Reacciones características de carbohidratos

Introducción

Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes de la naturaleza y constituyen un vínculo
directo entre la energía solar y la energía de los enlaces químicos de los seres vivos. Son las
sustancias orgánicas consideradas como nutrimentos de mayor consumo entre los animales y el
hombre. Se producen durante la fotosíntesis, un proceso bioquímico en el que se captura la
energía luminosa y se emplea para llevar a cabo la biosíntesis de moléculas orgánicas con alta
energía a partir de las moléculas con poca energía: CO2 y H2O. En un inicio se aceptaba que los
carbohidratos contenían carbono, hidrógeno y oxígeno en una relación (CH2O)n, de aquí su
nombre. Sin embargo, en la actualidad esta restricción ya no se aplica y en esta categoría se
incluyen muchas sustancias diferentes. A los carbohidratos se les atribuye una amplia diversidad de
funciones biológicas, como fuentes de energía (por ejemplo la glucosa), como elementos
estructurales de vegetales como el caso de la celulosa y de insectos como la quitina. Además, son
precursores de otras biomoléculas como los lípidos, aminoácidos, las purinas y las pirimidinas.

Los carbohidratos se clasifican en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos,

según el número de unidades de azúcares sencillos que contengan. Los carbohidratos también son
partes integrales de otras biomoléculas. Un grupo amplio de glucoconjugados (moléculas
proteínicas y lipídicas con grupos de carbohidratos ligados de forma covalente) están distribuidos
entre todas las especies vivientes, principalmente, entre los organismos eucariotas. Determinados
carbohidratos (los azúcares ribosa y desoxirribosa) son elementos estructurales de los nucleótidos
y de los ácidos nucleicos.

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como
el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es
oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre
son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra
combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones
químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no. Algunas de
ellas son, la prueba de Benedict, la prueba cualitativa de la glucosa oxidasa, la prueba de yodo para
almidón e hidrólisis del almidón.

En esta práctica se realizarán ensayos para determinar la presencia de carbohidratos en una

muestra (reacción de Molisch) y algunas características de sus monómeros constituyentes
mediante las reacciones de Bial y la prueba de Seliwanoff.

Competencia

Diferenciar las estructuras que distinguen a los carbohidratos con actitud crítica,

manteniendo el equilibrio de la biodiversidad y el ambiente.

Material

Gradilla, pipetas de 5 mL, pipetas de 1 mL, mechero, tripié y tela de asbesto. Vaso

de precipitados de 600 y 100 mL, probetas de 50 o 100 mL, pinzas para tubo de
ensaye y tubos de ensaye de 18 X 150. Ácido sulfúrico concentrado -naftol al

0,5% en etanol, soluciones de glucosa, fructosa, almidón, sacarosa, maltosa al 3%

rotuladas con números para su posterior identificación.

Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,05 g de resorcinol en 33 mL de HCl concentrado.

Aforar a 100 mL con agua destilada.

Reactivo de Bial: disolver 1. 5 gramos de

orcinol en 50 mL de HCl concentrado, y añadir de 20 a 30 gotas de una solución

acuosa de FeCl3 a l 10%.

3.4 Procedimiento

3.4.1 Reacción de Molisch

1. Pipetear en un tubo de ensayo 2 ml de disolución de azúcar problema.

2. Añadir 2 gotas de α-naftol al 1% y mezclar bien.

3. Con una pipeta se dejan resbalar por la pared del tubo de ensayo 2 ml de ácido

sulfúrico concentrado con mucho cuidado procurando que no se mezcle para que

forme una capa bajo la disolución de azúcar.

En la superficie de separación de ambas capas se producirá la deshidratación del

azúcar y su reacción con el α-naftol formándose un anillo de color oscuro en dicha

interfase.

Molisch positivo: anillo oscuro.

3.4.2 Reacción de Seliwanoff

1. Con la ayuda de una pipeta, agregue en un tubo de ensaye 4 gotas de cada

una de las soluciones de los carbohidratos.

