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1.wuolah Premium Tema 13
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Biotecnología Vegetal
3º Grado en Biotecnología
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
La mutagénesis insercional es completamente aleatoria y con controlada. Sin embargo, la
mutagenesis mediante CRISPR-Cas9 requiere de mutagénesis insercional en muchos casos,
porque se debe generar una planta transgénica que exprese la Cas9 y un gen marcador para
seleccionar la planta. Pero después, la edición se produce en un sitio concreto debido a la
especificidad que da el ARN guía.
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Mutaciones (Diapositiva 3)
Una mutación es cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos del ADN. Hablamos tanto de
mutaciones de tipo Smear (mutación de nucleótido simple), como de pequeños indels, como
mutaciones que afecten a un segmento cromosómico completo como puede ser una delecion
grande de un segmento cromosómico, una transversión, una inversión o incluso las mutaciones
Las clasificaciones pueden variar en funcion de lo que tomemos como referencia. En este caso
las clasificamos en función del tipo de células a las que afecten:
• Mutaciones somáticas: son las que afectan a células somáticas. Las mutaciones de este
tipo no se heredan en la descendencia, por lo que no tienen importancia desde el punto
de vista evolutivo. Si se produce este tipo de mutación, suelen aparecer los individuos
mosaico, que son aquellos que tienen poblaciones celulares con distintos genotipos.
• Mutaciones germinales: son las que afectan a células germinales. Son las mutaciones
más interesantes porque se transmiten a la descendencia y suponen la fuente primaria
de variación genética (la segunda fuente de variación genética es la recombinación
homóloga que se produce entre las cromátidas no hermanas de los cromosomas
homólogos durante la meiosis).
Diferencia entre un mosaico y una quimera: tanto el individuo mosaico como el quimera se
caracterizan por tener poblaciones celulares con distinta información genética. La diferencia
principal se encuentra en cómo se origina el individuo:
• Individuo mosaico. Se origina a partir de un único porque se producen mutaciones
durante las divisiones celulares.
• Individuo quimera. En los individuos quimera tiene lugar una fusión de cigotos y a
medida que se van duplicando se generan dos tipos celulares distintos.
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Niveles mutacionales (Diapositiva 4)
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• Mutaciones cromosómicas: se clasifican en dos tipos:
o Estructurales: afectan a un segmento cromosómico que incluye varios cientos
de genes (aunque a partir de 2-3 genes ya se suele hablar de mutaciones
cromosómicas estructurales). Hablamos sobre todo de deleciones,
duplicaciones, inversiones y translocaciones.
o Numéricas: las euploidías provocan el aumento o la pérdida de un juego
completo de cromosomas, que es lo que da lugar a los individuos triploides. En
el caso de las aneuploidías, lo que se produce es la pérdida o ganancia de uno o
varios cromosomas (trisomía).
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
¿Cómo establecemos el límite entre una inserción-deleción pequeña y las mutaciones
cromosómicas estructurales? Esto se hace en función del número de genes que albergue el
segmento cromosómico afectado:
• Si dicho fragmento cromosómico contiene un único gen, por lo general hablamos de
mutaciones génicas o puntuales. Por ejemplo, si la deleción provoca la pérdida de 7-8
Kb, pero solo se ve afectado el promotor y los exones de un gen, es una mutación génica
o puntual.
• Cuando el fragmento cromosómico alberga más de un gen, hablamos de mutaciones
cromosómicas estructurales.
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Tipos de mutaciones puntuales (Diapositiva 5)
En la mutagénesis física o química, cada agente mutagénico tiene un tipo de mutación asociada
que es característica. Esto es lo que se denomina especificidad mutacional.
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Consecuencias de las mutaciones puntuales (Diapositiva 6)
Todo lo que estamos viendo en esta diapositiva solo puede ocurrir cuando la mutación afecta a
la secuencia codificante de un gen.
• Mutación sinónima (silenciosa): produce un cambio en la secuencia nucleotídica pero
no afecta a la secuencia aminoacídica (la secuencia de la proteína). En este caso tenemos
un cambio de una guanina a una timina, pero el codón sigue dando lugar al mismo
aminoácido, a una Alanina.
