U1 Principios de Analisis Instrumental

Instituto Tecnológico de la Paz Ingeniería Bioquímica
Analisis Instrumental
Ingeniería Bioquímica
M.C. Jesus Ignacio Gonzalez Garcia
Instituto Tecnologico de la Paz
M.C. Jesús Ignacio González García 1

Unidad 1
PRINCIPIOS DEL ANÁLISIS INSTRUMENTAL
1.1 METODOS CLASICOS E INSTRUMENTALES

1.1.1 Relación de la química analítica clásica e instrumental
El análisis químico se hizo necesario desde que el hombre empezó a procesar

materiales y en general a manejar compuestos y elementos químicos. Para hacer esto fue
necesario, en ocasiones, la purificación o separación de los componentes (analitos) con los
que se quería trabajar. Así fueron diseñados o desarrollados una serie de métodos que
ayudaban a este fin como la precipitación, sublimación, destilación, extracción con
solventes, etc.
Muy pronto esto tomo cierto grado de desarrollo y sofisticación ya que en
ocasiones no solo se requería identificar a un analito, si no también saber en que
proporción o concentración existía, y así nació la química analítica, una de las 5 ramas o
campos en los que se divide la química (ademas de la orgánica, inorgánica, fisicoquímica
y bioquímica), aunque en la actualidad son varias las disciplinas que interaccionan entre si
dando lugar a campos como la organometálica, la bioanalítica, etc.
El análisis químico proporciona información sobre la composición de una muestra
de material a través de un método o protocolo que se compone de una serie de pasos
definidos para sacarle información a una muestra. Si el resultado del análisis solo nos
indica de que está compuesto un material, o que tipo de grupo funcional tiene o que
características estructurales, etc., se denomina análisis cualitativo.

Si por el contrario obtenemos datos numéricos como porcentaje de composición,
p p m , mg, etc. entonces se denomina análisis cuantitativo.
Analisis cualitativo: ¿Que es lo que esta presente?
Analisis cuantitativo: ¿Cuanto esta presente?
En ambos tipos de análisis, la información necesaria es obtenida por medio de la

medida de una propiedad física o química que sea característica con el ó los
componentes de interés, y a esta señal se le denomina "SEÑAL ANALITICA".
Hay muy variadas señales analíticas que se pueden utilizar como lo son; la
precipitación ante un reactivo, el vire de color, la absorción, dispersión o emisión de luz,
la conductividad eléctrica, índice de refracción, etc. lo que da origen a que los Métodos
Analíticos se dividan en:
a) Clásicos
b) Instrumentales
En los clásicos, generalmente, primero se separan los analitos de interés de una

muestra por medio de algún método como la extracción, cristalización o destilación y
posteriormente se determina la identidad del mismo por medio de una característica como
un color desarrollado, precipitación y pesado, Pf, Peb, olores, solubilidades, volúmenes de
reactivos usados, etc.
Estos métodos son utilizados en análisis macro, trabajo de campo o cuando no se
cuenta con el equipo necesario. Si el análisis es con fines cuantitativos entonces se hace
uso de la gravimetría o la volumetría para establecer una concentración.
Estos métodos se estudian en los cursos introductorios de la química analítica
denominada química analítica en solución y sé denominan métodos húmedos.
El uso de otras señales Analíticas (ya conocidas desde antes) como la absorción,
dispersión o emisión de una radiación electromagnética (hv), cambios de espín, relaciones
masa/carga, etc. solo fue posible con el desarrollo de la tecnología, y en especial de la
electrónica.
Aunado a esto, el desarrollo de las separaciones cromatográficas como métodos de
separación o métodos analítico hace que estas sean incluidas en métodos modernos que
conforman los denominados métodos instrumentales de análisis, motivo del presente
curso.
1.1.2 Clasificación de los métodos instrumentales

En los métodos instrumentales el analito es excitado o estimulado mediante la
aportación de cierta cantidad de energía proporcionada por una fuente en particular;
posteriormente se mide una señal analítica para establecer la identidad o la concentración
del mismo.
Los métodos instrumentales se pueden clasificar en función de la propiedad física
o química en la que se fundamentan y el nombre del método en ocasiones se compone del
fenómeno físico combinado, por ejemplo, con la región del espectro en la que trabaja; en
otros casos, el nombre no lleva implícito ninguna de estas características.
Cada propiedad física puede generar uno o mas métodos en su aplicación:
FENOMENO TIPO DE METODOS

Transición de electrones internos Emisión gamma
Transiciones de electrones internos Absorción, emisión, fluorescencia y
difracción de rayos X
Transiciones de electrones de enlace Absorción de radiación ultravioleta
(principalmente enlaces σ ) en el vacío
transiciones de electrones de enlace y no enlace Absorción, emisión y fluorescencia
de radiación UV-Vis
Rotación y vibración molecular Absorción y dispersión Raman e
infrarrojo
Rotación de moléculas Absorción de microondas
Cambios de estados de energía de espín Resonancia de espín electrónico
electrónico en un campo magnético
Cambios de energía de espín de núcleos en un Resonancia magnética nuclear

campo magnético
La clasificación también puede hacerse , mas específicamente, por medio de la

señal analítica generada:
Señal analítica Método Instrumental
Emisión de radiación Espectroscopia de emisión (rayos x, UV,

visible, de electrones, Auger); fluorescencia,
fosforescencia y luminiscencia (rayos x, UV,
visible)
Absorción de radiación Espectroscopia (rayos x, UV, visible, IR);

espectroscopia fotoacustica; RMN y
resonancia de espín electrónico.
Dispersión de la radiación Turbidimetria, nefelometria y espectroscopia

Raman
Refracción de la radiación Refractometria; interferometria
Difracción de la radiación Difracción de rayos x y de electrones
Rotación de la radiación Polarimetria; dispersión rotatoria óptica;

dicroismo circular

Señal analítica Método Instrumental
Potencial eléctrico Potenciometria; cronopotenciometria
Carga eléctrica Coulombimetria
Corriente eléctrica Polarografia; amperometria
Resistencia eléctrica Conductimetria
Razón masa/carga Espectroscopia de masas
Velocidad de reacción Métodos cinéticos
Propiedades térmicas Conductividad térmica y métodos de entalpia
Radiactividad Métodos de activación y de dilución isotópica
1.1.3 Componentes de los instrumentos de medición
En los métodos instrumentales de análisis la información que se obtiene de los

átomos, iones, moléculas o compuestos, procede de las señales analíticas relacionadas con
las propiedades físicas o químicas de los mismos, sin embargo estas señales no son
interpretables por nuestros sentidos por lo que requerimos del uso de instrumentos o
equipos especiales que las transformen en una forma comprensible o medible por el
analista; de hecho, un instrumento analítico es una interfase que hace la comunicación
entre analitos y analistas.
Los componentes de un equipo analítico dependen del tipo de fenómeno que se
esta midiendo o de la señal analítica en observación, es decir, si es una radiación
electromagnética, una corriente eléctrica, un voltaje, pH, una flama, etc. pero en la
mayoría de los casos se requiere un generador de señales o una fuente de energía para
generar las señales (en otros casos el mismo analito genera la señal), un dispositivo que la
convierta o interprete (trasductor de entrada), un procesador de la señal (generalmente un
amplificador) y un trasductor de salida (convierte la señal procesada en una señal
entendible por el analista).
1.1.4 Dominio de los datos
Los dispositivos o equipos analíticos transforman las señales de una forma a otra
que sea manejable por el analista y así se obtenga la información que debe ser
proporcional a la propiedad física o química que se esta midiendo. La información
obtenida por las propiedades medidas debe ser codificada para su interpretación. A esta
codificación se le denomina dominio de los datos.
Los dominios de los datos se clasifican en: dominios no eléctricos y dominios
eléctricos.
Dominios no eléctricos: cuando se miden propiedades físicas o químicas como la
longitud, densidad, composición química, intensidad de luz o color, volumen, presión, etc.
Este dominio de datos esta asociado, generalmente a métodos clásicos aunque la mayor
parte de estas mediciones, en la actualidad se encuentran asociadas a dispositivos
electrónicos que hace que estos dominios de datos estén asociados a dominios eléctricos.
La obtención o manejo de datos de dominio puramente no eléctrico se encuentra en franca
extinción debido al avance de los dispositivos modernos.
Dominios eléctricos: la señal se pasa de una forma a otra codificandola como una señal
eléctrica. Existen tres modalidades, o tipos de dominios eléctricos, de codificar la
información como una cantidad eléctrica: Dominios analógicos, Dominios de tiempo y
Dominios digitales. En un análisis se pueden combinar dominios eléctricos con dominios
no eléctricos como en los digitales que tienen que arrojar un numero.
Dominios analógicos: la información se codifica como la magnitud de una carga eléctrica

