HPLC: En cromatografía de líquidos, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases:

una fase estacionaria y una fase móvil. Los componentes se separan debido a la diferencia de
migración entre la fase estacionaria y la fase móvil. La fase móvil introduce los analito en la
columna y a través del sistema.

COMPONENTES

•Disolventes

•Bomba

•Sistema de Introducción de la Muestra

•Columna

•Detector

•Adquisición de Datos

Cromatografía de fase normal: HPLC caracteriza por separar los compuestos en base a su
polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza
cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido
por la fase estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad
del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención La utilización de disolventes más
polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los
disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

Cromatografía de fase inversa: La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias
más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es
una cadena alquil tal como C18H37oC8H17. El tiempo de retención es mayor para las
moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más
rápidamente.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA:

Entendemos por cromatografía en columna: Proceso mediante el que se separan y analizan

una serie de sustancias en función de sus diferentes afinidades de absorción por un
absorbente determinado, lo que se pone de manifiesto por los pigmentos depositados durante
la filtración a través de un mismo absorbente colocado en un cilindro o tubo de cristal. Las
sustancias se disuelven en un líquido que se pasa a través del absorbente, desplazándose a
través de una columna a velocidades diferentes, dejando por detrás una banda de pigmentos
que se lava posteriormente con un solvente puro para 'revelar' las bandas que constituyen un
cromatógrafo.
Cromatografía de filtración en gel: Con la cromatografía de filtración en gel se separan
moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel
cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están
constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar
una red tridimensional.

Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio iónico es un método

que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se
compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase
estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen
contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser
una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico
miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones
de ésta compiten con los analito por los sitios activos de la fase estacionaria.

Cromatografía por afinidad: La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas

proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las
proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un
ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de
que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la
proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el
empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la
interacción entre el ligando y la proteína.

Cromatografía de gases: Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es

un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-
Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o
Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases
esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de
inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada
(horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el
cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio
donde ocurre la separación. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón
contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es
generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra
a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra
o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna
existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias, midiendo
conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo
eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador
permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la
sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la
altura y el área del pico.
Cromatografía liquida de alta performance: Es una Cromatografía de alta presión es decir se
aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras,
la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden
analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el
interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por
tanto la resolución.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que
inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión
para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción
de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la
columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si
se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.

En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realiza mediante una

computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la
naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su
"tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en
la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva
del pico correspondiente.

Cromatografía por capa fina: Técnica utilizada para separar los componentes puros de una
mezcla, de acuerdo con su polaridad Capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una
placa que puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte, sobre la cual corren las sustancias a
separar por medio de un solvente (fase móvil). La fase móvil es líquida y la estacionaria sólida
y polar (sílica gel). El eluyente generalmente es menos polar que la fase estacionaria (sílica gel)
por tanto, entre mas rápido se desplace un componente será menos polar.

Nomenclatura:

Factor de capacidad:
Tiempo de retención: es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a
través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas.

Selectividad: Determina la separación entre picos y representa una relación de la retención

relativa de dos compuestos que eluyen uno a continuación del otro. Un valor de igual a 1
representa tiempos de retención iguales y por lo tanto no existe separación. Un número más
grande representa una columna más selectiva. Cuanto más alejado de “1”, mayor separación.

Números de platos teóricos: La teoría de platos consiste en considerar la columna

cromatográfica compuesta de un número de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay
suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre las dos fases. Cada una de estas
zonas se denomina “plato teórico” (de los que hay N en cada columna de longitud, L). Es
importante recordar que, aunque los platos no existen realmente sino que son producto de la
imaginación, nos ayudan a comprender el proceso. Su significado proviene de la teoría de
platos descrita para explicar el fenómeno de la destilación fraccionada o de la extracción en
contracorriente.

La longitud de una columna contiene una HETP (altura equivalente de plato teórico), H,
expresada en unidades de longitud, normalmente m. El valor numérico de N y H, para cada
columna en particular, es propio de cada analito. H está relacionada con la anchura del pico del
analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X, de tal manera que:
Donde, σ, es la desviación estándar del pico Gaussiano. Para los picos Gaussianos simétricos, la
anchura en la base (ω b) es igual a 4σ y la anchura del pico en el punto de inflexión, ω1/2, es
igual a 2σ. Por tanto, el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la
anchura del pico. El número de platos teóricos en la columna entera viene dado por:

Si consideramos la posición del pico a X=L con el hecho de que la anchura del pico en su base
es ωb, obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico

Si en lugar de medir L y ωb en unidades de longitud, se hace en unidades de tiempo, la

ecuación queda

Si dividimos la longitud de la columna, L, por el valor de HETP, H, se obtiene el número de

platos en la columna

La eficiencia de una columna para separar solutos depende del número de platos teóricos (N).
A mayor valor de N, mejor es la separación. Para una columna de longitud dada, la eficiencia
de la separación (es decir, el número de transferencias del analito entre la fase móvil y la fase
estacionaria) será tanto mejor cuanto menor sea la altura equivalente de plato teórico (HETP o
H).

