatográficas para la determinación de los antibióticos

El método para la determinación de los ABs se desarrolló en un modo isocrático y fase reversa, logrando
así la separación de los analitos de las muestras de leche. Se utilizaron metanol y PBS 50 mM pH 6.6 para
la determinación simultánea de TMP, DOX, OXY y PCN en presencia de posibles interferencias de la matriz
(leche) utilizando una columna Phenomenex® Gemini C18 (150 mm × 4.60 mm, 5 μm) [34]. El pH del PBS
fue un factor importante en la separación de los analitos. Cuando el tampón tiene un pH de 5 (Figura 4A)
no hay una separación adecuada en términos de buena resolución y eficiencia para los TCs. Al cambiar el
pH del tampón de pH 5 a pH 6 (Figura 4B), la resolución mejora significativamente y se produce la
separación de todos los analitos, aunque no se observa una simetría ideal [38]. Luego, se estudió la
proporción de solvente orgánico (metanol) para mejorar la simetría de los picos de separación. Las
proporciones de metanol y tampón se ajustaron de 50% de metanol, 50% de tampón a 45% -55%
respectivamente para obtener una prueba de determinación múltiple rápida y simple con un tiempo de
ejecución razonable, buena simetría, platos teóricos adecuados y una resolución aceptable. Por lo tanto,
se desarrolló un método simple y adecuado para TMP, DOX, OXY y PCN en muestras de leche (Figura 4C).

El cromatograma de las condiciones optimizadas mostró un tiempo de operación total de alrededor de 10

min. Para fines analíticos cuantitativos, la longitud de onda de detección se estableció a 240 nm, lo que
proporcionó una sensibilidad aceptable, mejor reproducibilidad y menos potencial de interferencia (ruido)
que las otras bandas DAD. En estas condiciones, todos los picos tuvieron buenos tiempos de retención,
resoluciones, asimetrías y eficiencias.

Figura 4. (Cromatogramas referentes la determinación simultanea de TMP, DOX, OXY e PCN empleando una
temperatura de 25 °C, flujo de 1,25 mL min−1, volumen de inyección de 20 µL y columna Phenomenex® C18 (150 mm x
4,60 mm, 5 µm), λ=240 nm y composición de fase móvil (a) metanol: 50 mM PBS pH 5 (50: 50, v/v); (b) metanol: 50 mM
PBS pH 6 (50: 50, v/v) e (c) metanol: 50 mM PBS pH 6,6 (45: 55, v/v) (separación optimizada).

3.2 Caracterización de la RA-MMPAni-HM-CAS

Los resultados obtenidos de los espectros IRTF mostraron las señales de absorción a 580 cm -1 y 588 cm-1
de las vibraciones de estiramiento de Fe 3O4, lo que demuestra que las nanopartículas magnéticas se
incorporaron con éxito en todos los materiales (Figura 5, línea negra). Además, la señal más intensa a
570 cm-1 es el producto del estiramiento de Fe 3O4 (Figura 5, línea roja). La banda de absorción a 1068
cm-1 (Figura 5, línea roja, negra y azul) se puede atribuir a la vibración Si-O-Si, mientras que las bandas a
1634 y 3400 cm-1 generalmente se asignan a los grupos de silanol Si-OH de la sílice. Las vibraciones a
1700 y 1606 cm-1 muestran el éxito del recubrimiento de carbono por el anillo aromático de anilina en
Fe3O4. Las bandas entre 3400 cm -1 y 3500 cm-1 corresponden al alargamiento de N-H. La banda a 1488
cm-1 puede atribuirse al anillo de benceno. La banda de 1296 cm -1 está relacionada con las absorciones
de estiramiento C - N (Figura 5, todas las líneas).
 Figura 5. Espectros de IRFT de los materiales obtenidos.

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran las imágenes MMPAni SEM, RA-MMPAni-HM, RA-MMPAni-HM-CAS a 500x
ampliaciones, respectivamente. El MEV mostró que los polímeros presentes en los aglomerados muestran
una estructura aparentemente homogénea, lo que facilita la adsorción de los analitos [41].

