INFORME LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

CUANTIFICACION DE PROTEINAS: MÉTODO DE BRADFORD

ANA MARIA GONZALEZ BARRIOS C.C.1000871529

MARIANA RAIGOZA ARANGO C.C. 1214745819

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

ARLEY CAMILO PATIÑO LLANO

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS
 2021

OBJETIVOS

Objetivo general:

● Determinar la concentración de proteínas de una muestra desconocida a partir de

una curva de calibración de albúmina, usando el método de Bradford.

Objetivos específicos:

● Realizar una curva de calibración patrón de albúmina para el análisis de

resultados.
● Calcular el contenido de proteína total contenida en las muestras, mediante el
método de Bradford.
● Comparar e interpretar los resultados obtenidos con la muestra problema.
 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFORD
MARCO TEÓRICO

El método de Bradford fue descrito, como su propio nombre indica, por el científico
americano Marion Mckinley Bradford, en el año 1976. En primer lugar, es necesario
destacar que se trata de un método espectro métrico, con un analito (el componente de
interés que se quiere separar de la matriz). Además de esto, cabe señalar que se trata de
un método de naturaleza colorimétrica, es decir, que obtiene resultados en base a los
colores y su concentración en una solución concreta. La clave de este conglomerado
terminológico se encuentra en el colorante “azul de Coomassie”, ya que en el método de
Bradford se cuantifican los cambios en su absorbancia según ciertos parámetros. Este
colorante se muestra azul en su forma aniónica, verde en la neutral y rojo en la catiónica.
(1)

El comportamiento de unión se atribuye a las fuerzas de Van der Waals y las

interacciones hidrofóbicas. La interferencia del ensayo por bases, detergentes y otros
compuestos se explica en términos de sus efectos sobre los equilibrios entre las tres
formas de colorante. En este sentido, la forma catiónica del colorante es roja, la cual,
corresponde a la forma doble protonada y su máximo en el espectro de absorción se
encuentra a una longitud de onda entre 465 y 470 nm, la forma neutra es verde, y
corresponde a la forma simple protonada y tiene su pico de absorción a 650 nm. En
cambio, la forma aniónica, corresponde a la forma desprotonada, su carga se debe al
grupo sulfónico, es azul y la absorción máxima corresponde a una longitud de onda de
aproximadamente 595 nm. (2)

 Coomassie Brilliant Blue G-250 a proteínas. La unión del colorante a la proteína provoca
un cambio en el máximo de absorción del colorante de 465 a 595 nm, y es el aumento de
la absorción a 595 nm lo que se controla. Este ensayo es muy reproducible y rápido con el
proceso de unión del tinte prácticamente completo en aproximadamente 2 minutos con
buena estabilidad del color durante 1 hora. Hay poca o ninguna interferencia de cationes
como el sodio o el potasio ni de carbohidratos como la sacarosa. Se desarrolla una
pequeña cantidad de color en presencia de agentes amortiguadores fuertemente
alcalinos, pero el ensayo puede ejecutarse con precisión mediante el uso de controles
amortiguadores adecuados. Los únicos componentes que dan un color de interferencia
excesivo en el ensayo son cantidades relativamente grandes de detergentes como el
dodecilsulfato de sodio, Triton X-100 y detergentes comerciales para cristalería. La
interferencia de pequeñas cantidades de detergente puede eliminarse mediante el uso de
controles adecuados.(3)
La absorbancia está relacionada con la tramitación de forma logarítmica, y la ley de Beer-
Lambert propone una relación lineal entre la absorbancia de una solución y su
concentración, su coeficiente de extinción molar y el coeficiente óptico de la solución; la
ecuación matemática que describe esta ley es la siguiente:
A (absorbancia) = ε (coeficiente de extinción molar) c (concentración) l (longitud del paso
de luz)
concentración de una solución se calcula despejando dicha incógnita de la ecuación y
realizando los cálculos pertinentes (c = A/εl) (4)

En conclusión, lo que se hace en el método de Bradford es “aumentar” el valor de

absorbancia de las proteínas mediante la unión a un colorante, es decir
El método de Bradford cuantifica la unión entre un colorante y una proteína, y compara su
señal a595nm con soluciones patrón de la misma, una de las ventajas de este método es
que es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación y a modo de desventaja presenta interferencia con los detergentes, las
soluciones básicas y proteínas glicosiladas.(1)(2)

