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Tema-4.
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Biotecnología Vegetal
3º Grado en Biotecnología
Facultad de Ciencias Experimentales
Reservados todos los derechos.

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BIOTECNOLOGÍAVEGETAL
TEMA 4.- MÉTODOS DE MICROPROPAGACIÓN

1. MICROPROPAGACIÓN
La micropropagación consiste en la propagación de plantas en un ambiente artificial controlado (luz,
temperatura, etc.), empleando un medio de cultivo in vitro adecuado. Lo que se persigue con esta técnica es
la propagación clonal de plantas, es decir, obtener un gran número de plantas (multiplicación) con
características similares a un explante o una planta madre. Algunas de sus características son:
• Se encuadra dentro de los métodos asexuales de regeneración, ya que no necesita la formación de un

embrión cigótico.
• Permite preservar los caracteres de interés de los genotipos (individuos) seleccionados. Por ejemplo,
al propagar una planta madre con las hojas moradas, obtenemos múltiples copias con el mismo
genotipo (hojas moradas).
• Permite producir plantas de calidad uniforme a escala comercial. Esto es debido a que se producen
muchas plantas con las mismas características.
• La tasa de multiplicación es ilimitada. Esto indica que, en teoría, a partir de la planta madre se podrían
obtener plantas de forma ilimitada. Sin embargo, no siempre es así, ya que llega un momento en que
los tejidos pierden la capacidad regenerativa.
Dependiendo de las características de la planta y del objetivo perseguido, se pueden utilizar diferentes vias de
regeneración para la micropropagación: brotación de yemas adventicias preexistentes, neoformación de

yemas o embriogénesis somática.
- A partir de una planta madre con unas características agronómicas u ornamentales de interés, se obtiene
un explante.
- El explante se cultiva in vitro y a partir de él se genera una o varias plantas. Dichas plantas se enraízan in
vitro o ex vitro para permitir la aclimatación.
- Tras el proceso, la planta o plantas obtenidas tienen características similares a la planta madre.
Características
La micropropagación tiene ciertas características que hacen que sea más ventajosa respecto a la propagación
vegetativa:
• Ocurre a microescala en tubos de ensayo o botes.

• Permite optimizar todas las condiciones ambientales (factores físicos, nutricionales y ambientales).
• Se realiza con los cultivos en condiciones de asepsia o esterilidad.
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 1
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• Esta técnica no sigue el patrón normal de desarrollo de una planta: formación del embrión,
germinación, desarrollo de la plántula, etc. sino que la planta se forma directamente a partir del
explante, no se pasa por el estado de embrión.
Las modificaciones realizadas a las técnicas de micropropagación están basadas en:
• Las propiedades innatas de las especies vegetales, ya que unas son más fáciles de propagar in vitro
que otras.
• Las tasas de multiplicación. Siempre se busca conseguir las máximas tasas de multiplicación.
• La calidad de las plantas regeneradas.
La micropropagación se usa de forma rutinaria para la multiplicación de orquídeas, otras plantas ornamentales
y especies frutales y forestales.
Ventajas y limitaciones
La micropropagación tiene ciertas ventajas con respecto a otras técnicas de propagación vegetativa:
• Alta proliferación en un estado precoz del desarrollo. La multiplicación para la obtención de cientos
de plantas se puede llevar a cabo a partir de plántulas muy pequeñas.
• Requiere de explantes pequeños para iniciar los cultivos.
• La tasa de multiplicación es muy rápida. Si se consiguen unas condiciones adecuadas, se puede
obtener un elevado número de plantas en poco tiempo.
• Permite la multiplicación vegetativa de muchas especies que no se han podido propagar mediante
otras técnicas vegetativas.
• Se realiza durante todo el año, ya que todo el proceso se realiza en cámaras de crecimiento del

laboratorio.
• Permite el saneamiento del material vegetal y su mantenimiento.
• Los cultivos in vitro pueden conservarse en frío durante un periodo de tiempo.
• Permite la adquisición de nuevos caracteres deseables. Cuando los cultivos in vitro se encuentran en
fase de callo pueden aparecer variantes, que son plantas con características diferentes a la planta
madre, de las cuales alguna puede resultar de interés.
Esta última característica también puede ser considerada como un factor limitante. Lo que se busca a nivel
comercial es obtener el mayor número de plantas con características similares a la planta madre, por lo que si
el número de variantes es muy alto el proceso no resulta rentable.
2. ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN
Etapa preparatoria
Consiste en la correcta elección y preparación del explante. Es una etapa muy importante porque incide
directamente sobre la calidad del explante y la respuesta de los cultivos frente a los problemas que afectan a
su establecimiento, siendo los más comunes: contaminación por microorganismos y oxidación de los
explantes.
Las plantas madre seleccionadas durante esta etapa van a influir directamente sobre la calidad de los
explantes. Por ello:
• Se seleccionan tan solo las plantas madre con caracteres agronómicos deseables.
• Hay que definir el tipo de explante. Para la inducción de organogénesis y morfogénesis son más
adecuados los explantes obtenidos a partir de órganos jóvenes o rejuvenecidos, ya que los órganos
con caracteres adultos son muy difíciles de propagar.
• Se deben recolectar explantes que se encuentren sometidos a bajos niveles de patógenos. Si la planta
a partir de la cual se inicia la micropropagación ha crecido en campo, lo mejor es realizar el cultivo en
primavera-verano, época en la que se produce el crecimiento activo y aparecen los brotes jóvenes,
que tienen menor cantidad de patógenos. Aún así, es mejor utilizar plantas que han crecido en
invernadero o en cámaras de crecimiento en las que se puede controlar las condiciones ambientales
y minimizar los problemas de contaminación.
• Realizando cambios en el fotoperiodo y la temperatura se puede incidir sobre los procesos
morfogenéticos: se induce la floración, superar la dormición de algunos tejidos (a bajas temperaturas),
inducir una mayor producción de bulbos, etc.
Iniciación del cultivo