La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos cromatográficos pero falla
al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos. En las expresiones consideradas hasta
el momento, sólo se ha tenido en cuenta la naturaleza del soluto y de las fases móvil y
estacionaria para alcanzar los sucesivos equilibrios. Sin embargo, la fase móvil se desplaza a
través de la fase estacionaria con una cierta velocidad. Por tanto, el movimiento del soluto no
puede ser completamente descrito en términos de equilibrio pues se estaría suponiendo que
el equilibrio se alcanza de forma infinitamente rápida. Por tanto, es de suponer que la
velocidad de la fase móvil debe tener incidencia en el avance de los solutos, su dispersión y,
por tanto, en la eficiencia de la separación.

Resolución, Rs (adimensional). Es una medida cuantitativa del grado de separación de dos

picos. Un valor de 1,5 representa una separación hasta la línea base de ambos picos y un valor
de 1,0 representa una resolución del 90%. En algunos casos esto es suficiente para los cálculos
del área de los picos (análisis cuantitativo). Valores de Rs < 1 indican solapamiento; valores de
Rs ≥ 1 indican separación. Existen diferentes expresiones para calcular la resolución; las más
utilizadas son las siguientes

Distorsion de la banda:
Elución isocratica y gradiente

Una separación en la que la composición de la fase móvil se mantiene constante durante todo
el procedimiento se denomina isocrática. La palabra fue acuñada por Csaba Horvath, que fue
uno de los pioneros de HPLC.,

La composición de la fase móvil no tiene que permanecer constante. Una separación en la que
se cambia la composición de la fase móvil durante el proceso de separación se describe como
una elución en gradiente. Un ejemplo es un gradiente a partir de 10% de metanol y
terminando en metanol al 90% después de 20 minutos. Los dos componentes de la fase móvil
se denominan típicamente "A" y "B"; A es el "débil" disolvente que permite que el soluto para
eluir sólo lentamente, mientras que B es el "fuerte" disolvente que eluye rápidamente los
solutos de la columna . En la cromatografía de fase inversa, el disolvente A es a menudo agua o
un tampón acuoso, mientras que B es un disolvente orgánico miscible con agua, tal como
acetonitrilo, metanol, THF, o isopropanol.

En elución isocrática, anchura del pico con tiempo de retención aumenta linealmente de
acuerdo con la ecuación para N, el número de platos teóricos. Esto conduce a la desventaja de
que los picos de elución tardía se ponen muy plano y ancho. Su forma y la anchura pueden
evitar que sean reconocidos como picos.

La elución en gradiente disminuye la retención de los componentes después de elución, ya que

eluyen más rápido, dando picos más estrechos para la mayoría de los componentes. Esto
también mejora la forma de los picos para picos de cola, como el aumento de la concentración
del eluyente orgánico empuja la parte de cola de un pico hacia adelante. Esto también
aumenta la altura del pico, lo cual es importante en el análisis de trazas. El programa de
gradiente puede incluir aumentos repentinos "paso" en el porcentaje del componente
orgánico, o diferentes de esquí a tiempos diferentes - todo de acuerdo con el deseo de una
separación óptima en un tiempo mínimo.

En elución isocrática, la selectividad no cambia si cambian las dimensiones de la columna - es

decir, la eluyen los picos en el mismo orden. En elución en gradiente, el orden de elución
puede cambiar a medida que las dimensiones o el cambio de caudal.

La fuerza impulsora en la cromatografía en fase reversa se origina en la alta resolución de la

estructura del agua. El papel del componente orgánico de la fase móvil es reducir este alto
orden y por lo tanto reducir la fuerza de retardo del componente acuoso.

Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografía de líquidos. En cromatografia de

líquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la
columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extracolumna, tiene
lugar cuando se transporta el soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas
de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del
sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las capas
de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte
central de una banda de soluto se mueve con más rapidez que la periferia. En cromatografia
de gases la difusión compensa la dispersión extracolumna. Sin embargo, la difusión en los
líquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda
se hace evidente.