Figura 6. Imágenes MEV 500× ampliaciones referentes a (A) MMPAni, (B) RA-MMPAni-HM,
(C) RA-MMPAni-HM-CAS.
Las curvas TGA de los materiales muestran, en términos generales, que son térmicamente estables a
temperatura ambiente y que tienen diferentes perfiles. Para Fe 3O4 (Figura 7 línea negra), se observan dos
eventos térmicos, el primero a 150 °C, una ligera pérdida de masa debido a la evaporación del agua y un
segundo evento térmico a 400 °C, donde la disminución de la masa no es significativa debido a la
estabilidad de la estructura cristalina de Fe 3O4. La figura 7 (línea roja) muestra un evento térmico único a
125 °C donde se estima una ligera pérdida de agua del material, que se estabiliza a esta temperatura sin
perjudicar más la masa debido al aumento de la temperatura.

Figura 8. TGA de los materiales obtenidos.

Para el análisis de TGA de MMPAni, se puede decir que entre 80 y 125 °C hay pérdida de masa debido a la
evaporación del agua de la matriz polimérica. A 355 °C hay una degradación significativa del material
debido a la volatilización incompleta de los componentes de la matriz polimérica, se puede concluir que
hasta 510 °C el material continúa perdiendo hasta el 60% de su masa. El recubrimiento hecho para
MMPAni estabiliza térmicamente el material porque la curva TGA (Figura 8 línea rosa) tiene tres eventos
térmicos a 80 ° C, 200 ° C y 900 ° C. A 80 ° C hay una ligera pérdida de masa debido a la evaporación del
agua, a 200 ° C hay una pérdida de masa del 20%, y se puede decir que hay una ligera degradación de la
matriz polimérica que permanece estable hasta 900 ° C, donde El material pierde casi el 70% de su masa.
Finalmente para RA-MMPAni-HM-CAS, el análisis TGA (Figura 7 línea verde) de la curva muestra tres
eventos térmicos, el primero ocurre a 80 °C con una ligera disminución de la masa por evaporación del
agua, a 250 °C y hasta 600 °C, el material se degrada dejando el 30% de la matriz polimérica intacta debido
a la disminución de la masa. Con base en lo anterior, se concluye que los materiales obtenidos tienen una
estabilidad térmica considerable para las aplicaciones de preparación de muestras por MSPE y que tienen
diferentes características térmicas, lo que demuestra que se sintetizaron diferentes materiales.

Las Figuras 8A, 8B y 8C muestran la actividad de hidrofobicidad de MMPAni, RA-MMPAni-HM y RA-

MMPAni-HM-CAS, respectivamente. Es posible afirmar que la MMPAni mantiene sus propiedades no
polares por las interacciones de los enlaces π-π, por lo tanto, la gota de agua no se adsorbe en relación
con el ángulo de 60 °. RA-MMPAni-HM, tiene en su estructura el monómero hidrofílico que permite la
adsorción de agua, lo que favorece la percolación de la muestra en la fase acuosa. El material recubierto
de caseína tiene una actividad hidrofílica con agua que permite que la muestra se filtre, además de
proporcionar la barrera física para la exclusión de proteínas, además de tener una buena interacción con
las muestras polares.

Figura 8. Imágenes de la prueba de hidrofobicidad por ángulo de contacto de (A) MMPAni, (B) RA-MMPAni-HM e (C)
RA-MMPAni-HM-CAS.
Los resultados obtenidos por XRD (Figura 9A y 9B) mostraron seis picos de difracción en el espectro de
Fe3O4, las vibraciones ocurren a 220°, 311°, 400°, 422°, 511° y 440°, que corresponden a la base del
comportamiento de la magnetita (óxido de hierro).

Figura 9. Imágenes de la prueba de hidrofobicidad por ángulo de contacto de (A) MMPAni, (B) RA-MMPAni-HM y
(C) RA-MMPAni-HM-CAS.