Consiste en el establecimiento de cultivos asépticos, para ello:
- Se selecciona el explante adecuado. Se buscan los genotipos que inducen mayores porcentajes de
organogénesis.
- Se lleva a cabo el proceso de esterilización del explante.
- Hay que prevenir reacciones de hipersensibilidad de los explantes, que derivan en problemas de oxidación.
La elección del explante depende principalmente del modo de regeneración y multiplicación deseado, así
como del objetivo buscado. Los mejores explantes son:
• Yemas axilares y apicales (meristemos).

• Órganos como estolones, rizomas, bulbos y protocormos (orquídeas).
Otra forma de conseguir explantes es mediante la regeneración de novo de ápices o embriogénesis somática.
Para esta regeneración se pueden usar fragmentos de raíz, tallo, hoja, nucela, etc.
La esterilización o descontaminación puede ser:
• Directa: se realiza cuando los explantes son duros y capaces de soportar el proceso de esterilización.

Se realiza sobre todo en semillas, ya que se encuentran protegidas por la cubierta seminal y el tejido
no se va a ver dañado cuando son sumergidas en el líquido desinfectante.
• Superficial y disección: se realiza cuando los explantes son blandos. Cuando se va a hacer un cultivo
de anteras, lo que se hace es esterilizar el botón floral, que posteriormente se disecciona en el interior
de una cámara de flujo laminar para extraer las anteras.
Las etapas de descontaminación dependen de la naturaleza del material vegetal y del tipo de explante, por lo
que no siempre son las mismas:
i. Limpieza. Se realiza en tejidos muy sucios, sobre todo en tubérculos o rizomas para eliminar los restos
de suelo.
ii. Eliminación del tejido muerto o superfluo.
iii. Lavado con agitación en agua. Permite lavar la superficie del tejido.
iv. Tratamiento con desinfectantes.
v. Aclarado con agua estéril. Se hace para eliminar todos los restos del desinfectante.
El tratamiento con desinfectantes y aclarado con agua estéril son los dos únicos tratamientos que se realizan
en todos los explantes. Los otros tres tan solo se emplean cuando el tejido vegetal está muy sucio.
Los desinfectantes más empleados son:
• Ion hipoclorito (o ácido hipoclórico): se usan soluciones de hipoclorito sódico (NaOCl) o hipoclorito
cálcico (Ca(OCl)2) a diferentes concentraciones dependiendo del material vegetal y la duración del
tratamiento. Dichas concentraciones se sitúan habitualmente entre 0,25-2% o 5-20% cuando se usa
lejía, en la que el hipoclorito se encuentra más diluido. El ion hipoclorito (OCl-) junto con las sales de
hipoclorito da lugar al ácido hipoclórico (HOCl), que tiene acción bactericida debido a su capacidad
oxidante.
• Alcoholes simples: el más usado es el etanol por ser el menos dañino, pero también se usan otros
como el metanol (es tóxico y causa problemas en el nervio óptico) o el isopropanol. Tienen acción
germicida, pero además permiten eliminar las grasas superficiales de los tejidos vegetales. Por esta
razón, a veces se realizan tratamientos con alcohol al 70-95% (durante 30-300 segundos) antes de la
desinfección con hipoclorito, para eliminar las grasas superficiales y permitir una mejor acción del
mismo.
• Iones pesados: cuando los explantes están muy sucios y presentan problemas de contaminación se
emplean iones pesados como el cloruro mercúrico o los iones plata. El problema es que generan
residuos muy tóxicos, por lo que solo se emplean cuando es estrictamente necesario.
• Agentes oxidantes: los agentes oxidantes tienen una capacidad similar a la del ion hipoclorito. Los más
empleados son el peróxido de hidrógeno y el permanganato potásico.
• Preparaciones antisépticas: a nivel comercial existen preparaciones antisépticas para la desinfección
de tejidos. Suelen ser marcas registradas como Desogerme, Sevezan®, Centrimida® o Zephiran®.
• Antibióticos: para la desinfección también se pueden emplear tratamientos con antibióticos durante
un periodo de tiempo determinado. Se usa en tejidos que tras varias desinfecciones sigan presentando
crecimiento de colonias. Los antibióticos más usados son la Estreptomicina, Penicilina y Rifampicina.
- Para que se produzca una adecuada penetración del desinfectante los explantes se sumergen primero en
una solución de etanol al 70% durante 1 minuto.
- A continuación, se adiciona algún detergente (Tritón X-100, 7X®, Tween 80®, Teepol®, Lissapol F®…) a la
solución desinfectante para eliminar la tensión superficial de los tejidos. De esta forma, la gota de
desinfectante va a mojar mejor el tejido y se va a producir una desinfección más correcta.
- Tras esto los explantes se mantienen en la solución desinfectante durante un periodo de tiempo.
- Se elimina el desinfectante y se realizan varios aclarados con agua destilada estéril.
- Finalmente se traspasan los tejidos a una superficie estéril y se hace el cultivo.
Multiplicación
La multiplicación de brotes se logra mediante: regeneración de callos, inducción de yemas adventicias (neo
formación de meristemos) y ramificación axilar forzada (crecimiento a partir de meristemos ya formados).
➢ Regeneración de callos. Entre las principales ventajas destacan: permite usar cualquier tipo de
explante, la regeneración se puede conseguir mediante organogénesis o embriogénesis somática (a
partir del callo se puede inducir la formación de órganos, meristemos o embriones) y permite producir
un gran número de plantas. También posee una serie de desventajas: no existen protocolos eficientes
para la mayoría de especies, no es fácil la sincronización de cultivos embriogénicos y tiene mayor
porcentaje de variabilidad que otros protocolos. Se usa para la micropropagación de Palmeras, Citrus,
mango, anacardo, etc.
➢ Formación de yemas adventicias. Ventajas: se produce un incremento en el número de ápices por
propágulo, permite el uso de pequeños explantes a partir de los cuales se forman yemas in vitro y se
consigue la producción de yemas adventicias en un gran número de especies. En cuanto a las
desventajas: existe variabilidad, por lo que en muchos casos se generan plantas diferentes a la planta
madre y a veces se producen mutaciones en las yemas, lo que da lugar a las yemas quiméricas (yemas
con dos informaciones genéticas diferentes). Es la forma de propagación utilizada a nivel comercial
para plantas ornamentales como Begonia, Saintpaulia, mora, frambuesa, Liliáceas, Iridáceas, etc.
➢ Ramificación axilar forzada. Tiene como ventajas: poca o nula variabilidad (los meristemos formados
son similares a la planta madre), una propagación intensiva in vitro que se consigue mediante la
adición de citoquininas y que la presencia de citoquininas induce el desarrollo directo de yemas
axilares en ápices (no se pasa por el estadio de callo). Entre las desventajas destacan: se trata de un
proceso de propagación más lento, está limitado por el número de explantes (solo valen aquellos que
tengan yemas axilares o apicales preexistentes) y como se usan altas concentraciones de citoquininas
a veces aparecen cambios epigenéticos (estos cambios están relacionados con la habituación de los
tejidos a las hormonas). A pesar de estas desventajas, es la forma en la que se realiza la
micropropagación en monocotiledóneas (Alstomeria, Asparragus, orquídeas, etc.) y dicotiledóneas,
así como en herbáceas y leñosas.