• Mutaciones no sinónimas: se produce un cambio nucleotídico que acarrea un cambio
aminoacídico. En este caso tenemos un cambio de una Alanina a una Arginina.
• Mutación sin sentido: la mutación puede dar lugar a la aparición de un codon de STOP
prematuro.
• Mutación cambio de pauta de lectura: se produce por la adición o deleción de
nucleótidos, siempre que no sean múltiplos de tres. Este cambio en el marco de lectura
provoca la sintesis de una proteína completamente distinta a la silvestre. También suele
ocurrir que el cambio en el marco de lectura de lugar a la aparición de un codon de STOP
prematuro.
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Desde el punto de vista funcional, la mutación que da lugar a consecuencias fenotípicas más
severas es la mutación de cambio de pauta de lectura que da lugar a codones de STOP
prematuros. Sin embargo, también hay que tener en cuenta el lugar donde se produce la
mutación, ya que las consecuencias van a ser mayores cuando la mutación se produce a principio
del gen que cuando se produce al final, cerca del extremo 3'.
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Mutaciones cromosómicas estructurales (Diapositiva 7)
Las mutaciones cromosómicas estructurales son las que afectan a fragmentos cromosómicos
con un elevado número de genes. Tenemos:
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
• Deleción: pérdida de un segmento cromosómico. Las deleciones:
o En homocigosis suelen ser letales para el individuo portador.
o En heterocigosis el efecto será más o menos deletéreo dependiendo de la
importancia de los genes presentes en el segmento perdido.
Cuando se produce una deleción, una mutación que sea recesiva se puede expresar. Este
tipo de mutaciones pueden tener efectos fenotípicos bastante severos.
• Duplicación: ocurre una repetición de un segmento cromosómico. No hay una pérdida,
sino una ganancia de información.
En cualquier caso, como las deleciones y las duplicaciones afectan a la cantidad de material
genético que tiene el individuo, pueden conducir a alteraciones de la dosis génica.
Sabemos que las proteínas, por lo general, no actúan solas, sino que lo hacen en colaboración
con otras proteínas (forman complejos proteicos). Cuando la dosis génica se ve alterada por este
tipo de mutaciones, también se ven alterados los complejos proteicos, porque habrá mayor
concentración de una proteína que de las demás.
Esto tiene graves consecuencias sobre los procesos de desarrollo, que se encuentran bastante
controlados desde el punto de vista genético. Durante estos procesos los diferentes factores de
transcripción se van activando y desactivando en determinados momentos, por lo que cualqueir
alteración en el conjunto de dichos factores puede provocar graves alteraciones en el programa.
Es importante tener en cuenta que la cantidad total de ADN de las células que sufren este tipo
de mutaciones no cambia. Por tanto, este tipo de mutaciones nunca producen alteraciones
desde el punto de vista de la dosis génica.
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Para que se produzcan inversiones y translocaciones, el segmento cromosómico debe tener un
punto de rotura. Dependiendo del lugar donde se produzca la rotura:
• Si se produce en una región intergénica sin relevancia a nivel funcional (no tiene
elementos promotores ni regiones codificantes), puede que tenga consecuencias si se
mueve el entorno genético de esos genes, ya que esto puede hacer que se expresen más
o menos.
• Si se produce en una región promotora puede dar lugar a incremento o una disminución
de los niveles de expresión, dependiendo de la región afectada del promotor.
• Si afecta a la región codificante del gen, podemos tener una mutación knock-out (de
falta de función).
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Dependiendo de lo que ocurra podemos tener cualquier tipo de mutación menos de dosis
génica.
Con respecto a las translocaciones: aunque no se produzcan alteraciones de dosis génica en los
individuos portadores, en sus descendientes si que puede haber alteraciones. Esto es debido a
que el reparto de los cromosomas durante la meiosis puede provocar la aparición de distintos
tipos de gametos: compensados y no compensados.