(carga, potencia e intensidad de corriente). Son continuas en amplitud y tiempo y se
pueden medir continuamente o en determinados tiempos. Por ejemplo, un detector de
fotones que genera una corriente eléctrica.
Dominios del tiempo: la información se guarda como variaciones de la señal con respecto
al tiempo, es decir como se comportan los máximos y mínimos en diferentes tiempos. En
estos dominios se utiliza la frecuencia y los periodos. Los dominios eléctricos del tiempo
son frecuencia, amplitud y fase. Ejemplo el FID o señal de decaimiento utilizada en
espectroscopia de transformada de Fourier.
Dominios digitales: las señales se codifican en dos niveles y actúan sobre dispositivos que
solo tienen dos posiciones posibles, por ejemplo una lampara solo puede estar encendida o
apagada, una palanca arriba o abajo, un diodo emitiendo o no emitiendo luz, una señal de
nivel lógico solo puede ser HI o LO. La interpretación de que es abierto o cerrado o que es
HI o LO es una decisión arbitraria dependiente de un nivel de medición dependiente del
equipo utilizado o del experimento. Por ejemplo cuando se rebasan mediciones en un
nivel o una cantidad de veces con un contador que hace que aparezca un numero en una
pantalla o una alerta. Los dominios digitales son computo, en serie, en paralelo y numero.
Aquí la codificación es generalmente en números binarios (base 2) ya que es más eficiente
que hacerlo en serie. Esta codificación puede accionar, por ejemplo diferentes diodos.
PARAMETROS DE CALIDAD DE UN METODO ANALITICO
1.2.1 Parámetros cualitativos
Existe una gran diversidad de métodos analíticos instrumentales que hacen difícil
en ocasiones la decisión del uso de un método instrumental u otro para resolver un
problema analítico. Los equipos tienen criterios cuantitativos que permiten reducir el
numero de instrumentos a utilizar en función del problema a resolver; estas características
se dan en términos numéricos y se denominan parámetros de calidad. Una vez que los
criterios cuantitativos reducen la elección se puede recurrir a los criterios cualitativos para
tomar la decisión.
Parámetros
cualitativos
1. Velocidad
2. Facilidad y
comodidad
3. Habilidad del
operador
4. Costo y
disponibilidad
5. Costo unitario
1.2.2 Parámetros cuantitativos
Son criterios numéricos que se deben considerar en función de las necesidades del
análisis y de la información que se desea extraer.
Criterio Parámetro de calidad
1. Precisión Desviación estándar absoluta, desviación estándar

relativa, coeficiente de variación, varianza
2. Exactitud Error absoluto, error relativo
3. Sensibilidad Sensibilidad de calibración, sensibilidad analítica
4. Limite de detección Blanco mas tres veces la desviación estándar del

blanco
5. Intervalo de concentración Concentración entre el limite de cuantificación

(LOQ) y el limite de linealidad (LOL)
6. Selectividad Coeficiente de selectividad

1.3 RELACION SEÑAL-RUIDO
Cuando se realiza una medición analítica se obtienen generalmente dos

componentes, una que lleva la información del analito que estamos buscando y otra que
contiene información indeseable, denominada ruido, que nos afecta la medición de muy
diversas formas.
1.3.1 Fuentes de ruido
Hay básicamente dos tipos de ruidos que afectan una medición analítica: el ruido
químico y el ruido instrumental.
Ruido químico: hay muchas variables o factores que pueden afectar el ambiente químico
de una muestra.
Por el principio de Le Chatelier, la posición de un equilibrio químico se puede ver
afectada, por ejemplo, al variar la temperatura o la presión, por la fluctuación en la
humedad relativa, así como por vibraciones que pueden afectar la estructura de sólidos, la
variación en la intensidad de luz que afecta a sustancias sensibles a la misma, de la misma
forma que la presencia de humos que interactuan con muestras o reactivos. Estos son
algunos entre muchos otros factores que son considerados como fuentes de ruido químico.
Ruido Instrumental: este es el tipo de ruido generado en una medición por la afectación de
los diferentes componentes del equipo instrumental utilizado para realizar la misma.
Todos los componentes de un equipo (fuentes de energía, transductores, procesadores de
señales, etc.) pueden ser susceptibles de ser afectados por ruidos de diversas fuentes,
dependiendo del componente en cuestión.
Al final el ruido detectado o medido que aparece en el equipo va a ser la resultante
de la mezcla de todos estos ruidos, lo que va a dificultar la caracterización del tipo de
ruido y por lo tanto el control sobre el mismo. Sin embargo, existen algunos ruidos
instrumentales que son reconocibles y que es recomendable identificar sus características
para tratar de minimizarlos.
Los ruidos identificables son: el ruido térmico (o ruido de Johnson), el ruido de
disparo, el ruido de parpadeo (o ruido 1/f) y el ruido ambiental.
1. Ruido térmico: es debido a la agitación térmica (debida a la fricción) de los electrones u

otros transportadores de carga en los diversos dispositivos como resistencias,
condensadores, detectores de radiación o celdas electroquímica, entre otros. Este tipo de
ruido genera variaciones de voltaje por la heterogeneidad de la carga y solo es posible
que desaparezca en el cero absoluto, con ausencia de vibraciones.
2. Ruido de disparo: este se presenta cuando hay una corriente que genera movimiento de
electrones o partículas cargadas a través de una unión. Ejemplos de esto se presentan en
los circuitos electrónicos con interfaces p y n (con dopaje con indio y arsénico), en
interfaces entre electrodos (de vidrio), etc.

3. Ruido de parpadeo: las causas de este ruido no son del todo conocidas pero se
reconocen por su dependencia de la frecuencia y su valor es inversamente proporcional
a esta, razón por la que se le denomina también como 1/f. Este ruido es muy
significativo para frecuencias menores a 100 Hz. Este ruido se observa en
amplificadores de corriente y en galvanómetros.
4. Ruido ambiental: este tipo de ruido proviene del entorno. Entre mas radiaciones
electromagnéticas haya en los alrededores, producidas por lineas de alimentación de
corriente alterna, emisores de ondas de radio o televisión, sistemas de encendido de
motores de gasolina, conmutadores de arco eléctrico, alumbrado, perturbaciones
ionosféricas, entre muchos otros, este ruido se convierte en significativo ya que en los
instrumentos analíticos cada conductor funciona como una antena capaz de detectar
estas radiaciones y convertirla en una corriente eléctrica.
1.3.2 Aumento de la relación señal-ruido
Regularmente la señal analítica es muy superior al ruido lo que hace relativamente

fácil mantener a este ultimo bajo control tomando algunas medidas en función del
conocimiento de los tipos de ruidos principales y reconocibles.
A pesar de esto, finalmente, la relación señal-ruido afecta la precisión de una
medida, por lo que es conveniente aumentar esta relación. Existen dos formas de hacerlo,
a través de hardware y/o a través de software.
En el diseño de los equipos (hardware) actualmente se están incorporando
componentes como filtros, cortadores, escudos, moduladores y detectores sincrónicos que
eliminan o atenúan al ruido y que no afectan a la señal analítica.
Por otro lado, existe software con algoritmos digitales que extraen ruidos después
de convertir la señal de salida de analógica a digital, utilizando para tal efecto el uso de
una computadora.
1.4 CALIBRACION DE LOS METODOS INSTRUMENTALES
Un método analítico cuantitativo implica o requiere que exista una relación entre la
medida de una señal analítica, Smedida, y la cantidad absoluta del analito o la cantidad
relativa del analito en una muestra:
Smedida = KnA + Sreac Ecuación 1
Smedida = KCA + Sreac Ecuación 2
Donde:
nA = moles de analito
CA = concentración del analito
K = sensibilidad del método
Smedida = señal medida
Sreac = aportación o contribución de los reactivos a la señal medida

La ecuación 1 nos da la relación entre la señal analítica y la cantidad absoluta del analito,
con la aportación de los reactivos y el solvente a la medición de la señal, en tanto que la
ecuación 2 nos da la relación de la señal con una cantidad relativa del analito en una
muestra con, también, la aportación de los reactivos y el solvente al valor medido de la
señal.
La señal medida puede ser un peso, un volumen de reactivo, una emisión, una absorción o
alguna otra señal que nos proporcione información sobre la concentración del analito. Se
debe evitar incurrir en errores determinados que quitan certeza y precisión a las
mediciones.
Para obtener un valor preciso de nA o CA es necesario evitar errores determinados que
afectan la señal del analito, de k y de Sreac, esto se logra con una combinación de
calibraciones, estandarizaciones y la utilización de blancos, es decir, para tener las
certeza de que los resultados obtenidos con un método instrumental son correctos, todo
método debe ser calibrado y estandarizado, relacionando la respuesta del mismo (la señal
analítica) con la concentración del analito.
Las señales analíticas pueden ser obtenidas con equipos o instrumentos, los cuales deben
ser debidamente calibrados para evitar los errores determinados. La calibración es
realizada contra estándares, ajustando la señal medida (Smedida) hasta que esta concuerde
con las señales conocidas de el o los estándares. Un ejemplo de estándares son los marcos
de pesas de masas conocidas que permiten establecer si las balanzas están aportando los
valores correctos. En el caso de los espectrofotómetros también se utilizan estándares
certificados o soluciones preparadas utilizando estándares primarios o estándares
secundarios los cuales fueron previamente estandarizados utilizando un estándar primario
que den señales ya establecidas de absorción o emisión, por ejemplo, una solución de
una 𝛌 de 350 nm utilizando H2SO4 0.0050 M como blanco de reactivos.