Para llevar a cabo la multiplicación primero hay que preparar el explante, que previamente ha sido
desinfectado. Dicha preparación consiste en recortar, aislar o separar los explantes. Una vez preparados se
inoculan en medios sólidos considerando su polaridad. Si el cultivo ha funcionado y se ha establecido
correctamente se observa el crecimiento del callo o el brote de la yema. Si por el contrario, tras un periodo de
10-15 días el cultivo no crece es porque no responde a las condiciones impuestas y se debe iniciar de nuevo
bajo otras condiciones.
Durante la multiplicación se hacen replicados o subcultivos que consiste en cambiar los explantes desde el
medio de cultivo utilizado hasta un medio nuevo. Normalmente el replicado se hace cuando:
• El medio nutritivo se ha agotado y los explantes comienzan a mostrar síntomas de deficiencias

(amarilleo…).
• El medio se deshidrata debido a la falta de humedad de las cámaras de crecimiento, lo que provoca
un aumento de la concentración de sales y azúcares, resultando tóxico para el explante.
• Hay falta de espacio, ya que el explante ha crecido tanto que no cabe en el recipiente.
• Se quiere cambiar el patrón de desarrollo. Por ejemplo, al iniciar el cultivo embriogénico se usa un
medio con muchas auxinas, pero luego se cambia a un medio sin auxinas para que se produzca el
desarrollo de los embriones.
• El agar se ha coloreado o licuado debido a un descenso del pH.
El siguiente paso del proceso de multiplicación es la clonación, que consiste en
obtener copias de las plantas in vitro. Se pone la plántula en un medio y se deja
crecer. A partir de ella se obtienen diferentes partes que se vuelven a plantar
en un medio de cultivo. De esta forma, partiendo de una planta madre se
obtienen varios clones.
Durante todo el proceso de multiplicación se aplican unas técnicas asépticas

de aislamiento y transferencia:
➢ Cabinas de flujo laminar: se encienden unos 20 minutos antes de

empezar a trabajar en ellas, para que el aire se encuentre
completamente esterilizado. Si la cabina dispone de lámpara de luz
ultravioleta también es conveniente encenderla antes de trabajar para
que se esterilice la superficie de trabajo. Además, hay que desinfectar
la superficie de trabajo con isopropanol al 70%, etanol al 70% o una
solución de hipoclorito.
➢ Instrumental y material de vidrio: todo el instrumental y material de vidrio con el que se trabaja debe
ser esterilizado continuamente. Las pinzas y el bisturí se introducen en etanol y se flamean. Todo el
material se autoclava a 121ºC durante 20-30 minutos. En algunos casos se realiza una esterilización
con calor seco (180ºC durante 8-10 horas en una estufa), sobre todo para el material de vidrio.
➢ Manejo del material vegetal: el material vegetal también debe ser esterilizado, pero mediante
técnicas diferentes como las que se mencionaron en la etapa de iniciación del cultivo. Además, el
manejo del material siempre debe hacerse sobre una superficie de trabajo estéril como papel de filtro,
placa Petri, azulejo, etc.