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Mutaciones cromosómicas numéricas (Diapositiva 9)
La importancia de las euploidías en agricultura reside en el hecho de que cuanto mayor sea la
cantidad de material genético, mayor es el volumen celular. En el caso de los frutos, estas plantas
darán frutos de mayor tamaño.
Durante la formación del fruto no todo el aumento del tamaño se debe a las divisiones celulares.
La endorreduplicación es un proceso que consiste en divisiones del material genético sin que se
produzca la citoquinesis. Esto lo que hace es concentrar el volumen del material genético y con
ello el volumen celular. Los frutos carnosos, por lo general, tienen varias etapas:
• Primera etapa: se produce un aumento del tamaño del fruto por división celular.
• Segunda etapa: su aumento de tamaño se debe a la endorreduplicación, es decir, al
aumento del tamaño de la célula.
• Tercera etapa: maduración.
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No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
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Tipos de mutaciones (Diapositiva 11)
Hay que tener en cuenta que a principios del siglo XX se redescubren los principios mendelianos
y la teoría cromosómica de la herencia. Hasta 1953 Watson y Crick no establecieron su modelo
de la doble hélice de ADN.
Sin embargo, 25 años antes, algunos investigadores ya habían demostrado que los agentes
físicos eran capaces de producir mutaciones heredables.
• Muller demostró en 1927 que los rayos X producían mutaciones en tandem en
Drosophila.
• Un año después, Stadler también demostró los efectos mutagénicos de los rayos X en
maíz y en cebada.
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La luz ultravioleta tiene una parte que se considera radiación no ionizante, mientras que otra
parte si que es radiación ionizante.
Cuanto más energía tenga la radiación, mayores daños produce sobre el ADN.
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Mutágenos físicos (Diapositiva 14)
Algo que caracteriza a los agentes mutagénicos físicos es que producen un tipo de mutación
característica, un fenómeno que se conoce como especificidad mutacional.
• Luz ultravioleta: en el caso de la luz ultravioleta, lo que se suele producir son dímeros
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de timina. El problema es que durante la replicación, estos dímeros no se emparejan
con las respectivas moléculas de adenina, sino que se emparejan con otro tipo de
nucleótidos. Por tanto, se producen mutaciones, que en los descendientes pueden dar
lugar a mutaciones de tipo puntual.
• Rayos X y gamma: además de producir mutaciones génicas por oxidación del ADN (en
concreto de la guanina), como es una radiación de mayor energía, también produce
roturas en la cadena de ADN. A nivel celular, cuando se repara la rotura, se introducen
alteraciones que pueden dar lugar a mutaciones.
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Mutágenos físicos (Diapositiva 15)
Efecto de la luz ultravioleta sobre el ADN de una célula normal que se encuentra en división.
Las mutaciones ionizantes mediadas por rayos X o gamma también pueden provocar la rotura
de la doble cadena de ADN. Este mecanismo puede dar lugar a mutaciones de tipo Indel.
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Es algo parecido a cómo funciona CRISPR-Cas9. El ARN guía lleva a la Cas9 a una región concreta
del genoma, produce un corte de doble cadena y la propia maquinaria de reparación celular
introduce mutaciones al intentar reparar el corte.
La diferencia es que en este caso la rotura de doble cadena se produce de forma aleatoria en
cualquier región del genoma, mientras que con la tecnología de CRISPR-Cas9 lo que hacemos es
introducir el corte de doble cadena en una región específica del genoma.
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Que la maquinaria celular lo arregle bien es muy difícil en este caso, porque no tiene molde. Lo
que hace la maquinaria celular es darle continuidad al fragmento de ADN; pero como no tiene
molde, introduce pequeñas deleciones o inserciones. Lo normal es que se produzcan pequeñas
deleciones de entre 1-6 nucleótidos u otras de mayor tamaño de unos 200-300 nucleótidos.
Todos los experimentos que demostraron que tanto los agentes físicos como químicos daban
lugar a mutaciones en el material genético se hicieron antes incluso de conocer que el materia
genético era el ADN. A mediados del siglo XX, aún se dudaba de si era el ADN o las proteínas las
que contenían la información genética.