60.06 ppm de K2Cr2O7 en H2SO4 0.0050 M debe dar una absorbancia de 0.640 ± 0.010 a
También se debe calibrar el material de vidrio clase A utilizado para la medición de

volúmenes precisos como pipetas y matraces para verificar si los volúmenes medidos dan
los valores declarados.
Todos los estándares utilizados, ya sea comerciales, preparados o procedimentales, deben

estar acordes a lo establecido por un organismo oficial o autorizado para este fin, y
aceptado en cada país como el “National Institute for standard and Technology” o el “The
American Society for Testing and Materials” en Estados Unidos de Norteamérica.
En México existen 10 organismos registrados ante la Secretaria de Economía, los cuales
se encargan de aplicar la normativa en diferentes ámbitos. Como ejemplo se cuenta con la
“Sociedad Mexicana de Normalización (Normex)”, “Instituto Mexicano de
Normalización y Certificación (IMNC)”, la “Asociación de Normalización y
Certificación (ANCE)”, y algunos otros organismos específicos para diferentes rubros
como el acero, la leche, etc.
La American Chemical Society (ACS) define a la estandarización como el proceso para

determinar la relación entre la señal analítica medida (Smedida) y la cantidad de analito. En
la estandarización se determina el valor de K de manera experimental ya que no se han
desarrollado modelos teóricos de los procesos físicos y de comportamiento químico ideal
que nos permitan calcular este valor de manera teórica.
Para determinar K experimentalmente, se analizan una o más soluciones estándar con
concentraciones conocidas del analito a determinar. Las aportaciones a la señal por parte
de los reactivos (Sreac) se determina por medio de blancos para eliminarlas de las
ecuaciones para calcular K, aunque en ambos casos no se esta considerando las
interacciones con la matriz.
Blancos
Los blancos se utilizan para corregir la señal medida del analito de las aportaciones a la
señal originadas por otras fuentes ajenas al analito. Hay diferentes tipos de blancos que
minimizan estas aportaciones a la señal del analito pero los dos más utilizados son los
blancos de calibración y los blancos de reactivos, sin embargo ninguna de los dos tipos
de blancos eliminan de manera determinante, en su totalidad, todos los factores que
influyen en la medición de la señal y afectando la infalibilidad de la sensibilidad del
método, determinada en las ecuaciones y experimentalmente como K.
El blanco de calibración es obtenido a través de una curva de calibración y se identifica
como el intercepto al eje Y de esta. El blanco de reactivos, por su parte, se obtiene
midiendo la señal de una solución que contenga el mismo solvente y los mismos reactivos
pero que no contiene al analito. Generalmente se utiliza una combinación de ambos
blancos pero ninguno de los dos tipos elimina por completo las interacciones con solvente
y reactivos pero no se incluyen las interacciones a las que el analito esta sujeto en la
matriz, en el blanco de reactivos el analito no esta presente y en el blanco de calibración
no se encuentra la matriz de la muestra.
Un tipo de blanco que se utiliza cuando se requiere mayor exactitud es el denominados
Blanco total de Youden, el cual surge de la observación experimental del valor de K
cuando se trabaja la muestra a varias concentraciones. Se encontró experimentalmente que
la sensibilidad de los métodos de cuantificación, K, varia con la concentración utilizada de
muestra. Para la obtención de este blanco se mide la señal producida por la muestra
preparada a diferentes concentraciones y graficando estas, en el eje X, contra el valor de la
señal en el eje Y. El intercepto en Y se toma como un blanco de calibración y este valor se
descuenta del valor de la señal medida en los problemas, como en el caso de los dos otros
tipos de blancos.
Existen diferentes maneras o métodos de realizar la estandarización de los métodos

instrumentales, dependiendo, principalmente, de la composición de la matriz en la que se
encuentra el analito. Los principales métodos, que no los únicos, para la calibración son:
- Método de Comparación de estándares
- Método del Estándar externo
- Método de la Adición de estándar
- Método del Patron interno
En todos los casos la estandarización se puede hacer hacer por un camino muy simple
utilizando un solo punto (una solución única del estándar de concentración conocida),

método no recomendado para análisis de precisión debido a que no permite establecer
variaciones en la sensibilidad del método debidas a la concentración.
La más deseable es la estandarización de puntos múltiples en la que se utilizan al menos
tres soluciones del estándar a diferente concentración y la cual permite establecer posibles
variaciones en la sensibilidad con la construcción de una curva de calibración.
Curvas de Calibración
las curvas de calibración se utilizan cuando se hacen calibraciones a puntos múltiples
obteniendo una relación entre la señal añadida y la concentración del analito medida en
una serie de estándares a diferente concentración. Se considera que la sensibilidad del
método es la misma para todas las concentraciones de un analito dentro de un rango util.
Esta relación lineal es representada mediante la siguiente ecuación:
Y = mX + b
donde m es la pendiente y b es el intercepto en Y en un gráfico donde el eje Y contiene los
valores de la señal y el eje X los valores de concentración.
Los posibles errores residuales provocan pequeñas desviaciones las cuales pueden ser
corregidas por medio de un medio de un análisis de regresión también denominados
tratamiento de los mínimos cuadrados el cual sirve para corregir las variaciones de K, la
pendiente, ocasionadas por las variaciones en la concentración y sus interacciones con la
matriz o por errores indeterminados.
Para realizar una curva de calibración es necesario preparar una serie de soluciones
estándar del analito, de diferentes concentraciones. Las soluciones se pueden obtener de
dos formas, si el rango de concentraciones se limita a uno o dos ordenes de magnitud estas
se preparan transfiriendo un volumen o una masa del estándar a un matraz volumétrico
para posteriormente llevarlo al volumen del mismo. Si se va a trabajar con rangos de
concentraciones mayores, órdenes de magnitud de tres o más, los estándares se preparan
por diluciones seriadas partiendo de una solución stock simple, de la que se toma una
alícuota se transfiere a un matraz volumétrico y se afora, de esta nueva solución se toma
una alícuota se transfiere a otro matraz y se afora y así sucesivamente teniendo mucho
cuidado o un cuidado extremo ya que introduciendo un error este se trasmitirá a todas las
diluciones posteriores y se irá acumulando.
1.4.1 Comparación de estándares
En la variante de este método denominada de Comparación directa se realiza la

comparación de una propiedad del analito con estándares o patrones. La propiedad
probada debe ser muy similar entre ambos. Como ejemplo de estos podemos considerar el
color producido por una reacción aplicada tanto al analito como al estándar.
En otra variante, el analito se hace reaccionar con un reactivo estandarizado en una
reacción estequiométrica.
1.4.2 Estándar externo