Elongación de ápices y enraizamiento
Si la forma de inducción de morfogénesis es mediante embriogénesis somática, sería la etapa de maduración
y germinación. Esta fase es necesaria para permitir el adecuado desarrollo de las plantas generadas durante
todo el proceso de micropropagación.
La formación de nuevos ápices se produce en medios con presencia continua de citoquininas. Esto permite el
desarrollo de un gran número de ápices pero de tamaño muy pequeño, lo que hace que sean muy difíciles de
manejar y aislar. Por tanto, hay que realizar una etapa previa de elongación de los ápices que consiste en
cambiar los explantes a un medio de elongación con concentración baja o nula de citoquininas. Si el material
vegetal lo permite, se puede hacer con ápices aislados, pero normalmente son tan pequeños y se encuentran
tan pegados que lo que se hace es aislarlos en grupos o clusters y una vez elongados se separan.
Cuando se tienen los ápices elongados el siguiente paso es el enraizamiento. El enraizamiento puede ser:
➢ In vitro: es el más utilizado porque proporciona las mejores tasas de producción de raíces y de
recuperación de plantas. Se hace una transferencia de ápices aislados con un tamaño aproximado de
2 cm hacia diferentes sustratos como el agar (medio sólido gelificado), la perlita o la vermiculita (sirven
de soporte en medios líquidos). Los medios que se usan para el enraizamiento son diferentes a los de
inducción de callos y brotes, ya que tienen bajo contenido en sales (1/4 o ½ del contenido en sales
presente en los medios de propagación) y en sacarosa (se usa 1-2% en lugar del 2-4% que contienen
los medios de organogénesis). Estos medios de formación de raíces son suplementados con auxinas,
sobre todo IBA (ácido indolbutírico), en concentraciones relativamente altas (1-10 µM) durante pocas
horas o en concentraciones más bajas (0,1-1 µM) durante 3-7 días. Si se emplean concentraciones de
auxina demasiado elevadas aparece un problema de formación de callo en la base del ápice, es decir,
que en lugar de raíces se forma un callo.
➢ Ex vitro: permite tanto el enraizamiento como la aclimatación de la planta. Los ápices aislados se
transfieren a macetas con diferentes sustratos bien esterilizados como la mezcla de tierra y arena. La
principal ventaja de este sistema es que no se forma callo en la base, por lo que las raíces formadas
tienen una conexión vascular continua. El problema es que al pasar el ápice de un sistema in vitro a
uno ex vitro se le provoca un gran estrés por deshidratación. Por esta razón, para que la supervivencia
no disminuya se deben usar condiciones de invernadero o cámaras de crecimiento en las que haya
una alta humedad relativa en el ambiente.
Trasplante y aclimatación
Las plantas enraizadas ex vitro ya han superado esta fase, pero las
que han sido enraizadas in vitro si que se deben trasplantar y
aclimatar. Es una fase bastante crítica, ya que las hojas de una planta
producida in vitro son frecuentemente más finas, blandas y

fotosintéticamente poco activas, y en consecuencia están mal
adaptadas a las condiciones in vivo.
En la imagen podemos ver una comparación de las hojas de una

misma especie (Cattleya lueddemanniana) cultivada in vivo e in vitro.
Los principales problemas de las plantas crecidas in vitro son:
➢ Tienen un escaso control de la pérdida de agua. Esto se debe a que han crecido en recipientes
cerrados en condiciones de alta humedad relativa, por tanto:
o Su cutícula se encuentra escasamente desarrollada. Debido a esta escasa disposición de ceras
hay una alta transpiración cuticular, lo que provoca una gran pérdida de agua en la planta.
o Los estomas no están operativos. Estas plantas poseen estomas anormalmente grandes y que
se encuentran siempre abiertos. No se cierran ni siquiera cuando se añade ABA (ácido
abscísico) porque no responden a las condiciones ambientales.
o Poseen una pobre conexión vascular. El sistema vascular de estas plantas es incipiente y no se
encuentra muy desarrollado. Por tanto, no son capaces de absorber agua con la rapidez
suficiente para reponer la que se pierde a través de la cutícula y los estomas. Esto hace que la
planta se deshidrate con mucha rapidez.
➢ Presentan una nutrición heterotrófica. Se han adaptado a este tipo de nutrición porque:
o Las células del parénquima en empalizada son más pequeñas y menos abundantes.
o Existe una escasa diferenciación del mesófilo, prácticamente todo el parénquima es
esponjoso.
o Sus cloroplastos se encuentran poco desarrollados: poseen poca clorofila y los grana están
desorganizados.
El principio que rige la aclimatación de las plantas in vitro es hacerlas crecer en condiciones autótrofas de baja
humedad y alta luminosidad. El trasplante se realiza de la siguiente manera:
- Las plantas se sacan del medio in vitro (con agar) en el que han crecido.
- Las raíces se lavan apara eliminar todos los restos de medio.
- Se plantan individualmente en macetas que contienen un sustrato adecuado.
- Se riegan con agua estéril o alguna solución nutritiva suave.
- Se cubren con vasos o bolsas de plástico para mantener una alta humedad relativa.
Lo que se persigue con el trasplante es una aclimatación gradual y, para ello:
• Se disminuye de forma progresiva la humedad relativa.

• Se incrementa de forma progresiva la intensidad luminosa. Con esto se consigue:
o La formación de la cutícula, ya que la tenían poco desarrollada.
o Desarrollo y organización de los parénquimas en las hojas.
o Activar los estomas, que adquieren la capacidad de cerrarse y abrirse.
o Inducir la conexión vascular con el sistema radicular.
Se necesitan entre 4 y 6 semanas para que las plantas in vitro se endurezcan, de modo que puedan sobrevivir
en condiciones normales. Inicialmente las plantas se mantienen a la sombra o con poca luz durante 15 o 20
días. Tras esto, se quita la cobertura de forma progresiva (durante 30 minutos o 1 hora al principio,
aumentando lentamente el tiempo de exposición).
3. TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN
Las principales técnicas de micropropagación son:
➢ Cultivo de ápices y yemas axilares: es el principal sistema para la micropropagación vegetativa de

plantas. Lo que se consigue con este tipo de cultivo, al cual se añaden altas concentraciones de
citoquininas, es una gran multiplicación o un gran número de plantas similares a la planta madre tan
solo utilizando un ápice o yema axilar.