Lo que sí se pudo demostrar es que los rayos X producían alteraciones fenotípicas en Drosophila,
maíz y cebada. En este caso fueron Auerbach y Robson los que demostraron en el año 1942 los
efectos tóxicos del gas mostaza en Drosophila.
Los análogos de bases son bases nitrogenadas que se parecen mucho en su estructura a las bases
nitrogenadas que se incorporan durante la replicacion del ADN. Por tanto, si durante la
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replicación se añaden estos compuestos en el medio, se producen alteraciones en la síntesis de
la nueva cadena de ADN.
En este caso vemos el 5-Bromouracilo, que es una molécula un poco particular, ya que se trata
de un tautómero que tiene dos isómeros: forma cetónica y forma enólica. La única diferencia
entre las dos moleculas es la posicion del atomo de oxígeno y del grupo hidroxílico. Existe un
equilibrio en el que la forma enólica pasa a cetónica y viceversa, pero no quiere decir que cada
vez que se produce una replicación cambia de forma.
• La forma cetónica se aparea con una adenina porque es análoga a la timina. Cuando
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comienza un proceso de replicación y en el medio se encuentra esta forma cetónica del
5-Bromouracilo, se incorpora en lugar de la timina.
• Cuando el 5-Bromouracilo cambia su configuración de forma cetónica a forma enólica,
en lugar de aparearse con una adenina, se aparea con una guanina, ya que es análoga
de la citosina.
En resumen:
• Forma cetónica: análogo de la timina, se aparea con la adenina.
• Forma enólica: análogo de la citosina, se aparea con una guanina.
Si durante las diferentes etapas de la replicación cambia el tautómero del 5-Bromouracilo desde
la forma cetónica a la forma enólica, lo que ocurre es que en la cadena molde, en lugar de una
También puede ocurrir lo contrario, es decir, partir de una cadena original y que el 5-
Bromouracilo en su forma enólica se aparee con la citosina. En otra de las replicaciones, si la
forma enólica pasa a la cetónica, como es análoga a la timina, hace que se incorpore en la nueva
cadena una adenina. Cuando la adenina actúa de molde, se produce una transición de CG a TA.
Una forma de conseguir variabilidad natural es generando mutaciones, pero no se espera a que
la mutación aparezca de forma espontánea, sino que se inicia un proyecto para generar una
colección de mutantes. Esto se puede conseguir:
• Aplicando un agente físico: las diferentes radiaciones mencionadas en diapositivas
anteriores.
• Aplicando un agente químico: hasta ahora hemos visto solo los análogos de bases, pero
hay bastantes más.
• Mediante variación somaclonal: las condiciones de estrés generadas en los cultivos in
vitro provocan la aparición de mutaciones.
• Mediante mutagénesis insercional o biológica: una secuencia de ADN se inserta en un
segmento cromosómico y produce una mutación, ya que se cambia la estructura del
gen, del promotor o de cualquier región en la que se inserte.
Por tanto, tenemos cuatro fuentes de variación natural. La mutagénesis insercional tiene una
gran ventaja y es que deja una etiqueta, por lo que directamente sabemos la posición del
genoma que se ha editado.
¿Cómo se generan las colecciones de mutantes? Las semillas se introducen en una solución que
contiene EMS y se mantienen en agitación durante toda la noche. Cuando se ponen en la
solución acuosa lo que se induce es la salida del estado de dormancia y la semilla comienza a
absorber agua y el EMS que contiene. Tras esto, las células comienzan a replicarse y
transcribirse, por lo que el resultado es que se inducen mutaciones de forma aleatoria.
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• Muchas de estas mutaciones serán letales (porque afectan a genes esenciales), por lo
que simplemente cuando se pongan en tierra a germinar, no lo van a hacer.
• Sin embargo, habrá otras que no afecten a genes esenciales y que puedan germinar y
crecer.
En función de si la mutación es dominante o recesiva, vamos a ver sus efectos antes o después:
• Si la mutación es dominante lo vamos a ver en la primera generación de plantas.