En este método, el estándar se prepara por separado de la muestra. Es una técnica utilizada
cuando la matriz no interfiere en la medición y existen dos variantes: haciendo una sola
medición del estándar a cierta concentración (estandarización de un solo punto), para
encontrar la constante de proporcionalidad que se aplicara posteriormente al analito
problema o utilizando soluciones de estándar con las que se realiza una curva denominada
curva patrón o curva estándar o curva de calibración. Se utiliza un blanco que emula la
matriz, para corregir la señal medida.
En el primer caso (estandarización a un solo punto) se prepara una solución de
concentración conocida del estándar, Cst, y se mide su señal analítica, Sst. Con estos datos
se calcula el valor de k (la sensibilidad del método).
Sst α Cst Sst = KCst
Sst
K= Ecuación 3
Cst
Donde C corresponde a la concentración y S a la señal analítica. Se considera que el valor

de K es constante y no varía con la concentración por lo que se aplica en la medición de
cualquier muestra del analito, de cualquier concentración, sin embargo, esto no es del todo
cierto porque en algunos casos y en ciertas condiciones, el valor de K puede variar dando
resultados erróneos.
Ya conocido el valor de K se puede sustituir en la formula el valor de la señal analítica del
estándar (Sst) por la señal del analito (SA) y despejando encontramos la
concentración ,Ca, del analito.
Este es un método no muy recomendable ya que en la lectura inciden todo tipo de errores,
tanto determinados como indeterminados, y así se determina K. Cualquier incertidumbre
en el valor de K incide directamente en la medición de la concentración del analito.
Ejemplo: un método espectroscopico para la determinación cuantitativa de los niveles de

Pb+2 en sangre da una medición de 0.474 para el estándar, Sstand, de plomo de una
concentración de 1.75 ppb. ¿ Cuantas partes por billón de Pb+2 hay en una muestra de
sangre si su lectura, Ssamp, es de 0.361?
En la estandarización de estándar externo de puntos múltiples se construye una curva de

calibración utilizando diversas soluciones del estándar a diferente concentración, dentro
de un rango esperado para la concentración de la ó las soluciones problema. Si el gráfico
resultante de graficar Sst contra CST, curva de calibración, es lineal (las mas
recomendables), la pendiente nos dará el valor de K. El gráfico se puede ajustar mediante
un algoritmo de ajuste de recta que se conoce como regresión lineal o ajuste por el método
de los mínimos cuadrados. En esta relación lineal la sensibilidad del método se mantiene
constante a través del rango de concentraciones.
Si la curva patrón es no lineal el problema es mas complejo y requiere un mayor numere
de mediciones o soluciones estándar, y el valor de K (sensibilidad del método), es función
de la concentración del analito, su valor será mayor cuando la concentración del analito es
pequeña y decrece continuamente conforme la cantidad del analito aumenta; el valor de K
en cualquier punto es la pendiente de la curva en ese punto. La curva se realiza en el
intervalo de concentraciones útiles, en las que se va a encontrar la concentración del
analito (para minimizar variaciones de la pendiente).
El problema en este tipo de estandarización es de que las mediciones del estándar y el
analito podrían variar en gran medida si la matriz en la que se encuentran ambos (estándar
y analito) presenta diferencias. En este tipo de métodos de calibración se introduce un
error determinado proporcional cuando existe una diferencia significativa entre las dos
matrices, la de los estándares y la matriz en la que se encuentra el analito. Cuando se
conoce la composición de la matriz del analito se puede ensayar un método denominado
“Igualación de matriz” pero solo aplica a matrices sencillas y no es muy práctico,
también se podría intentar eliminara a algún componente de la matriz o al interferente
aumentar su concentración en exceso o en su defecto diluir la muestra hasta que el o los
interferentes se vuelven imperceptibles. Si se desconoce la composición de la matriz es
mejor utilizar otro método de estandarización que elimine las interferencias de la matriz
como son los métodos de adición de estándar o el método de estándar interno.
Ejemplo: un método espectroscopico para la determinación cuantitativa de los niveles en

sangre de Pb+2 da una curva lineal normal de calibración para la cual
Sstand = (0.296 ppb-1 ) x Cs + 0.003
¿Cual es el nivel de plomo (en ppb) en una muestra de sangre si Ssamp es de 0.397?
En el método del estándar interno o Método del Patron interno se utiliza una sustancia
de referencia que tenga características físico-químicas similares al analito, la cual es
adicionada a las soluciones estándar, blanco y muestra. Es un método de calibración
utilizado cuando el procedimiento no permite la reproducibilidad del manejo de muestras
y estándares. En este caso se mide la relación que existe entre la respuesta del analito y la
respuesta del estándar (el cual se encuentra en las mismas condiciones de detección en
relación a reactivos, equipo, presión, pH, etc.). el método se puede realizar a un solo punto
o a puntos múltiples en cuyo caso se debe realizar una curva con la concentraciones en el
eje x y la relación de respuestas en el eje y.
Cuando se trabaja a un solo punto se obtienen las relaciones de las señales del estándar y
del analito con las concentraciones correspondientes:
!C $! S $
K = # IS & # A &
" C A % " SIS % Std CIS SA
se despeja CA CA = ( )( )muestra
K SIS
Donde:
Cis y Sis son la concentración y la señal del estándar interno respectivamente
CA y SA son la concentración y la señal del analito respectivamente
Ejemplo: un método para la cuantificación de Pb+2 en sangre utiliza Cu+2 como estándar
interno. Un estándar que contiene 1.75 ppb de Pb+2 y 2.25 ppb de Cu+2 produce una

razón SA/Sst de 2.37. Una muestra problema de sangre es spiked (fortificada) con la
misma concentración de Cu+2 dando una señal con una razón SA/Sst de 1.80. Determine la
concentración de Pb+2 en la muestra.
!C $! S $ 2.25
K = # St & # A & = x 2.37 = 3.05
" C A % " SSt % St 1.75
Por lo tanto, la concentración de Pb+2 es:
!C $! S $ 2.25
C A = # St & # A & = x 1.80 = 1.33 ppb Pb +2
" K % " SSt % muestra 3.05
En la variante del estándar interno a puntos múltiples se obtiene una curva de
calibración que relacione la relación de la señal del analito contra la señal del estándar
interno, (SA/Sis)st en el eje y contra la concentración del analito, CA, en el eje x. La
pendiente corresponderá a K/Cis.
Ejemplo: Un método espectroscópico para la determinación cuantitativa de niveles de

Pb2+en sangre da una curva de calibración de estándar interno:
SA
( ) = (2.11ppb −1) CA − 0.006
Sis st
Cual es la concentración en ppm de Pb2+en una muestra de sangre si (SA/Sis)muestra resulto

ser de 2.80:
(SA /S(is))muestra + 0.006 2.80 + 0.006

CA = CA =
2.11ppb −1 2.11ppb −1
CA = 1.33 ppb
Cuando se trabaja con matrices muy complejas, difíciles de duplicar, se utiliza el método
de las adiciones de estándar (spike o fortificación) en el cual lo que se agrega es el
mismo analito en forma de una solución estándar y la estandarización se hace sobre o
dentro de la misma muestra. Se utilizan dos porciones de la muestra, una se mide
normalmente y la otra es adicionada con la solución estándar del analito (método de
solución estándar en un solo punto) y se calcula la concentración de la muestra
suponiendo la relación lineal entre la respuesta y la concentración y considerando que la
fortificación con el estándar no afecta a la matriz y el valor de K es el mismo bajo estas
condiciones tanto en la muestra sola como en la muestra fortificada. En una variante se
llevan las dos soluciones al mismo volumen final y en otra variante se agrega el estándar o
fortificante y no se diluye.

Método de adición de estándar con dilución y de un solo punto
V0
SA = KCA Ecuación 4
Vf
V0 Vspike
Sspike = K(CA + Cst ) Ecuación 5
Vf Vf
Despejando K de las ecuaciones 4 y 5 e igualando los dos valores de K ya que suponemos
no hay variación en su valor, nos queda:
SA Sspike
=
!V $ !V $ !V $
C A # 0 & C A # 0 & + Cspike # spike &
" Vf % " Vf % " Vf %
Donde Vspike es el volumen de fortificación, Sspike es el valor de la señal luego de la

fortificación y Vf es el volumen final al que se lleva la muestra. De esta ecuación podemos
obtener el valor de CA.
Ejemplo: Un método para la determinación cuantitativa de Pb+2 en sangre da una
segunda muestra de 1.00 ml fue spiked (fortificada) con 1.0 𝝁l de un estándar de una
lectura, SA , de 0.193 para 1.00 ml de muestra de sangre el cual fue diluido a 5.00 ml. Una
solución de Pb+2 con una concentración de 1560 ppb de Pb+2 y la cual también es diluida
a 5.00 ml dando una lectura, Sspike , de 0.419. Determine la concentración de Pb+2 en la
muestra original de sangre.
0.193 0.419
=
! 1.00ml $ ! 1.00ml $ ! 1.0 x10 −3 ml $
CA # & CA # + 1560 ppb
" 5.00ml % " 5.00ml &% #" 5.0ml &%
0.193 0.419
=
0.2C A 0.2C A + 0.312 ppb 0.0386 C A + 0.0602 ppb = 0.0838 C A
0.0452 C A = 0.0602 ppb por lo tanto CA = 1.33 ppb
Método de adición de estándar sin dilución y de un solo punto
En esta variante no hay dilución por lo que las señales son producto de la muestra y de la
muestra fortificada. El volumen final es el producto del volumen de la muestra (V0) más
el volumen de la fortificación (Vspike) pero no se agrega más solvente para un volumen
estandarizado.
SA = KCA
V0 Vspike
Sspike = K(CA + Cst )
V0 + Vspike V0 + Vspike
Si despejamos el valor de K en ambas ecuaciones e igualamos ya que se supone es el

mismo, nos queda:
SA Sspike
=
CA ! V0 $ ! Vspike $
CA # & + Cspike # &
(
#" V0 + Vspike ) &% (
#" V0 + Vspike ) &%
Una variante es el método de adiciones múltiples en el que a varias alícuotas del analito
se les agrega diferentes cantidades de solución estándar, para con estas obtener una curva
de calibración de adiciones múltiples donde la calibración se hace dentro de la mismas
muestra. Con las señales de las diferentes soluciones medidas se obtiene un gráfico de
Sspike contra la cantidad de estándar agregado, Vspike.
CAV0 Cst KCAV0 KCst

