Instituto Tecnológico de la Paz Ingeniería Bioquímica

UNIDAD 2: TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

2.1 Fundamentos
Estos métodos se basan en la dispersión de las radiaciones electromagnéticas por las partículas
no trasparentes de materia suspendidas en un liquido y, con pequeñas modificaciones, se puede utilizar
el equipo y la teoría utilizados en la espectroscopia. El fenómeno de la dispersión de las radiaciones
electromagnéticas se presenta como resultado del choque de la radiación electromagnética con
partículas de precipitados finos o suspensiones coloidales al atravesar un medio trasparente donde este
tipo de partículas esta presente.

La dispersión es el resultado de la polarización eléctrica de las partículas. El campo eléctrico

oscilante de los fotones actúa sobre la carga de las partículas provocando que oscilen a la misma
frecuencia ; la partícula se convierte en un pequeño dipolo radiante cuya radiación visible es la luz
dispersada.

Los métodos se utilizan para medir la turbidez presente en algún liquido que puede ser agua,
una bebida, un medicamento, etc, o para medir la concentración de un a especie química,
precipitandola o haciéndola insoluble mediante una reacción química.
Este fenómeno es el responsable del color azul del cielo, el rojo de los atardeceres y la turbidez
de la leche. Los dos primeros casos se deben al mismo fenómeno, la dispersión de la luz por partículas
de polvo, moléculas de agua y gases presentes en la atmósfera. La luz violeta y la azul se dispersan en
mayor medida que longitudes de onda mayores dando el color azul del cielo en todas direcciones
mientras que el resto de las radiaciones sin la luz azul se ve amarillenta, en tanto que en los atardeceres
el color rojo, de longitudes de onda largas se dispersa muy poco y llega en linea recta hacia nosotros
porque no se dispersa tanto como la luz azul.

Existen dos categorías de dispersión de luz:

- Dispersión elástica
- Dispersión inelastica

En el primer caso, elástica, la radiación es absorbida por el analito y re-emitida sin cambio en su
energía en tanto que en el segundo caso sí se presenta un cambio en la energía.
La dispersión elástica es el tipo de dispersión mas utilizada en métodos analíticos y esta se
divide a su vez en dos tipos:
- Dispersión Raleigh por partículas pequeñas de menos del 5 % al 10 % de la longitud de onda de la
radiación. Este fenómeno se aplica a partículas de hasta 0.1 µm, partículas mas pequeñas no
presentaran este tipo de dispersión.
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- Dispersión por partículas grandes donde la dispersión no es selectiva y se dispersan todas las
longitudes de onda por igual. Para poder observar el fenómeno de dispersión en todas las direcciones
se requiere que las dimensiones de las partículas dispersantes sean de al menos 3/2 de la longitud de
onda ( max). Por ejemplo, si tenemos partículas con dimensiones de 750 nm, dispersaran luz de 500
nm.

En el primer caso, la intensidad de la dispersión de la radiación es distribuida simétricamente

(en todas direcciones) y es proporcional a la cuarta potencia de la frecuencia (v4) o inversamente
proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda (1/ 4 o -4), este es el coeficiente de dispersión
y da origen a “La Ley de Raleigh”. Debido a las dimensiones de las partículas, hay mayor dispersión de
la luz azul que de la roja porque la primera tiene menor longitud de onda.
En el caso de la dispersión por partículas grandes, la dispersión es mayormente hacia el frente
de propagación como resultado de interferencias destructivas y constructivas.

Las técnicas de dispersión más comunes son la turbidimetría y la nefelometría, ambas se basan
en la dispersión elástica de la luz debida a una suspensión coloidal de partículas (diámetros de 10-4 a
10-7 cm). Como se mencionó, en estas técnicas no hay perdida de potencia (no hay absorción) ya que
solo se afecta la dirección de propagación del haz.

La selección de uno ú otro método es en base a la fracción de luz dispersada. Cuando la

dispersión es muy alta (muchas partículas) la turbidimetría es la mas satisfactoria. Si la dispersión es
mínima, se utiliza la nefelometría (aproximadamente 90 % de transmitancia). En la nefelometría lo que
se mide es la cantidad de luz dispersada, en tanto que en la turbidimetría lo que se mide es la cantidad
de luz no dispersada.
Los factores que se consideran, o que influyen, para la selección mencionada son dos:
1. Se considera la intensidad de la luz trasmitida o dispersada en relación a la intensidad de la radiación
de la fuente. Si hay pocas partículas, la intensidad de la radiación trasmitida, IT, es muy similar a la
intensidad de la fuente, I0, lo que genera una incertidumbre en la medición, por lo que la técnica de
elección en este caso es la nefelometría midiendo luz dispersa en un ángulo especifico.

2. El otro factor es el tamaño de las partículas. En nefelometría la dispersión a 900 será mayor si las
partículas presentan el efecto Raleigh de dispersión.