También es posible observar el mismo patrón de vibraciones que se puede atribuir a la repetición de
unidades de Fe3O4, como lo demuestra la polimerización alrededor del núcleo de magnetita.

La prueba de exclusión de proteínas tiene como objetivo excluir macromoléculas que generalmente están
presentes en matrices complejas, como en el caso de las muestras de leche. Para esta prueba, se pesaron
40 mg de cada uno de los tres materiales (MMPAni, RA-MMPAni-HM y RA-MMPAni-HM-CAS) y se colocaron
en tubos de ensayo que contenían 3 ml de CAS (0.1 % m/v), que se utilizó como matriz compleja para la
prueba. Cada tubo se agitó durante 60 s, con una agitación constante de 2000 rpm utilizando el vortex.
Después de agitar, la solución se analizó por UV-Vis en un rango de 200 a 400 nm. Todas las pruebas se
realizaron por duplicado y luego se compararon con la solución CAS (0.1% p /v) que no se puso en
contacto con los materiales adsorbentes (100% de exclusión, señal de no adsorción =100% de exclusión).

Además, permite evaluar si el material ha sido recubierto adecuadamente con CAS, lo que le dará al
material la característica de excluir macromoléculas de matrices complejas, como la leche. La figura 11
muestra las curvas de absorción del estándar CAS y de los tres materiales sintetizados por UV-Vis. Cuando
la MMPAni estuvo en contacto con el estándar CAS, absorbió una pequeña cantidad de CAS, lo que resultó
en una menor absorción de CAS en UV-Vis. A partir de esto, y sabiendo que las matrices alimentarias,
como en el caso de la leche y sus derivados, tienen macromoléculas, los materiales recubiertos se
aplicarían mejor y eliminarían una mayor cantidad de interferencias presentes en este tipo de matrices.
Los porcentajes de exclusión de proteínas (caseína) para MMPAni, RA-MMPAni-HM y RA-MMPAni-HM-CAS
fueron 84.88%, 96.84% y 99.76%, respectivamente. Estos valores indican que los materiales recubiertos
excluyen CAS casi por completo en comparación con los materiales no recubiertos, lo que permite la
exclusión de macromoléculas y los monómeros peptídicos de aminoácidos presentes en muestras
complejas

Figura 10. Prueba de exclusión de proteínas de CAS.

3.3 Optimización de la preparación de muestras empleando RA-MMPAni-HF-CAS-SPE

Para extraer eficientemente TMP, DOX, OXY y PCN en muestras de leche mediante MSPE empleando RA-
MMPAni-HM-CAS, se evaluaron algunos parámetros como solvente de lavado, solvente de elución, cantidad
de material (RA-MMPAni-HM -CAS), efecto de pH, volumen de muestra y eluyente, volumen de disolvente
de lavado y efecto cinético (tiempo de agitación). Es imprescindible evaluar y optimizar el disolvente de
lavado, ya que debe eliminarse la mayor cantidad de impurezas e interferencias en las muestras. No solo
para minimizar las interacciones no específicas entre RA-MMPAni-HF-CAS y los analitos, sino también para
preservar la vida de la columna cromatográfica. Se realizó una etapa de lavado después de cargar con 1 ml
de la muestra el tubo de ensayo junto al material adsorbente. Se evaluaron tres solventes no polares y tres
polares (300 µL): hexano, tolueno, cloroformo, tetrahidrofurano, agua ultrapura y acetona. Para eliminar las
impurezas hidrofílicas, se estudió el efecto de los solventes polares como solvente de lavado. Los
disolventes no polares también se utilizaron para evaluar la eliminación de impurezas no polares. Los
resultados mostraron bajas recuperaciones para todos los solventes de lavado, como se muestra en la
Figura 13. Las recuperaciones de hexano fueron del 5,73% para TMP; 18.07% para OXY; 11.92% para DOX y
11.21% para PCN. En el análisis realizado con tolueno, las extracciones fueron 16.03, 16.00, 19.60 y 17.44%
para TMP, OXY, DOX y PCN, respectivamente. Para el cloroformo, las recuperaciones fueron 5.21, 16.46,
16.12 y 17.03% para TMP, OXY, DOX y PCN, respectivamente. Para THF, las recuperaciones fueron de 15.97,
4.35, 10.62, 4.19%, para TMP, OXY, DOX y PCN. Para la acetona, las recuperaciones fueron 16.26, 4.75, 7.75,
14.06%, para TMP, OXY, DOX y PCN. Para agua ultrapura, las recuperaciones fueron 3.40, 3.82, 2.24, 3.41%,
para TMP, OXY, DOX y PCN. Estos datos (Figura 11) mostraron que el agua eliminó la interferencia de la
matriz con una baja recuperación, lo cual es altamente deseable.
 Figura 11. Efecto del solvente de lavado en la recuperación de los analitos.