Sspike = K( + ) Vspike Sspike = + V
Vf Vf Vf Vf spike
Que es una ecuación de la recta: y = yintercepto + pendienteX, es decir y= b + mx
De esta ecuación se obtiene el intercepto en X en donde Y = 0.
Vspike es el valor donde la recta intercepta el eje X, es decir Xintercepto
V
KCAV0 KCst (KCA V0 )
f
0= + Xintercepto Xintercepto = − Cst
Vf Vf K Vf
CAV0
Xintercepto = −
Cst
Vspike
Si se grafica Sspike contra Cst ( ) la pendiente será K.
Vf
De Xintercepto se puede calcular CA, la concentración del analito porque se conoce V0 y Cst
Ejemplo:Un método para la cuantificación de Pb+2 en sangre, utilizó el método de las

adiciones multiples. La muestra de sangre original tiene un volumen de 1.0 ml y el
estandar utilizado para la fortificación (spiked) de la muestra tiene una concentración de
1560 ppb de Pb+2. Todas las muestras son diluidas a 5.00 ml antes de hacer la medición.
Una curva de calibración de la señal fortificada (Sspiked) contra volumen de fortificante
(Vspiked) es descrita por: Sspiked = 0.266 + 312 ml-1 x Vspike. Determine [Pb+2].
0 = 0.266 + 312 ml-1 x (intercepto en X)

Intercepto en X = -8.526 x 10-4 ml
Ca =1.33 ppb
Este ultimo método, aunque implica más trabajo y tiempo esto es compensado por la
eliminación de efectos de interferencia complejos y en ocasiones desconocidos por el
analista. La estandarización es única para cada muestra, es decir, la curva no se puede
utilizar para otra porque la calibración es dentro de la muestra. En estándar externo si vas
a realizar 5 análisis de una muestra utilizando una curva de 4 puntos se tienen que hacer 9
mediciones, las de la curva y las de la muestra, pero si la calibración la haces por adición
de estándares se tendrían que hacer 4 mediciones por cada muestra, es decir, 20
mediciones.
1.5 PROPIEDADES DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS
Una parte muy importante de los métodos instrumentales son los denominados
métodos espectroscópicos o espectrofotométricos, originalmente basados en la interacción
entre la materia y una radiación electromagnética, pero en la actualidad el termino agrupa
también a métodos en los que se hace interactuar a la materia con otras formas de energía
como haces de electrones, ondas acústicas o haces de iones.
1.5.1 Dualidad onda-partícula
Las radiaciones electromagnéticas, o luz, son ciertas formas o manifestaciones de

la energía que se trasmiten a la distancia y a velocidades muy altas pero finitas y que, a
diferencia del sonido, no requieren de un medio para trasmitirse por lo que lo pueden
hacer en el vacío. Todas las radiaciones electromagnéticas tienen la misma velocidad en el
vacío y su velocidad varia en otros medios debido a las interacciones con el mismo.
Estas radiaciones electromagnéticas, en función de su comportamiento o
propiedades, pueden ser descritas tanto como ondas como partículas, es decir presentan un
comportamiento dual. El comportamiento óptico de las radiaciones electromagnéticas,
como la difracción, es mejor descrito por su comportamiento ondulatorio, en tanto que
cuando interacciona con la materia y se observan los fenómenos de absorción o emisión
es el comportamiento corpuscular, como partícula, fotón, el que mejor la describe.
Son varias las formas como las radiaciones electromagnéticas se manifiestan,
siendo la luz visible la mas común, pero también tenemos otras como lo es los rayos X,
radiación infrarroja, radiación ultravioleta, rayos gamma, ondas de radio, etc. El termino

luz, aunque originalmente fue utilizado para referirse a la radiación visible para el ojo
humano, también se usa en las radiaciones del tipo ultravioleta e infrarrojo.
1.5.2 El espectro electromagnético
Todas estas formas de radiación o luz, en virtud de ser distintas manifestaciones

del mismo fenómeno, se les agrupa en lo que se denomina "El espectro
electromagnético", del cual la luz visible es solo una pequeña porción.
Casi cada porción del espectro electromagnético puede ser utilizada para algún
método espectroscópico, el nombre de los mismos dependerá del tipo de radiación y el
fenómeno que utilicemos.
1.5.3 Propiedades generales de las radiaciones electromagnéticas
Para entender, entonces, que es lo que diferencía a estas radiaciones, requerimos

analizar sus propiedades estudiándolas tanto desde el punto de vista clásico, como ondas,
como desde el punto de vista cuántico, como partículas. Estas dos formas de analizar al
mismo fenómeno no son excluyentes ya que en algunos casos es necesario utilizar un
modelo y en otros, donde este modelo no funciona, como es el caso de la absorción de
energía, hay que recurrir al otro, aunque sabemos que en realidad la luz tiene propiedades
y un comportamiento mecano-cuántico característico.
Desde el punto de vista ondulatorio, una radiación electromagnética es una onda
con comportamiento sinusoidal que presenta ciertas características y parámetros. La onda
viajera transporta a la energía y consta de dos campos oscilantes en fase: uno eléctrico y
otro magnético el cual viaja perpendicularmente al primero (ángulo recto) en la dirección
de la propagación.
Esta es una representación gráfica de una radiación monocromática polarizada en un

plano. La componente eléctrica es, la mayor parte de las veces, la responsable de los
fenómenos de interacción con la materia que se utilizan en los métodos ópticos, y solo en
contados métodos (resonancia magnética nuclear, resonancia de espín electrónico) se
utiliza la componente magnética.
Los parámetros a considerar en una radiación electromagnética vista como una
onda son:
λ = Longitud de onda. Distancia entre dos crestas ó tamaño de una onda completa (un
ciclo).
A = Amplitud. Altura de las crestas desde cero.
P = Periodo. Tiempo necesario para que dos máximos ó mínimos (una onda completa)
pasen por un punto fijo.
ν = Frecuencia. Numero de ciclos u oscilaciones del campo que pasan por un punto dado
por segundo.
Cabe señalar que la velocidad de todas estas radiaciones en el vacío es de 2.99792

x 108 m/s (3x108 m s-1 cuando se redondea) y se representa por la letra C:

Cuando la radiación viaja a través de otro medio su velocidad disminuye y si la
frecuencia (ν) permanece constante (por lo tanto también su energía), lo que se modifica
es la longitud de onda y, en ese caso se expresa como:
Las unidades de la longitud de onda varían según la región espectral con la
finalidad de trabajar principalmente con números enteros: Ángstrom (Aº = 10-10 m) en
rayos X y ultravioleta corto, Nanómetro (nm = 10-9 m) para ultravioleta y visible,
Micrómetro (µm = 10-6 m) para infrarrojo, etc.
Las unidades de frecuencia son cps (ciclos por segundo) ó mas correctamente Hz
(Hertz) y s-1.
−
Algunos métodos utilizan el denominado numero de onda, ν el cual es el inverso o
reciproco de la longitud de onda y sus unidades son cm-1.
_ 1
ν=
λ
Otros términos utilizados en el fenómeno ondulatorio de la luz son potencia (P) e
intensidad (I), relacionados ambos con el flujo de energía de una fuente de radiación
electromagnética. Entendiendo al primer termino como flujo de energía por unidad de
tiempo, en tanto que el segundo seria el flujo de energía por unidad de tiempo por área.
1.5.4 Tipos de espectros
Cuando átomos, iones o moléculas se relajan a niveles de menor energía después

de ser excitados desprenden el exceso de energía en forma de radiaciones
electromagnéticas. Si estas radiaciones son caracterizadas en un espectroscopio, presentan
lo que se denomina como espectros de emisión.
Existen tres tipos de espectros de emisión: de lineas, de bandas (lineas encimadas
no resueltas) y espectros continuos.
Los primeros son los espectros que presentan los átomos de los elementos luego de
ser excitados y emitir el exceso de energía en forma de radiación. Si esta es descompuesta
en un espectroscopio presentara solo ciertas lineas con una longitud de onda (o
frecuencia) característica y reproducible en todos los casos.
Algunas sustancias presentan una serie de lineas muy cercanas en su longitud de
onda que ocasiona que se vean como bandas de lineas. Esto es debido a subniveles
vibracionales los cuales en ocasiones son difíciles de resolver por algunos equipos de baja
resolución.
Cuando algunas sustancias o materiales son llevadas a temperaturas elevadas, por
ejemplo, al emitir luz y ser esta descompuesta presentan un espectro continuo con todas
las longitudes de onda, como la luz blanca que presenta todos los colores del arco iris.
Esta es la denominada radiación de cuerpo negro y depende mas de la temperatura que del
tipo de sustancia.