DATOS Y METODOLOGÍA

 Para esta práctica preparamos 7 tubos donde se depositó 200 µl de cada una de
las diluciones preparadas, posteriormente se adiciono 3 ml del reactivo azul de
coomasie, y luego, se dejó en la oscuridad y en reposo por 5 min, posteriormente
se lee la absorbancia a 595 nm contra un blanco correctamente preparado en el
espectrofotómetro.

 para determinar la concentración de la muestra problema, se debe adicionar a 100

µl de ésta 3 ml de azul de coomasie, y proceder interpolando en la recta de
calibración y haciendo los ajustes necesarios, por ejemplo, en la práctica nos dio
un valor por encima de tubo 1 por lo cual volvimos a diluir para obtener la
absorbancia.

 finalmente, utilizar análisis de regresión lineal simple para el análisis de los datos.
(5)

RESULTADOS
ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
CONCLUSIONES
 PREGUNTAS

1. ¿Cuál es la base del método?

R=/ La base del método de bradford consiste en la variación de absorbancia
producida por el cambio de color del azul de coomasie., y entre mayor es la
concentración de proteína, más azul se va a volver. Por tanto, se basa en su forma
aniónica, la cual , corresponde a la forma desprotonada, su carga se debe al grupo
sulfónico, es azul y su absorción máxima corresponde a una longitud de onda de
595 nm. (5)

2. ¿Cuáles son las interferencias del método?

R=/El método muestra interferencias con: detergentes (SDS, Triton X-100, etc.),,
soluciones básicas y proteínas glicosiladas .(1)(3)

3.Investigue otros métodos de cuantificación de proteínas

R=/
 Método de Biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el
Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se
acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la
cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y
sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).

 Método Lowry:Su rango de concentración se encuentra entre entre 0.01–1.0

mg/mL. y se basa en la reacción del Cu +, producido por la oxidación de los enlaces
peptídicos, con el Reactivo de Folin-Ciocalteu. Pues, combina la reacción de iones
de cobre con los enlaces peptídicos en un medio alcalino con la oxidación de residuos
aromáticos de las proteínas. Y sus ventajas, se caracterizan porque tiene bastante
sensibilidad, mientras que, sus desventajas radican en que: no todas las proteínas
reaccionan igual, muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos,
sulfato amónico etc.

 Método de BCA: El ácido bicinconínico, es una sal sódica, capaz de formar un

complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la
base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una
reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino. La estabilidad del
 reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas
que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. Y
sus ventajas, se caracterizan porque es el método más sensible y es el que
muestra menos interferencias.

● Absorción ultravioleta: Su rango de concentración se encuentra entre 0,1-100

ug/ml.Además, se basa en la medición de la absorción , característica que
presentan la tirosina y el triptófano a 280 nm, estima la cantidad de proteína en la
muestra. Y sus ventajas, se caracterizan porque no se pierden las muestras,
mientras que, sus desventajas radican en que Interfieren muchos compuestos que
absorben en el UV.

● Método de derivados fluorimétricos: para este método se usa o-ftalaldehído.Su

rango de 1-5 λexcitación es de 340 nm y de λemisión a 475 nm. Para determinar
el coeficiente de extinción o cálculo de la concentración, se realiza a través de una
curva estándar. Su ventaja se caracteriza por ser sensible. Sin embargo, sus
inconvenientes radican en que presenta interferencia de aminas contaminantes en
la muestra, y no todas las muestras reaccionan igual.(6)
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Sánchez Samuel. Método de Bradford: qué es y cómo funciona. Consultado el

28/04/2021 [Internet]. 2021 [cited 2022 Feb 9]; Available from:
https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-bradford
2. Zaia DAM, Thaïs C, Zaia B V, Lichtig J. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS
MÉTODOS EXISTENTES DETERMINATION OF TOTAL PROTEIN BY
SPECTROPHOTOMETRY: ADVANTAGES AND DISADVANTAGES OF
PROPOSED METHODS. Spectrophotometric determination of total. 1998;21(6).
3. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.
1976 May 7;72(1–2):248–54.
4. Método de Bradford: qué es, principio, reactivos, usos [Internet]. [cited 2022 Feb 9].
Available from: https://www.lifeder.com/metodo-de-bradford/
5. Manual de Laboratorio de Bioquímica - mariana.raigoza@udea.edu.co - Correo de
Universidad de Antioquia [Internet]. [cited 2022 Feb 9]. Available from:
https://mail.google.com/mail/u/0/?tab=rm&ogbl#search/laboratorio+bioquímica/
FMfcgzGmthmZtdDQHTzMSllCfRKSrgjx?projector=1&messagePartId=0.1
6. Fernández Reyes Aurora Galván Cejudo E. 27. Métodos para la cuantificación de
proteínas.