Según los resultados, y viendo la necesidad de eliminar la mayor cantidad de interferencias, ya que la leche
es una muestra compleja. El volumen del disolvente de lavado se ha optimizado. En (Figura 12) se observa
que 100 µL de agua eliminan suficientes interferencias, pero se eluye una cierta cantidad de analitos. 9.69%
TMP, 7.65% OXY, 6.85% DOX y 5.56% PCN. 500 µL elimina una buena cantidad de interferencia sin la
consiguiente pérdida de analitos basada en la recuperación de 3.53%, 3.78%, 2.63% y 3.66% para TMP, OXY,
DOX y PCN, respectivamente. Por otro lado, mayores cantidades de agua ultrapura tienen el mismo efecto;
por lo tanto, la cantidad apropiada de disolvente de lavado (agua ultrapura) se fijó en 500 µl.

Figura 12. Efecto del volumen de solvente de lavado.

El efecto del pH de la muestra fue un parámetro fundamental para la extracción de los analitos, ya que el
control del pH favorece la recuperación de especies orgánicas en muestras biológicas dependiendo de su
disociación en medio acuoso. El efecto del pH de la muestra sobre la eficiencia de extracción para los
analitos se investigó usando soluciones con valores de pH entre 2.5 y 12.5 (Figura 13). Los resultados
mostraron menores recuperaciones en el pH ácido (2.0 y 5.0), con valores que van del 20 al 50%, con la
excepción de OXY, que es 58.07% y PCN, que es 15.29%. Mientras que a pH 12.5, las recuperaciones
fueron de alrededor del 70%, aunque la recuperación del PCN se mantuvo con valores bajos de alrededor
del 30%. Los valores de pKa para TMP, OXY, DOX y PCN son 7.12 ± 0.10, 9.56 ± 0.10, 7.46 ± 0.10 y 13.84 ±
0.10, respectivamente. Las condiciones básicas (pH 12.5) favorecieron las interacciones de los analitos con
RA-MMPAni-HM-CAS por interacciones intermoleculares del tipo REDOX además del enlace de hidrógeno,
lo que justifica la alta recuperación de analitos por la interacción con el solvente de elución.
 Figura 13. Efecto del pH de la muestra en la recuperación de los analitos

Encontrar el solvente de elución apropiado es muy importante para mejorar las propiedades de adsorción
de RA-MMPAni-HM-CAS y no subestimar la técnica MSPE. El eluyente generalmente está limitado a
solventes que no lo afectan. Debido a las características REDOX de RA-MMPAni-HM-CAS, es posible evaluar
diferentes solventes sin el riesgo de limitar sus propiedades. Este estudio se realizó con metanol,
acetonitrilo, etanol, hexano, acetonitrilo: ácido acético (7:3 v/v), acetonitrilo: ácido fórmico (9:1, v/v),
metanol: ácido acético (9:1, v/v), metanol: ácido fórmico (9:1, v/v), metanol: ácido acético (7:3, v/v) y
metanol: ácido fórmico (5:1, v/v) (Figura 14).