Un caso aparte se presenta cuando se pasa radiación electromagnética a través de
la materia la cual solo absorbe ciertas longitudes de onda dependiendo de la naturaleza de
la misma. Si se pasa luz blanca a través de la materia en estado gaseoso o en solución se
absorberán selectivamente solo ciertas frecuencias y la luz resultante presentará un
espectro con huecos donde estaban las frecuencias absorbidas.
Podemos irradiar una muestra con las longitudes de onda de un rango especifico
midiendo cual de estas son absorbidas. El resultado es lo que se denomina un espectro de
absorción el cual es un gráfico de la absorción de radiación electromagnética en función
de la longitud de onda o de la frecuencia. Es la huella dactilar para propósitos de
identificación.

Las sustancias presentan espectros de absorción característicos, con uno o mas
máximos y mínimos, por lo que son útiles en la identificación o confirmación de una
especie química. El color de la solución (en el visible) se relaciona con su espectro de
absorción, ya que una especie química puede absorber uno o mas colores y presentar
soluciones con los colores complementarios.
1.6 PROPIEDADES MECANO-CUANTICAS DE LA RADIACION

ELECTROMAGNETICA
Cuando la radiación interacciona con la materia la radiación puede ser absorbida y

la muestra experimenta un cambio de energía. En estos casos el modelo ondulatorio ya no
nos sirve y es necesario considerar a las radiaciones desde el punto de vista corpuscular,
en función de su energía, por lo que recurriremos al modelo cuántico que nos dice que la
luz esta formada por pequeños paquetes de energía denominados fotones. Cuando un
fotón es absorbido por una muestra este es “destruido” y su energía pasa a esta. La
energía esta cuantizada y todos los fotones de un tipo de radiación tendrán la misma
cantidad de energía la cual es diferente para los diferentes tipos de radiaciones. Las
radiaciones, desde este punto de vista, se analizan desde el punto de vista de su energía, la
cual es directamente proporcional a la frecuencia de la radiación de acuerdo a la siguiente
ecuación: E = hν
donde h es una constante de proporcionalidad denominada constante de Planck la cual
tiene diferentes valores en función de las unidades utilizadas:
h = 6.63 x 10-34 joule· s ó 6.63 x 10-27 erg· s
por lo tanto, una alta frecuencia implica ó indica una alta energía.
Podemos relacionar a la energía de la radiación con su longitud de onda ó con el
numero de onda, ν que es el numero de ondas por centímetro, a través de las siguientes
ecuaciones:
Ejemplo: calcule el numero de onda de un haz de radiación infrarroja con longitud de

onda de 5.0 µm y calcule la energía de los fotones de dicha radiación y la energía de un
mol de fotones de dicha radiación:
E = Joule / fotón Numero de Avogadro = 6.022 x 1023
1.6.1 El efecto fotoeléctrico
El efecto fotoeléctrico es el fenómeno que se presenta cuando la superficie de un

metal es irradiada con luz de determinada frecuencia generando una corriente eléctrica. El
fenómeno fue descubierto por Hertz a finales del siglo XIX cuando coloco dos electrodos
en un tubo de vacío y los irradió con diferentes radiaciones electromagnéticas observando
que algunas generaban un paso de corriente (en forma de chispa) desde el cátodo al
ánodo. Observó que no todas las frecuencias generaban esta corriente ni aun
incrementando la intensidad de la misma, siendo este una de los escollos de la física
clásica.
En 1905 Einstein encontró una respuesta a esto a través de los cuantos de energía
de Planck enunciando que las radiaciones electromagnéticas estaban compuestas por
pequeños paquetes de energía a los que denomino fotones y estos tenían una energía fija
en valores enteros de hv. Cuando uno de estos fotones choca o golpea a un electrón de una
átomo el fotón va a transferir su energía al electrón y si esta es suficiente para arrancarlo
del átomo y generar una corriente eléctrica. Si los fotones no tienen la energía necesaria
para arrancar al electrón no se genera la corriente ni aun incrementando la intensidad ya
que esta solo aumenta el numero de fotones pero no la energía de los mismos que es una
dependencia de su frecuencia.
Fue hasta 1916 que Millikan hizo mediciones precisas del fenómeno y con esto
confirmo lo expresado por Einstein. Millikan encontró que para cada tipo de metal había
un frecuencia umbral abajo de la cual los electrones no podían ser arrancados (aplicaba un
potencial negativo al ánodo hasta que la corriente se hacia cero). Arriba de esta frecuencia
umbral los electrones adquirían la energía en exceso y la convertían en energía cinética.
1.6.2 Estados de energía de la materia
Como resultado de la teoría cuántica de Planck, considerando la cuantizacion de la

energía, fue posible, gracias a aportaciones posteriores, explicar los espectros de absorción
y de emisión de la materia en base a los postulados de la teoría.
De esta teoría se establece que la materia (átomos, iones o moléculas) solo puede
existir en ciertos estados discretos de energía. Una sustancia puede pasar de un estado a
otro absorbiendo o emitiendo energía por un valor igual al diferencial de los dos estados.
Si el cambio de estado se realiza absorbiendo o emitiendo una radiación
electromagnética la longitud de onda o la frecuencia se deberá relacionar energéticamente
con la diferencia entre los estados a través de la siguiente ecuación:
C
E1 − E0 = hν = h
λ
Donde E1 es el estado inicial y E0 es el estado final de energía.
Los diferentes estados de energía son debidos, en este contexto, a el movimiento
de los electrones en torno al núcleo en átomos o iones, o entorno a dos núcleos en las
moléculas. Ademas en el caso de las moléculas sus cambios energéticos también pueden
ser debidos a vibraciones de sus enlaces o cambios rotacionales de las mismas.
A temperatura ambiente el estado de menor energía se denomina estado
fundamental o basal en tanto que estados de mayor energía se denominan estados
excitados.
1.6.3 Emisión y absorción de la radiación electromagnética
Cuando una sustancia pasa de un estado de mayor energía hacia un estado de

menor energía lo hace desprendiendo o liberando el diferencial de energía. Esta energía
puede tener diferentes formas, una de las cuales es como una radiación electromagnética,
como fotones. En este caso la radiación emitida puede ser caracterizada mediante un
espectrómetro y se denomina espectro de emisión, el cual se puede presentar en sus tres
modalidades: de lineas, de bandas o continuo.