Como los ápices y yemas ya se encuentran preformados, la aplicación de grandes cantidades de
citoquinina induce una ramificación axilar forzada. Este proceso se repite numerosas veces para
multiplicar la planta de forma intensiva. Finalmente, cada una de las plántulas se somete al proceso
de enraizamiento y aclimatación. Es una técnica más fácil de realizar en plantas con ápices largos, pero
también se puede aplicar a plantas que crecen en forma de roseta.
Como en ocasiones es difícil de aislar un solo ápice o yema, se cogen agrupaciones de yemas y se
someten al tratamiento con citoquininas para inducir la brotación forzada. Los ápices que se forman
en la planta en forma de roseta son muy cortos, por lo que deben pasar por el estadio de elongación.
Tras esto son enraizados.
Es una técnica sencilla en la que existen pocos problemas con la variabilidad, ya que las plantas
obtenidas son similares a la planta madre.
➢ Cultivo de segmentos nodales: consiste en el aislamiento de una yema con su porción de tallo. Cada
una de las yemas presentes en las axilas de las hojas es idéntica a la yema apical y pueden aislarse,
cultivarse y multiplicarse todas las veces que sea necesario. Esta técnica solo se puede aplicar a las
plantas con ápices elongados, no se puede usar con las plantas que crecen en roseta porque no poseen
nudos. Se puede hacer de dos formas:
▪ Forma simple: se quitan las hojas a la planta y se separa cada nudo de forma individual. Cada
uno de los nudos se coloca en un medio para promover el crecimiento de la yema axilar. A
partir de las nuevas plantas obtenidas se repite el procedimiento, de forma que se consigue
la multiplicación durante el tiempo necesario. En la última etapa se enraízan para conseguir
ápices individuales enraizados.
▪ Forma múltiple: se quitan todas las hojas a la planta y sin separar los nudos se siembra el tallo
de forma horizontal. A partir de cada una de las yemas va a crecer un ápice, que es aislado del
resto. Con estos nuevos ápices se repite el proceso o se enraízan.

Este tipo de cultivos es adecuado para muchas plantas, pero en las leñosas provoca problemas de
dormición en las yemas axilares. Para superar esta dormición y poder utilizar los segmentos nodales
en el proceso de multiplicación es necesario pretratar los ápices:
• Tratamiento con bajas temperaturas (0-5ºC). Se simula el periodo de frio que pasan las leñosas
durante el invierno, para posteriormente superar la dormición y brotar en primavera.
• Se somete a las yemas a periodo de día largo (16 horas de luz).
• A veces se someten de forma simultánea a bajas temperaturas y día largo.
• En otras ocasiones se realizan tratamientos con giberelinas y citoquininas para inducir la salida
de la dormición.
➢ Cultivo de meristemos: los cultivos de meristemos se han utilizado principalmente para prevenir y
evitar infecciones en plantas cultivadas. Es una técnica iniciada por Morel y Martin en el año 1952. Se
verá en otros temas porque tiene una aplicación determinada.
➢ Cultivo de callos: consiste en inducir la formación de un tejido tumoral más o menos organizado en
las heridas de los explantes. Los callos generados pueden tener diferente morfología: blancos o
coloreados, friables (con células que se separan fácilmente) o compactos, morfogenéticos
(formadores de raíces o ápices) o no morfogenéticos (formadores de embriones). A partir de estos
callos se consigue la micropropagación de las plantas porque actúan como biofactorías.
Para inducir la formación del callo (tejido tumoral desorganizado que aparece por la división celular
intensiva) a partir de las heridas del explante es necesario aplicar distintos reguladores de crecimiento.
Los reguladores de crecimiento necesarios dependen del genotipo y del tipo de tejido empleado en el
cultivo, ya que cada uno va a tener un contenido endógeno de fitohormonas diferente. Por esta razón,
las especies se dividen en tres grupos:
▪ Las que necesitan tan solo la adición de auxinas para que se induzca la formación de callo.
Ocurre en la mayoría de monocotiledóneas.
▪ La mayoría de las plantas requieren una cantidad determinada de auxinas y citoquininas para
inducir la formación del callo.
▪ Otras especies solo necesitan citoquininas, pero son la minoría.
Una vez que se ha formado el callo, este se aisla y se subcultiva en un medio nuevo sin la concentración
de hormonas para la inducción. El siguiente paso es la regeneración de órganos, que se puede hacer
en un medio sólido o líquido, al que se añaden diferentes hormonas dependiendo del objetivo de
regeneración.
▪ Medio sólido: generalmente los callos se pasan a un medio sólido para inducir la formación
de brotes. El ápice o brote se aísla, se enraiza y de esta forma se obtiene una planta.
▪ Medio líquido: en este tipo de medios se induce la disgregación de un callo de gran tamaño a
varios callos de menor tamaño. Estos callos se pueden cultivar en medio sólido para inducir la
regeneración de órganos o se mantienen en medio líquido para inducir la embriogénesis
(formación de embriones).