Figura 14. Efecto del tipo de solvente de elución. Solventes de elución: (1) etanol, (2) hexano, (3) metanol, (4)
acetonitrilo, (5) metanol: ácido acético (9:1, v/v), (6) metanol: ácido acético (7:3, v/v), (7) metanol: ácido fórmico (9:1,
v/v), (8) metanol: ácido fórmico (5:1, v/v), (9) acetonitrilo: ácido acético (7:3, v/v), (10) acetonitrilo: ácido fórmico (9:1,
v/v).

Según los resultados (Figura 15), las recuperaciones del analito se producen satisfactoriamente con
volúmenes superiores a 500 µL de acetonitrilo: ácido acético (7: 3, v / v). Se evaluaron volúmenes de 700,
800 y 1000 µL. Con 700 µL, las recuperaciones de TMP y DOX alcanzaron 89.68% y 83%, respectivamente,
pero en el caso de PCN, la recuperación fue de 69.09%. En base a lo anterior, los analitos se eluyeron con
800 µL, donde la recuperación de TMP y DOX alcanzó valores de recuperación superiores al 90%, la
recuperación de OXY permaneció estable en 83% y aumentó significativamente la recuperación de PCN a
81.01%. Con 1000 µL no hay un aumento significativo en la recuperación, ya que los valores son similares
a los obtenidos con 800 µL. Por lo tanto, se seleccionaron 800 µL como el volumen de eluyente en
experimentos posteriores.
 Figura 15. Efecto del volumen de solvente de elución

Se evaluaron algunas cantidades de RA-MMPAni-HM-CAS: 5, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 mg en el proceso de

adsorción. En la Figura 16, se puede ver que la cantidad de 40 mg y 50 mg fue buena para recuperar todos
los analitos, con una recuperación de alrededor del 95%. Con la excepción de PCN, que mantiene su
recuperación en 84.75%. Hay una mejora significativa en esta etapa de optimización de preparación de
muestras. Por lo tanto, todos los análisis RA-MMPAni-HC-CAS se realizaron con 40 mg para la preparación
de la muestra.

Figura 16. Efecto de la cantidad de adsorbente (RA-MMPAni-HM-CAS)

El efecto del volumen de la muestra se estudió cargando el tubo de ensayo conjuntamente con la RA-
MMPAni-HM-CAS, 200, 500, 750 y 1000 µL de las muestras de leche fortificadas. Los resultados mostraron
buenas recuperaciones usando 750 µL, mostrando una recuperación de 93.48% para TMP, 96.66% para
OXY, 96.42% para DOX y 88.03% para PCN. Además, 1000 µL muestran una recuperación de 99.37% para
TMP, 98.60% para OXY, 99.65% para DOX y 93.16% para PCN (Figura 17). Estos valores son muy cercanos,
por lo que se seleccionó emplear alícuotas de 1.0 mL para todos los experimentos
 Figura 17. Efecto de la cantidad de adsorbente (RA-MMPAni-HM-CAS)

Los resultados indicaron que la recuperación de los analitos disminuyó con el menor tiempo de agitación
en el vórtice, pero se mantuvo estable después de 60 s de agitación. En conclusión, un minuto fue el
tiempo óptimo para lograr una recuperación de más del 90% de todos los analitos presentes en las
muestras analizadas de RA-MMPAni-HC-CAS. Se estudió el efecto de la cinética sobre el tiempo de
agitación del vortex en 15, 30, 60, 90 y 120 s