Estos espectros de emisión se presentan, generalmente, como gráficos de potencia
relativa de la radiación en función de la longitud de onda o de la frecuencia.
El valor de la energía (hv) de la radiación emitida depende de en que estado
superior se encontraba la especie y este se da en función de la fuente de excitación. Un
bombardeo con electrones u otras partículas elementales lleva a estados de muy alta
energía que se libera como rayos X; la excitación a través de un arco eléctrico, chispas de
corriente alterna, una flama o un horno provee de energía que se libera como radiación
ultravioleta, visible o infrarroja; cuando la energía extra proviene de una radiación
electromagnética se observan espectros de emisión de fluorescencia o fosforescencia en
tanto que reacciones químicas exotérmicas pueden generar espectros de
quimioluminiscencia.
En otros casos, si se envía una o una serie de radiaciones electromagnéticas a
través de una capa de una muestra sólida, líquida o gaseosa la energía de los fotones de la
radiación se puede transferir a los iones, átomos o moléculas de la sustancia para pasarlos
a uno o mas estados excitados. Esto ocurrirá solo si los fotones tienen la energía necesaria
igual al diferencial energético entre el estado fundamental y algún estado excitado
considerando que estos están cuantizados.
Una representación gráfica de la disminución de la potencia de la energía radiante
en función de la frecuencia o de la longitud de onda es lo que se denomina un espectro de
absorción el cual es característico para cada especie química ya que estas presentan
estados cuantizados de acuerdo a su estructura o interacciones con el medio u otras
especies químicas, entre otros factores. En vista de esto, los espectros de absorción nos
pueden servir para caracterizar a una sustancia y utilizando la ley de Lambert-Beer se
pueden lograr análisis cuantitativos de la misma.
El espectro de absorción resultante puede tener diferente estructura dependiendo
de si la muestra son átomos, iones o moléculas. Se pueden encontrar espectros de picos
aislados o combinados o espectros que son curvas continuas sobre todo en moléculas con
varios enlaces donde se presentan también fenómenos vibracionales.
1.6.4 Ley de Lambert-Beer
Para utilizar la absorción de luz con fines cuantitativos se requiere considerar

ciertos parámetros y relacionar la dependencia de estos con la cantidad de radiación
absorbida, en este sentido la ley de Lambert-Beer, producto de la fusión de dos leyes,
cumple con este cometido al relacionar directamente la absorción de radiación
electromagnética con el numero de moléculas o átomos que esta encuentra a su paso.
Ley de Bouguer (Lambert): Para una cierta concentración de absorbente, la

intensidad de luz trasmitida, que previamente se ha logrado que sea paralela, plana y que
entre al medio absorbente formando ángulos rectos con el plano, disminuye
logaritmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en forma aritmética. Es
decir, la cantidad de radiación absorbida es proporcional al espesor atravesado.
Ley de Beer: Al aumentar la concentración del absorbente, la intensidad de luz

trasmitida disminuye logaritmicamente. Es decir, cada molécula de soluto absorberá
siempre la misma cantidad o fracción de radiación incidente independientemente de la
concentración, aunque esta ultima marcara cuantos fotones o fracciones de radiación serán
absorbidos.
Ley de Lambert y Beer: La intensidad de la luz trasmitida disminuye

logaritmicamente con el aumento proporcional de la concentración de absorbente y el
aumento proporcional de la longitud del trayecto de absorción de la radiación.
La ley de Lambert-Beer tiene gran utilidad en mediciones de tipo cuantitativo (su

utilidad es menor cualitativamente hablando) al relacionar a la radiación (los fotones de la
misma) con la cantidad o numero de especies químicas con las que interactúa. Esta ley
nos dice que un haz de radiación electromagnética se ve atenuado (disminuye su energía
por unidad de área) al interactuar con especies químicas absorbentes.
DIAGRAMA DE DISMINUCION DE POTENCIA
Como consecuencia de las interacciones entre los fotones y las partículas

absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po (antes Io ó intensidad) a P. Además de la
absorción en una medición de este tipo también hay perdidas por reflexión y dispersión,
dependiendo de los materiales de la celda, el solvente, la concentración, el tipo de
sustancia y los diversos cambios de interfase, por lo que es conveniente trabajar con
blancos:

Blanco de método: es una muestra con todos los componentes excepto el analito y
se les da todo el tratamiento que marca el procedimiento al que se someterá al analito. El
valor obtenido se deberá de sustraer posteriormente a la lectura del analito.
Blanco de reactivos: este es igual al de método pero no se somete a todo el
proceso de preparación sino que únicamente se mezclan todos los reactivos que se
agregaran al analito.
Blanco de campo: es similar al blanco de campo pero ademas se somete al
ambiente o a las condiciones o posibles contaminantes presente en el tratamiento o
preparación del analito, es decir, en las mismas condiciones que se hicieron las
mediciones.
Potencia: es la energía de un haz que sale de una fuente por unidad de tiempo y se mide
en watts; en el caso de la absorción se mide la energía de la radiación que, después de
atravesar la muestra, llega al detector por metro cuadrado del mismo, por segundo.
Transmitancia: La transmitancia, T, de una solución es la la fracción de radiación

P
T=
incidente trasmitida por la solución: P0
P
%T = 100
y generalmente se expresa como porcentaje : P0
Absorbancia: La absorbancia de una solución es el logaritmo negativo de la
transmitancia:
P
A = − logT = log 0
P
La absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación del haz.
De la ley de Lambert-Beer se obtiene que la absorbancia es directamente
proporcional a la longitud (b) de la trayectoria del haz a través de la solución, y a la
concentración de la especie absorbente:
Introduciendo una constante de proporcionalidad esto quedaría: A = abc, en donde
a es la constante de proporcionalidad, la cual es denominada absortividad y es
característica de cada especie. La magnitud de a depende de las unidades de b y c.
l
a=
Cuando b = cm y c = gramos por litro cm g
l
a=
Cuando b = cm y c = moles por litro cm mol y entonces se denomina
absortividad molar y se representa por , por lo tanto, en este caso:
Estas ecuaciones (Lambert-Beer) nos pueden ser útiles cuando deseamos o
necesitamos determinar concentraciones o absortividades, parámetro, este ultimo, de gran
importancia en algunas espectroscopias como es la de ultravioleta visible.
Para hacer estudios cuantitativos de una especie se utiliza el pico de mayor
absorción de su espectro de absorción, siempre y cuando este se encuentre libre de otras
absorciones. Se hacen mediciones de un solo punto o de múltiples puntos (curvas de

calibración) que son las mas deseables, utilizando cualquier método de calibración,
dependiendo de la muestra, estándar externo, adiciones múltiples o patrón interno.
La ley de Lambert-Beer es una ley aditiva, es decir si hay n componentes
absorbentes en una muestra la absorbancia total va a ser producto de las absorbancias de
todos los componentes absorbentes a la longitud de onda de trabajo.
Atotal = Aa + Ab + Ac ………….etc
Atotal = ℇabCa + ℇbbCb + ℇcbCc ……….. etc
Atotal = ∑Ai = ∑ ℇibCi
para n componentes se deben hacer mediciones a n longitudes de onda (λ) y se resuelve el

sistema de ecuaciones simultaneas.
Una curva de calibración es un gráfico que relaciona una respuesta analítica

como la absorción, contra una concentración. Se preparan soluciones de diferente
concentración y se hace la lectura; de acuerdo a la ley de Lambert-Beer debe haber una
relación lineal entre la respuesta y la concentración. Los resultados se grafican y se
obtiene la curva de calibración, o se realiza una regresión lineal y se encuentra la ecuación
(con la pendiente y el intercepto) que nos da la correlación entre lecturas y
concentraciones.
La selección de la longitud de onda debe ser siempre buscando la mayor linealidad
con la ley de Beer (concentración). Se busca un pico en el espectro de absorción (de
preferencia el de la mayor absorción) donde se observe la mayor sensibilidad del analito a
la radiación, es decir, donde el cambio de absorbancia por cambio en la concentración sea
muy marcado. Se busca que en ese punto la curva de absorción sea plana para que se
afecte menos la lectura por las fluctuaciones o falta de precisión del equipo. En esta
longitud de onda no deben de haber interferencias de otras sustancias ni del disolvente, es
decir, el pico debe estar libre y no debe tener picos de otras absorciones encimados ni
traslapados con el. En el caso de los fotocolorimetros de filtros, se utiliza el filtro que nos
de la mayor pendiente.

Ejemplo 1: Una disolución patrón de concentración 1 x 10-3 moles/ L presenta una
absorbancia de 1.29 a 275 nm de longitud de onda. Cual es la concentración de una
muestra si su absorbancia es de 0.75 y ambas lecturas se efectuaron en cubetas de paso
óptico de 1 cm.
solución: Para aplicar la ley de Lambert-Beer, primero despejamos la concentración y

posteriormente analizamos que datos tenemos y cuales nos faltan:
A
C=
por lo tanto εb observamos que no tenemos el valor de la absortividad
por lo que hay que calcularlo a partir de los datos de la disolución patrón, también
A
ε=
despejando de la misma ecuación: bC ; sustituyendo valores nos queda:
1.29
ε=
( )
(1) 1x10 −3 por lo que, en la muestra, la concentración será:
0.75
C=
(1) (1290 )
Cuando se hace trabajo de laboratorio no es recomendable recurrir a las tablas de

absortividad en virtud de que puede haber variaciones debidas al solvente, a la
temperatura o a las celdas, entre otros factores, que nos arrojarían datos erróneos, por lo
que es preferible obtenerla a través del uso de un patrón.