Por tanto, un callo es un tejido tumoral desorganizado que permite la formación de nuevas plantas,
bien por la formación de ápices (brotes) o por la formación de embriones.
➢ Cultivo de células aisladas: el cultivo de células aisladas se usa con aplicaciones concretas:
▪ Producción de metabolitos secundarios cuando el cultivo se realiza en biorreactores.
▪ Propagación vegetativa mediante la inducción de formación de embriones somáticos.
▪ Obtención de protoplastos.
▪ Obtencion de plantas libres de virus a partir de células meristemáticas aisladas.
▪ Obtención de plantas biotransformadas.
Esta técnica se inicia con el cultivo de callos jóvenes en crecimiento activo (a veces se usan explantes).
Se introduce un callo con un peso de 0,5-1 g en 100 mL de medio líquido basal que contiene sacarosa
y auxinas, siendo la más común 2,4-D a una concentración de 1 mg/mL. Los matraces llenos a un 20%
de su volumen total se mantienen en agitación (100-120 rpm) para que los callos se disgreguen, dando
lugar a: células aisladas, agregados celulares, residuos del callo y restos celulares.
La cantidad de células aisladas obtenidas va a ser mayor o menor dependiendo del tipo de callo a partir
del que se inicia el cultivo:
▪ Callos compactos: estos callos apenas se disgregan, por lo que prácticamente no se obtienen
células aisladas.
▪ Callos friables: la friabilidad es la capacidad del tejido para que sus células se separen tras la
división celular. Cuando estos callos se ponen en agitación las células se van separando poco
a poco, por lo que se obtiene un alto porcentaje de células aisladas frente al resto de
componentes del cultivo líquido.
Tras la disgregación se realiza un filtrado que permite separar los restos celulares o de callo de las
células y los pequeños agregados celulares, a partir de los cuales se inicia el cultivo de células aisladas.
Antes de iniciar el cultivo se debe determinar la viabilidad celular de las células obtenidas mediante
disgregación. Para ello, se trata una muestra de las células con un reactivo de tetrazolio que colorea
las células viables de rojo. Esto permite cuantificar espectrofotométricamente el número de células
viables en ese extracto.
Además, para iniciar el cultivo también debe tener una densidad óptima (0,5-2,5·105 células/mL). Si
no se alcanza la densidad mínima no se va a inducir el crecimiento y la división celular, por lo que no
van a regenerar las células cultivadas in vitro. Para determinar la densidad celular:
▪ Hay aparatos automáticos como los quimiostatos o los turbidostatos.
▪ Se hace una separación con trióxido de cromo y se contabiliza el número de células con un
contador.
Si tras determinar la densidad celular hay mayor densidad se diluye la solución hasta conseguir la
densidad óptima, mientras que si la densidad celular es menor se debe concentrar el medio hasta
alcanzar el óptimo. Cuando se ha conseguido la densidad óptima se hace el cultivo y varios subcultivos
para la obtención de microcallos, plántulas, embriones, etc. dependiendo del objetivo de la
morfogénesis.

4. PROBLEMAS ASOCIADOS A LA MICROPROPAGACIÓN
Hay cinco problemas principales asociados a la micropropagación que hacen que el cultivo tenga menos
éxito:
➢ Contaminación: hay varios tipos de contaminantes:

▪ Los principales contaminantes son las bacterias, que pueden ser de numerosos géneros:
Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter, Micrococus,
Pseudomonas, Xanthomonas, etc.
▪ Las levaduras contaminan la superficie externa de las plantas. Se detectan porque cuando se
abre el recipiente de cultivo hay un fuerte olor a fermentación.
▪ Los hongos son muy comunes en el suelo, por lo que aparecen de forma muy frecuente como
contaminación en los cultivos. Los patógenos de plantas se encuadran dentro de los siguientes
géneros: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsporium, Phialophora, etc.
Existen tres tipos de contaminación:
▪ Contaminación que ocurre durante el establecimiento de cultivo: ocurre debido a una
esterilización inefectiva de la superficie del material vegetal.
▪ Contaminación que ocurre después del establecimiento: ocurre por la introducción de
microorganismos durante el manejo del subcultivo, al trabajar en condiciones de no
esterilidad (pinzas o superficie de trabajo mal esterilizada). También se puede deber a
microorganismos endógenos ocultos cuya presencia no se detecta hasta que no se inicia el
cultivo.
▪ Contaminación crónica o latente: los microorganismos endógenos no afectan a todas las
plantas, si el cultivo se compone de 100 puede que solo afecte a 10 (tan solo se pierde un 10%
de las plantas). Sin embargo, cuando la contaminación es crónica, se pierde todo el lote de
plantas. Además, es la más difícil de eliminar porque está causada por bacterias endógenas
(presentes en el interior del material vegetal) y que crecen de forma muy lenta. Por tanto,
parece que el cultivo se ha manejado bien y que está creciendo de forma adecuada, pero tras
20 días o un mes de cultivo aparece la contaminación. Debido a esto es muy importante
detectar y catalogar el material vegetal de partida para comprobar que está totalmente sano,
ya que si aparece la contaminación crónica se pierde por completo el cultivo y toda la inversión
realizada.
Para detectar la presencia de los contaminantes persistentes, antes de iniciar el cultivo se hacen
distintos tratamientos:
▪ Para detectar los escapes de la descontaminación inicial Korhonen y colaboradores en el año
1988 propusieron un modelo matemático que indicaba que si había algún tipo de
contaminación, debería aparecer durante los dos primeros ciclos de micropropagación. Por
ello, lo que se hacía era cultivar los explantes durante una o dos semanas en distintos tipos de
medios que inducen el crecimiento de los microorganismos: medio simple con sacarosa,
medio suplementado con compuestos orgánicos y medio con glucosa. De esta forma, si
hubiera alguna contaminación en los tejidos, debería aparecer antes de iniciar la
micropropagación. En cualquier caso, lo importante es manipular de forma cuidadosa los
tejidos vegetales.
▪ Para la detección de los contaminantes crípticos (crónicos) se coloca la superficie de corte del
material vegetal en medios bacteriológicos o se hacen macerados con los tejidos y se colocan
en este tipo de medios. Los medios bacteriológicos son medios especializados para favorecer
el crecimiento de las bacterias, por lo que con ellos se pretende ver si crece algún tipo de
bacteria si las hubiera.
➢ Hiperhidratación o vitrificación: es un desorden fisiológico por el que los tejidos aparecen llenos de
agua y con un aspecto cristalino, por ello también se denomina vitrificación. Los tejidos con
hiperhidratación presentan anomalías morfológicas, anatómicas y metabólicas, que impiden su