• Para ver los efectos de la mutación recesiva necesitamos hacer una generación más.
Esto es debido a que las mutaciones (inserción con T-DNA o mutaciones inducidas por
agentes químicos) se generan en heterocigosis, lo que indica que solo la contiene uno
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de los cromosomas en una especie diploide.
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Mutágenos químicos (Diapositiva 20)
Los colorantes intercalantes son sustancias químicas que se intercalan en la doble cadena de
ADN. Tenemos el caso de la acridina, que se intercala en la doble cadena de ADN, distorsiona su
estructura y cuando se va a producir su replicación la ADN polimerasa no puede leer bien el
molde. Por tanto, se pueden introducir fallos, que por lo general son de tipo Indel.
Imagen: en este caso se eliminan la citosina y la adenina que aparecen marcadas, de forma que
en el molde tenemos una deleción de dos pares de bases. También puede ocurrir que la
maquinaria de replicación añada nucleótidos, dando lugar a una inserción.
Esto quiere decir que cuando el agente intercalante se inserta en la doble hebra, la ADN
polimerasa no puede leer bien la cadena molde e introduce errores, que se traducen en:
• Que no se ponen todas las bases correctas, en cuyo caso aparecería una deleción.
• Que se ponen bases de más, en cuyo caso tendríamos inserciones.
Es algo similar a lo que ocurre cuando se produce un corte de doble cadena. En este caso la
maquinaria celular trata de volver a unir los dos extremos y como falta el molde introduce
errores. Aquí los errores se introducen porque el agente intercalante desacopla un poco la ADN
polimerasa de la hebra molde y le impide leer bien la cadena molde, por lo que introduce
nucleotidos o los elimina de forma aleatoria.
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Mutágenos químicos (Diapositiva 23)
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Cuando hablamos de otros compuestos, son agentes químicos que reaccionan directamente con
las bases nitrogenadas del ADN.
Son productos químicos que modifican la estructura de las bases nitrogenadas y generalmente
originan una base nitrogenada nueva. El resultado depende de la cadena molde:
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• Si en el molde teníamos una citosina emparejada con una guanina: la citosina se
transforma en uracilo, que es equivalente a una timina, por lo que se empareja con una
adenina. En este caso se produce una transición de C-G a T-A.
• Si en el molde había una adenina emparejada con una timina: la adenina se transforma
en hipoxantina, que es equivalente a una guanina. Por tanto, la hipoxantina se empareja
con una citosina, dando lugar a una transición A-T a G-C.
Por tanto, la aplicación de ácido nitroso lo que suele generar son dos tipos de mutaciones de
forma más frecuente:
• Transiciones C-G a T-A.
• Transiciones A-T a G-C.
Son mutaciones que se generan durante el cultivo in vitro. Muchas de las plantas que se cultivan
hoy en día son clones y no se reproducen por semillas. Algunos ejemplos: orquídea, vid
(reproducción por esquejes), patata (reproducción por tubérculos).
El hecho de mantener las plantas de forma continuada en cultivo in vitro hace que se generen
mutaciones de forma espontánea. En muchas de las líneas ornamentales, la variación de colores
que encontramos se debe a mutaciones generadas por la variación somaclonal (esos colores de
flores no se producen de forma natural en la naturaleza ni se han tratado con un agente químico
para inducir variación). El hecho de replicarlas constantemente en las condiciones de cultivo in
vitro provoca la aparición de mutaciones que pueden tener algun interes desde el punto de vista
comercial.
La ventaja de la variación somaclonal es que solo se seleccionan las mutaciones que son viables.
Cuando se aplican los agentes químicos o físicos, las líneas que se generan se deben crecer y un
porcentaje de ellas no serán viables. Sin embargo, con los cultivos in vitro, todas las plantas que
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sean capaces de desarrollarse bajo la presión de selección que se ejerce, van a ser capaces de
desarrollarse. Si hay alguna planta que tenga una mutación deletérea, no va a ser capaz de
aclimatarse y no se va a poder llevar a campo.
No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Reservados todos los derechos.
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