Ejemplo 2: A 510 nm de longitud de onda una disolución de KMnO4 que contiene 20
ppm de manganeso presenta una absorbancia de 0.7 cuando se mide en cubetas de 1 cm de
espesor. Determinar la absortividad molar del KMnO4.
Esta ley, sin embargo, no es infalible y esta sujeta a ciertas restricciones ya que en
determinadas condiciones o situaciones, pierde su linearidad. Las principales causas son
las que se enumeran a continuación:
a) Por concentración
Esta es una ley limite que funciona bien para soluciones diluidas. Concentraciones
mayores al 0.01 M hace que la ley pierda linearidad porque al estar muy cerca las
moléculas interactúan entre si y cada una afecta la distribución de carga de la otra, además
se puede afectar el índice de refracción de la solución y hace que se presenten otros
fenómenos como la reflexión, dispersión, etc. Esta perdida de linearidad también se
observa, en contadas ocasiones, a muy bajas concentraciones de algunas especies como
son algunos colorantes (ejemplo el azul de metileno).
b)Desviaciones Químicas
Estas se presentan cuando la sustancia bajo análisis sufre una transformación, es
decir, cuando se disocia, asocia o reacciona con el disolvente. Así la sustancia resultante o
producto, dará un espectro diferente al esperado.
Ejemplo: indicadores Acido-base
FORMULAS DE DESVIACIÓN QUÍMICA
El pH también desplaza este equilibrio. Para trabajar con una de las tres especies
hay que manipular el pH.
c) Desviaciones instrumentales
Hay que seleccionar bien la longitud de onda, de lo contrario nos daría una
absorbancia diferente y por lo tanto, también una absortividad diferente con el
consecuente cambio en la concentración obtenible
Hay que utilizar equipos con buenos sistemas de aislamiento o monocromación de
la radiación, es decir, con bandas angostas de longitudes de onda.También hay
radiaciones parásitas, producto de dispersiones y reflexiones en las superficies interiores.
Se puede incluir aquí también a las celdas utilizadas en las mediciones ya que si la
calidad de las mismas (grosor, espesor, homogeneidad, etc.) nos pueden arrojar resultados
variables.

1.6.5 Clasificación de los métodos espectroquímicos
Los métodos espectroquímicos o espectroscópicos están basados en la interacción

de la materia con radiaciones electromagnéticas. Estas radiaciones presentan varias
características entre las que se incluyen su energía, velocidad, amplitud, frecuencia,
ángulo de fase, polarización y dirección de propagación.
Para que se realice la espectroscopia se requiere que la interacción de los fotones
con la muestra le produzcan a estos un cambio en una o mas de las características
mencionadas. Así, la espectroscopia se divide en dos grandes clases: la espectroscopia
donde se transfiere la energía de los fotones hacia los átomos, iones o moléculas de la
muestra y, la espectroscopia donde no hay trasferencia de energía entre los fotones y las
partículas de la muestra.
En la espectroscopia con trasferencia de energía de los fotones a la muestra
tenemos espectroscopia de absorción y de emisión dependiendo como se va a obtener el
espectro. La fuente de energía dependerá del estado energético al que se llevara al analito.
En la espectroscopia de absorción el analito va a ser llevado de un estado de menor
energía hacia un estado de mayor energía:
Posteriormente se va a obtener el gráfico de absorbancia contra longitud de onda o

frecuencia o se mide la absorción contra una concentración:

En la espectroscopia de emisión, por el contrario, se va a excitar a la muestra y
posteriormente se obtiene el espectro de la radiación emitida en el proceso de relajación o
liberación del exceso de energía o energía absorbida:
ESPECTROSCOPIAS QUE ENVUELVEN CAMBIOS DE ENERGIA
Tipo de energía transferida Región del espectro Técnica espectroscopica

electromagnético
Absorción Rayos gamma Espectroscopia de Mossbauer
Rayos X Espectroscopia de absorción

de rayos X
Espectroscopia de UV-Vis
UV-Vis
Espectroscopia de absorción
atómica
Espectroscopia de infrarrojo
Infrarrojo
Espectroscopia Raman
Espectroscopia de
Microondas microondas
Espectroscopia de resonancia
de espín electrónico
Ondas de radio
Espectroscopia de resonancia
magnética nuclear

ESPECTROSCOPIAS QUE ENVUELVEN CAMBIOS DE ENERGIA
Emisión (excitación térmica) UV-Vis Espectroscopia de emisión

atómica
Fotoluminiscencia Rayos X Fluorescencia de rayos X
UV-Vis Espectroscopia de
fluorescencia
Espectroscopia de
fosforescencia
Espectroscopia de
fluorescencia atómica
ESPECTROSCOPIAS QUE NO ENVUELVEN UN CAMBIO DE ENERGÍA
Región del espectro Tipo de interacción Técnica espectroscopica

electromagnético
Rayos X Difracción Difracción de rayos X
UV-Vis Refracción Refractometría
Dispersión Nefelometría
Turbidimetría
Dispersión rotatoria óptica

U1 Principios de Analisis Instrumental

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Instituto Tecnológico de la Paz Ingeniería Bioquímica

M.C. Jesus Ignacio Gonzalez Garcia

Instituto Tecnologico de la Paz

M.C. Jesús Ignacio González García 1

1.1 METODOS CLASICOS E INSTRUMENTALES

El análisis químico se hizo necesario desde que el hombre empezó a procesar

M.C. Jesús Ignacio González García 2

Analisis cualitativo: ¿Que es lo que esta presente?

Analisis cuantitativo: ¿Cuanto esta presente?

En ambos tipos de análisis, la información necesaria es obtenida por medio de la

En los clásicos, generalmente, primero se separan los analitos de interés de una

1.1.2 Clasificación de los métodos instrumentales

FENOMENO TIPO DE METODOS

Cambios de energía de espín de núcleos en un Resonancia magnética nuclear

La clasificación también puede hacerse , mas específicamente, por medio de la

Señal analítica Método Instrumental

Emisión de radiación Espectroscopia de emisión (rayos x, UV,

Absorción de radiación Espectroscopia (rayos x, UV, visible, IR);

Dispersión de la radiación Turbidimetria, nefelometria y espectroscopia

Refracción de la radiación Refractometria; interferometria

Difracción de la radiación Difracción de rayos x y de electrones

Rotación de la radiación Polarimetria; dispersión rotatoria óptica;

M.C. Jesús Ignacio González García 4

Potencial eléctrico Potenciometria; cronopotenciometria

Carga eléctrica Coulombimetria

Corriente eléctrica Polarografia; amperometria

Resistencia eléctrica Conductimetria

Razón masa/carga Espectroscopia de masas

Velocidad de reacción Métodos cinéticos

Propiedades térmicas Conductividad térmica y métodos de entalpia

Radiactividad Métodos de activación y de dilución isotópica

1.1.3 Componentes de los instrumentos de medición

En los métodos instrumentales de análisis la información que se obtiene de los

1.1.4 Dominio de los datos

Dominios analógicos: la información se codifica como la magnitud de una carga eléctrica

PARAMETROS DE CALIDAD DE UN METODO ANALITICO

1.2.1 Parámetros cualitativos

1.2.2 Parámetros cuantitativos

Criterio Parámetro de calidad

1. Precisión Desviación estándar absoluta, desviación estándar

2. Exactitud Error absoluto, error relativo

3. Sensibilidad Sensibilidad de calibración, sensibilidad analítica

4. Limite de detección Blanco mas tres veces la desviación estándar del

5. Intervalo de concentración Concentración entre el limite de cuantificación

6. Selectividad Coeficiente de selectividad

M.C. Jesús Ignacio González García 7

Cuando se realiza una medición analítica se obtienen generalmente dos

1.3.1 Fuentes de ruido

1. Ruido térmico: es debido a la agitación térmica (debida a la fricción) de los electrones u

M.C. Jesús Ignacio González García 8

1.3.2 Aumento de la relación señal-ruido

Regularmente la señal analítica es muy superior al ruido lo que hace relativamente

1.4 CALIBRACION DE LOS METODOS INSTRUMENTALES

Smedida = KnA + Sreac Ecuación 1

Smedida = KCA + Sreac Ecuación 2

M.C. Jesús Ignacio González García 9

una 𝛌 de 350 nm utilizando H2SO4 0.0050 M como blanco de reactivos.

También se debe calibrar el material de vidrio clase A utilizado para la medición de

Todos los estándares utilizados, ya sea comerciales, preparados o procedimentales, deben

La American Chemical Society (ACS) define a la estandarización como el proceso para

Existen diferentes maneras o métodos de realizar la estandarización de los métodos

M.C. Jesús Ignacio González García 11

1.4.1 Comparación de estándares