adecuado desarrollo y en los peores casos provocan su muerte. Entre estas anomalías destacan:
▪ Baja diferenciación del mesófilo. El parénquima en empalizada es escaso o no se desarrolla.
▪ Cloroplastos poco diferenciados. Provoca deficiencias de clorofilas que hacen que los
explantes amarilleen.
▪ Lignificación escasa. Los vasos y las traqueidas desaparecen (desaparece el sistema vascular),
apareciendo formas anormales.
▪ Disminución de celulasa en las células. Esto provoca un cambio en las propiedades físicas de
la pared celular.
▪ Son tejidos con bajo contenido en calcio, inositol y proteínas solubles. Sin embargo, tienen
altos niveles de potasio, fósforo, glucosa y sacarosa.
La presencia y grado de vitrificación depende:
▪ De la especie o cultivar. Algunas especie son más sensibles que otras.
▪ Del exceso de humedad en el recipiente. A humedades relativas altas, aparecen más
problemas de vitrificación. La vitrificación es más común en medios líquidos que en medios
sólidos y dentro de los medios sólidos, cuanto menor sea el contenido en agar.
▪ De los altos niveles de citoquininas. Es un problema que aparece cuando hay altos niveles de
ciertos tipos de citoquininas.
▪ Las altas temperaturas y/o baja irradiancia lumínica.
▪ Una esterilización demasiado intensiva. Cuando el material vegetal se ha tratado demasiado
con desinfectantes se vuelve más sensible y sufre más problemas de vitrificación.
▪ Un material muy joven. Si el material vegetal usado es demasiado joven se incrementan los
problemas de vitrificación.
Cuando la hiperhidratación impide la propagación de determinadas plantas (debido a altos
porcentajes de vitrificación) se busca disminuir la humedad relativa del recipiente mediante algún
sistema que aumente la evaporación y pérdida de agua hacia el exterior.
Dillen y Buysens trabajaban con una especie del género Gypsophila que era imposible de regenerar in
vitro debido a las altas tasas de vitrificación. Por ello, en 1989 idearon un sistema que consistía en
agujerear las tapas de los recipientes. Para impedir la entrada de esporas o cualquier otro tipo de
contaminante, a cada uno de los agujeros le ponían un filtro.
En las etapas iniciales de cultivo los agujeros se tapaban con cinta adhesiva para impedir una alta tasa
de pérdida de agua por evaporación. Aún así, la tasa de pérdida de agua era superior a la de los
recipientes sin agujerear: 35,8 mg agua/día frente a 10,3 mg agua/día.
Entre los 2 y 14 días de cultivo la cinta adhesiva se quitaba dejando los agujeros abiertos. Esto permitía
pasar de una tasa de pérdida de agua de 35,8 mg agua/día a 178,9 mg agua/día. Sin embargo, en el
recipiente sin agujerear la tasa de pérdida de agua se mantenía estable durante todo el cultivo.
A los 14 días los agujeros se volvían a tapar para evitar la deshidratación de los explantes, por lo que
la tasa de pérdida de agua volvía a ser parecida a la inicial. Usando este sistema tan sencillo
consiguieron aumentar de forma considerable las tasas de producción de plantas normales (no
vitrificadas).