Figura 18. Efecto del tiempo de contacto

3.4 Aplicación en muestras reales

Las recolecciones de muestras para el desarrollo del estudio provienen de supermercados locales y
distribuidores certificados de leche ubicados en la ciudad de Tunja, Boyacá, Colombia. Se recogieron
muestras de leche después de la comercialización para consumo humano y se analizaron por triplicado (n
= 3). No se detectó TMP en ninguna de las muestras analizadas, y es posible afirmar que no se usa
comúnmente de forma individual, sino en una mezcla con SM. DOX se detectó individualmente en una
sola muestra (muestra 13) a una concentración permitida dentro del MRL establecido por las autoridades
responsables. Además, se detectó una mezcla de DOX y OXY en dos muestras (muestra 1 y muestra 9), lo
que nos permite afirmar que se realizó un tratamiento con CT. En doce muestras analizadas (ver Tabla 1),
se detectó la presencia de OXY dentro de los límites máximos permitidos para proteger la salud humana.
Ha sido posible cuantificar en bajas concentraciones (40.44 ± 2.79 ng mL -1 de valor promedio) en la leche,
como se puede ver en la Tabla 1 y en la Figura 19 (línea negra, muestra 1). Estos valores son cercanos a los
descritos en la literatura [40]. La muestra 2 mostró la presencia de PCN con una concentración de 23.34 ±
2.79 ng mL-1, una concentración permitida basada en el MRL establecido. Finalmente, cinco muestras
(muestras 15-19) no mostraron ningún AB a una concentración detectable para el método desarrollado.
Tabla 1. Actores participantes en la investigación

Concentración (ng mL-1)

TMP DOX Σ OXY σ PCN σ
Muestra 1 n.d 30.57 2.24 58.88 2.14 n.d n.d
Muestra 2 n.d n.d n.d n.d n.d 24.34 2.19
Muestra 3 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 4 n.d n.d n.d 12.81 1.23 n.d n.d
Muestra 5 n.d n.d n.d 27.25 1.67 n.d n.d
Muestra 6 n.d n.d n.d 42.48 2.09 n.d n.d
Muestra 7 n.d n.d n.d 64.08 2.88 n.d n.d
Muestra 8 n.d n.d n.d 27.22 2.14 n.d n.d
Muestra 9 n.d 77.84 2.39 40.86 1.41 n.d n.d
Muestra 10 n.d n.d n.d 26.43 1.42 n.d n.d
Muestra 11 n.d n.d n.d 27.45 3.99 n.d n.d
Muestra 12 n.d n.d n.d 89.99 2.18 n.d n.d
Muestra 13 n.d 87.44 1.62 n.d n.d n.d n.d
Muestra 14 n.d n.d n.d 75.43 1.74 n.d n.d
Muestra 15 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 16 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 17 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 18 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 19 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Muestra 20 n.d n.d n.d 31.12 3.00 n.d n.d

Figura 19. Cromatogramas obtenidos para el análisis de: Muestra real (línea roja); Muestra de leche sin ABs (blanco)
(línea negra) y Muestra de leche fortificada con ABs (150.0 ng mL-1) (línea azul).

4. CONCLUSIONES

En este trabajo, se desarrolló un nuevo método de determinación múltiple de TMP, OXY, DOX y PCN en
Muestras de leche utilizando RA-MMPAni-HM-CAS acoplado a HPLC. La preparación de Muestras
demostró ser económica, rápida y fácil de operar. Además, el MSPE es un procedimiento respetuoso con
el medio ambiente, ya que se manejan cantidades mínimas de solvente orgánico (μL) para el proceso de
optimización de la preparación de la muestra, sin una variabilidad significativa en los datos analíticos. El
RA-MMPAni-HM-CAS mostró una excelente eficiencia de extracción (alrededor del 90%) para todos los ABs
estudiados. Su caracterización mostró la presencia de bandas y vibraciones características de los grupos
funcionales, buena estabilidad térmica con degradación de la matriz polimérica alrededor de 500 °C con
partículas de tamaño homogéneo. Finalmente, el rendimiento analítico mostró robustez, precisión,
exactitud, linealidad, sensibilidad y estabilidad adecuadas a las pautas recomendadas. Además, esta
metodología se puede aplicar al monitoreo de ABs en Muestras de leche con potencial para otras
matrices, lo que se destaca en relación con las metodologías usuales que son solo con TCs.

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