Las partículas grandes dispersan la mayoría de la radiación incluyendo la dispersión a 900 por lo
que preferentemente, en este caso, se utiliza la turbidimetría. Para esta técnica no importa el tamaño de
las partículas. Este si es importante de acuerdo a la longitud de onda que se vaya a utilizar, por ejemplo,
si la radiación es del rango del ultravioleta o el visible, el tamaño optimo de las partículas será de entre
0.1-1.0 µm.

Para trabajar la turbidimetría es necesario seleccionar perfectamente la longitud de onda de

trabajo para evitar al máximo que ocurra absorción de radiación por la muestra ya que la radiación
atravesará la muestra y puede haber partículas absorbentes, coloridas o no, que pueden ocasionar
mediciones erróneas, aumentadas, de turbidez. En el caso de la nefelometría no se requiere seleccionar
la longitud de onda ya que no necesitamos que la radiación atraviese a la muestra; a menos que se

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presente fluorescencia por parte del analito, podemos utilizar luz blanca, sin necesidad de monocromar
la luz.
Cuando se utiliza luz monocromática hay que considerar la sensibilidad del trasductor que
detectara la intensidad de la radiación ya que hay algunos que son mas sensibles, por ejemplo, a
longitudes de onda cortas del visible (400 nm) que a longitudes largas (700 nm).

Cuando se trabaja en análisis cuantitativo, por reacciones de precipitación, el método se debe

estandarizar y para eso se pueden utilizar suspensiones estándar de calibración o soluciones de turbidez
estándar. En estos casos es importante tener cuidado de factores como el tamaño y la forma de las
partículas porque estos influyen en la dispersión de la luz. Hay que uniformar el tamaño de las
partículas tanto entre muestras como entre muestras y estándares, evitando al máximo el empirismo de
los métodos. Los estándares y las muestras se preparan bajo condiciones muy rígidas ya que estos
factores son críticos.
Para lograr la uniformidad, por ejemplo, en métodos que implican la formación de precipitados
hay que controlar parámetros que influyen en el tamaño y forma de las partículas dispersantes
precipitadas. Parámetros importantes que influyen en la uniformidad de las lecturas y por lo tanto de
los resultados cuantitativos son la concentración de los reactivos que se agregan, en que orden se
agregan, pH, temperatura, velocidad de agitación, fuerza ionica de la solución y el tiempo entre la
formación del precipitado y la lectura en el equipo.

Algunos métodos particulares hacen uso de sustancias de superficie activa como gelatina,
glicerol o dextrinas para estabilizar la suspensión coloidal evitando la coagulación de las partículas.

2.2. Instrumentos

Turbidimetría: lo que mide es la disminución de la intensidad de un haz colimado como consecuencia

de la dispersión de la luz por las partículas. La medición se realiza en linea con la fuente de radiación y
se mide la disminución de la transmitancia.

Nefelometría: Hace una medición de la radiación (generalmente no colimada) dispersada, en un

ángulo de 90 0 con respecto al haz incidente.

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Para estos métodos analíticos se utilizan turbidímetros ó nefelómetros , aunque también se

pueden utilizar fluorómetros ó espectrofotómetro.
La medición en la turbidimetría es muy similar a la absorbancia por lo que se utilizan
espectrofotómetro como los Spectronic o algún otro. En el caso de la nefelometría, por su similitud con
la fluorescencia se utilizan espectrofluorómetros.
En el caso de los turbidímetros los hay también sencillos y manuales, los cuales tienen una
fuente de radiación y un tubo observador con una lente, en los que el ojo humano es el detector pero se
encuentran en franco desuso.
Refiriéndonos a los nefelómetros, los hay con detectores a 900 ó en otros ángulos. Los
detectores son fotoceldas ó tubos fotomultiplicadores y también deben contar con una fuente de
radiación no necesariamente monocromática o de cierta longitud de onda, solo en los casos de muestras
que presenten fluorescencia no se puede utilizar luz blanca.

2.3 Aplicaciones

Existen muchos métodos analíticos basados en la turbidez, en algunos casos nada más para
medir grados de turbidez y en otros casos para hacer mediciones cuantitativas. En este último caso,
para que las mediciones sean confiables se deben controlar escrupulosamente todas las variables
mencionadas que afectan el tamaño y la forma de las partículas como son el pH, la temperatura, fuerza
ionica, etc.
En los métodos cuantitativos para determinar concentraciones por turbidimetría se utiliza la
transmitancia:

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IT / I 0
T= −logT = kbC I0
Donde IT es la intensidad trasmitida y I0 es la intensidad de la fuente. C es la concentración (p/v) de las
partículas, b es la ruta o trayecto y k es una constante que depende de factores como tamaño, forma y la
longitud de onda ( ).
Para establecer la linearidad se realiza una curva de calibración con una serie de estándares a diferente
concentraciones.
En el caso de la nefelometría la medición de la intensidad dispersada nos da:
Is =ksI0C
Cuando se va a medir la turbidez ( en unidades de turbidez) de un líquido, como el agua, la formulación
de estándares de turbidez no es fácil por lo que el método se calibra a través de soluciones estándar de
algún tipo de polímero sintético de concentraciones conocidas con las que se construye una curva
(forma gráfica) o se obtiene la ecuación de la misma. En este caso un estándar primario utilizado es la
formazina, la cual se obtiene mezclando una solución al 1% de sulfato de hidrazina (N2H2. H2SO4) con
una solución al 10 % de hexametilentetramina resultando en una suspensión con 4000 unidades de
turbidez nefelometrica (NTV). Con esta suspensión se realizan diluciones para obtener la curva en
determinado rango (0 a 40 NTV es lo mas común). Se utiliza en análisis de cervezas, jugo de naranja
clarificados y jarabe de maple, por ejemplo, entre muchas otras.

Como la longitud de onda de la luz que se dispersa depende del tamaño de las partículas que la
dispersan, la técnica se puede utilizar para medir el peso molecular de polímeros estableciendo que
longitudes de onda se están dispersando y esta se correlaciona con el tamaño de las partículas de
polímero.

Algunas otras aplicaciones de estos métodos son el análisis de materiales en suspensión en aguas (ejem.
para calderas), análisis nefelométrico, como ya dijimos, de trasparencia de bebidas y fármacos, análisis
de algunos iones con reactivos precipitantes (ejem. sulfatos), turbidimetría para detectar punto final de
titulaciones por precipitación en la que esta va aumentando hasta quedar estable.

PRINCIPALES IONES ANALIZADOS POR TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

ANALITO PRECIPITANTE PRECIPITADO

Ag+ NaCl AgCl

Ca+2 Na2C2O4 Ca2C2O4

Cl- AgNO3 AgCl

CN- AgNO3 AgCN

CO3 -2 BaCl2 BaCO3

F- CaCl2 CaF2

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PRINCIPALES IONES ANALIZADOS POR TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

SO4 -2 BaCl2 BaSO4

Hay que cuidar interferencias como la limpieza e integridad de las celdas así como la presencia de
especies coloridas o absorbentes.

Escala de McFarland
Una de las aplicaciones mas importantes de la turbidimetría es su utilización para establecer la posible
concentración de bacterias por mililitro en una suspensión bacteriana, esto se relaciona como UFC
(unidades formadoras de colonias) aunque esta no diferencia entre células bacterianas viables y
muertas. Normalmente la cuantificación de suspensiones bacterianas se determina haciendo diluciones
y mezclando cantidades establecidas de la suspensión con un Agar para obtener placas (en cajas de
Petri), las cuales luego de solidificar, son incubadas a cierta temperatura (37 0C) durante un tiempo
definido, entre 24 y 48 horas. El procedimiento es lento y requiere invertir un numero apreciable de
recursos.
Para facilitar este procedimiento para evaluar el contenido bacteriano, se diseño la denominada Escala
de McFarland la cual es construida a través de una serie de tubos con una suspensión química fina
estandarizada y que genera una turbidez similar a la que producen las bacterias en un medio liquido.
Los tubos contienen una serie de patrones o estándares controlados que se obtienen por una reacción
química de precipitación a diferente concentración y cuya turbidez se relaciona a un número de
bacterias en suspensión. Estos estándares son creados al mezclar soluciones de cloruro de bario al 1%
con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos, que forma un precipitado de sulfato de bario en
suspensión.
La escala de McFarlan va de 0.5 a 10 y esta se relaciona a UFC tomando como referencia a loa
Escherichia Coli.

Un ejemplo de construcción de escala de McFarland se ve en la siguiente tabla:

McFarland Standard No. 0.5 1 2 3 4

1.0% Cloruro de bario (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1.0% Ácido sulfúrico (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6
Densidad celular aproximada (1X108 CFU/
1.5 3.0 6.0 9.0 12.0
mL)
% de Transmitancia* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5
0.08 to
Absorbancia* 0.257 0.451 0.582 0.669
0.1

* con longitud de onda de 600 nm

Una escala 0.5 McFarland es equivalente a una suspensión bacteriana que contiene entre 1
x 108 - 2 x 108 UFC/ml de E. Coli.

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2.4 Analisis de procesos

Para algunos procesos existen equipos de los dos tipos que pueden ser integrados en le flujo de
algún producto en producción, el cual puede estar detectando si hay variaciones a través de la turbidesz
en algunos otros casos verificando la ausencia de partículas en suspensión o la concentración de estas
en relación a estándares o normas de valores permitidos o normas de calidad..
Un ejemplo son los análisis de grandes volúmenes de pruebas inmunologicas antígeno-
anticuerpo denominadas: inmunoturbidimetría e inmunonefelometría.

Análisis nefelométrico en flujo continuo

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