➢ Oscurecimiento o bronceado: es otro de los problemas que aparece asociado a los cultivos. Se puede
producir:
▪ Tan solo en el medio: como consecuencia de la liberación de exudados radicales
▪ En los propios tejidos: para obtener los explantes es necesario realizar cortes que originan la
senescencia de algunas células. A partir de estas células se producen determinados pigmentos
de color rojo o marrón, que se van extendiendo al resto del explante cuando las condiciones
ambientales de mantenimiento no son las adecuadas.
Es un problema que se debe solucionar, ya que la mayoría de pigmentos oscuros son inhibidores del
crecimiento y cuando el tejido se oscurece por completo acaba muriendo. Esto impide la propagación
de tejidos. Hay varios factores que afectan al oscurecimiento:
▪ Efecto del genotipo: el oscurecimiento depende en gran medida del genotipo. Hay diferencias
entre las especies de un mismo género e incluso entre variedades o cultivares de una misma
especie. El efecto del genotipo se debe a que hay algunos en los que se acumulan mayores
concentraciones de taninos y otros hidroxifenoles, que son las sustancias que se liberan al
medio provocando el oscurecimiento. Estos problemas afectan sobre todo a las leñosas,
donde existen muchos géneros con altos contenidos en taninos.
▪ Fuente de explantes: el oscurecimiento también se ve afectado por el tipo de explantes que
se utilicen. Los tejidos juveniles son, por lo general, menos propensos a oscurecerse tras la
escisión que los tejidos maduros o más viejos. Por eso, siempre es mejor usar tejidos juveniles
y, si solo disponemos de tejidos maduros, se les debe realizar un tratamiento de
rejuvenecimiento.
▪ Estacionalidad: el momento del año en el que se obtenga el material vegetal también afecta
a esta cuestión. En plantas que crecen en el hemisferio norte los problemas de oscurecimiento
se hacen más notables cuando los explantes se obtienen en primavera, que cuando se
obtienen en julio o agosto.
El oscurecimiento de los tejidos ocurre en realidad debido a la acción de enzimas oxidasas, que oxidan
los compuestos mencionados anteriormente. Estas enzimas son de muchos tipos, pero tienen como
característica común que contienen cobre.
Hay una serie de recomendaciones para disminuir la incidencia del oscurecimiento en los cultivos:
▪ Como lo que estimula la producción de taninos es la herida, se debe minimizar el daño a la
hora de obtener el explante.
▪ Para eliminar los compuestos fenólicos secretados por las heridas, los tejidos vegetales se
repican de forma frecuente, es decir, se cambian de medio cada 4-5 días. Incluso se
recomienda hacer un primer cultivo en medio líquido para que se diluyan todos los
compuestos fenólicos y, tras un periodo de tiempo, pasar los explantes al medio sólido.
▪ Utilizar compuestos absorbentes en la preparación de los medios de cultivo. Sobre todo se
añade carbón activo, pero se debe hacer con precaución, ya que no solo absorbe los
compuestos inhibidores, sino que también absorbe reguladores del crecimiento y otros
componentes orgánicos del medio provocando deficiencias.
▪ Modificar los factores físicos medioambientales. Por ejemplo, cuando se mantienen los
explantes a una baja temperatura e intensidad luminosa antes de realizar el cultivo, se
disminuye la producción de los compuestos fenólicos.
▪ Modificar el potencial de oxido-reducción del tejido. Para ello se añaden antioxidantes y
agentes reductores al medio.
▪ Reducir las actividades oxidasas, ya que la oxidación de los compuestos fenólicos es lo que
provoca el oscurecimiento. Como los iones (sobre todo el cobre) son fundamentales para la
acción de las oxidasas, lo que se hace es disminuir su concentración en los medios o eliminarlo

durante cortos periodos de tiempo. El cobre no se puede eliminar por completo, ya que es
esencial para el crecimiento de los cultivos.
▪ Como la composición del medio y los reguladores también afecta al oscurecimiento, se
recomienda alterar su composición. Sobre todo se debe disminuir la concentración de
reguladores del crecimiento y sales (menos sales, menos oscurecimiento), por lo que se usan
medios salinos diluidos.
➢ Descenso del vigor: los cultivos disminuyen y cesan su crecimiento y proliferación después de un
periodo de tiempo. Este descenso del vigor se encuentra asociado a:
▪ La producción de compuestos fenólicos, que se van acumulando poco a poco en los
recipientes.
▪ Problemas de vitrescencia o vitrificación de los tejidos.
▪ La habituación. Los tejidos dejan de responder a los compuestos orgánicos que se añaden al
medio, por lo que no pueden mantener su crecimiento.
▪ Que el tejido utilizado para iniciar el cultivo no se encontraba lo suficientemente rejuvenecido.
La presencia de determinadas características adultas le impiden continuar con su crecimiento.
▪ Una concentración inadecuada de los reguladores del crecimiento añadidos al medio.
Para evitar este problema se debe cambiar los explantes a un medio nuevo con la concentración de
reguadores del crecimiento adecuada, modificar la humedad relativa o iniciar el cultivo a partir de otro
tipo de material vegetal.
➢ Necrosis: consiste en la muerte del explante o parte de él. La necrosis apical es la más frecuente, que
aparece sobre todo en cultivos de ápices de plantas leñosas. Las causas no se conocen por completo,
pero ha sido asociada con:
▪ La deficiencia de calcio en los ápices porque no ha sido absorbido o porque su movimiento
por el explante no es adecuado. El hierro también es un bastante inmóvil por lo que su
absorción y movimiento por la planta ocurre con dificultad. Como el movimiento de los iones
es debido a la transpiración, si la humedad relativa en el recipiente es alta, no se va a producir.
▪ La deficiencia de hormonas naturales en algunos tejidos. Al pasar los tejidos de un medio rico
en citoquininas a uno sin esta hormona, si no tienen citoquininas endógenas aparece la
necrosis apical.
▪ Una pérdida rápida de agua del medio.
▪ La alta concentración de compuestos de carbono volátiles (etileno, metano y otros gases).

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Facultad de Ciencias Experimentales

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TEMA 4.- MÉTODOS DE MICROPROPAGACIÓN

• Se encuadra dentro de los métodos asexuales de regeneración, ya que no necesita la formación de un

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• Ocurre a microescala en tubos de ensayo o botes.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 1

Las modificaciones realizadas a las técnicas de micropropagación están basadas en:

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 2

Iniciación del cultivo

• Yemas axilares y apicales (meristemos).

La esterilización o descontaminación puede ser:

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Los desinfectantes más empleados son:

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 3

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 4

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• El medio nutritivo se ha agotado y los explantes comienzan a mostrar síntomas de deficiencias

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 5

Durante todo el proceso de multiplicación se aplican unas técnicas asépticas

➢ Cabinas de flujo laminar: se encienden unos 20 minutos antes de

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 6

Reservados todos los derechos.

En la imagen podemos ver una comparación de las hojas de una

Los principales problemas de las plantas crecidas in vitro son:

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 7

Lo que se persigue con el trasplante es una aclimatación gradual y, para ello:

• Se disminuye de forma progresiva la humedad relativa.

➢ Cultivo de ápices y yemas axilares: es el principal sistema para la micropropagación vegetativa de

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 8

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 9

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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 10

Reservados todos los derechos.

➢ Contaminación: hay varios tipos de contaminantes:

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Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 12

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 13

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 14

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 4: métodos de micropropagación 15

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