2. Añada 5 mL de reactivo de Seliwanoff los tubos de ensayo.

3. Caliente en agua hirviente durante 5-10 minutos.

La reacción es positiva al aparecer un color rojo intenso, indicando la presencia

de cetohexosas.

3.4.3 Reacción de Bial

1. Con la ayuda de una pipeta adicionar 0.5 mL de cada una de las soluciones de

azúcares a un tubo de ensaye.

2. Agregar 0.5 mL de reactivo de BiaL

3. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo.

3.5 Resultados

3.5.1. Registre sus resultados e identifique el tipo de polisacárido contenido en

cada tubo de ensayo.

II PARTE. HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

OBJETIVO

Estudiar experimentalmente la actividad enzimática utilizando diferentes modelos enzima-

sustrato.

FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA

En biotecnología, el aprovechamiento de biopolímeros de alto peso molecular como los

polisacáridos, es de gran interés industrial y comercial. Los polisacáridos son biomoléculas de
elevado peso molecular formadas por grandes cantidades de monosacáridos (más de 10) unidos
entre sí por enlaces glucosídicos. Sus estructuras químicas contienen cadenas lineales o
ramificadas, que se clasifican en homopolisacáridos integrados por un solo tipo de monosacárido y
heteropolisacáridos constituidos por varios tipos de monosacáridos.

Los polisacáridos se pueden clasificar en dos grandes grupos de acuerdo a su función biológica en:
A.- polisacáridos con función estructural, como: quitina, celulosa, condroitina, galactanas,
carragenina, entre otros.

B.- polisacáridos con función de reserva energética, algunos ejemplos son: glucógeno, amilosa,
amilopectina, almidón, mananas, entre otros.

En esta práctica se trabajará con el almidón como modelo de estudio. El almidón es un polisacárido
de reserva en organismos vegetales. Se hidroliza en glucosa, maltosa y dextrinas, por la acción de
las enzimas amilasas.

El Almidón es un gránulo compuesto por polisacáridos de reserva energética en el reino vegetal.

Contiene cadenas lineales de amilosa unidos por medio de enlaces glucosídicos α-(1-4) y cadenas
ramificadas de amilopectina unidas por enlaces α-D-(1-6). Se encuentra en mayor proporción en
los cereales, los tubérculos y en algunas frutas como polisacárido de reserva energética.

FUNDAMENTACIÓN TÉCNICA

Una de las enzimas que hidrolizan el almidón es la α-amilasa, esta se halla presente en la saliva, en
el jugo pancreático y la producen diferentes microorganismos. Esta enzima hidroliza al azar enlaces
α-(1-4) dando como resultado unidades de glucosa libre y maltosa, sin embargo no actúa sobre los
enlaces α-(1-6), enlaces que conforman a la amilopectina.
En la hidrólisis catalizada por ácidos (como el ácido clorhídrico presente en el

estómago humano) hay un rompimiento desordenado de enlaces, con la formación

intermedia de todos los posibles oligosacáridos y con la conversión final de estos

oligosacáridos a monosacáridos.

Para el análisis de la hidrólisis de los polisacáridos de almidón se utilizan dos

pruebas químicas cualitativas rápidas, la prueba con yodo es para detectar la

presencia del almidón y la prueba de azúcares reductores para revelar la formación

de monosacáridos. En el caso de la prueba con yodo, éste reacciona con la amilosa

y genera un fuerte color azul característico debido al complejo que se establece entre

una molécula de yodo con cada 7-8 glucosas; para desarrollar adecuadamente la

coloración se requiere un mínimo de 40 residuos de monosacárido, las cadenas muy

cortas de amilosa, en lugar de azul, producen un color rojo.

La hidrolisis de almidón da como resultado glucosa libre, es decir, un azúcar

reductor. La Prueba de Benedict se usa para detectar la presencia de azúcares

reductores porque el reactivo de Benedict contiene cobre y éste se reduce en

presencia de azúcares reductores. Durante esta reacción el azúcar se oxida.

La hidrólisis de los enlaces glucosídicos del glucógeno puede ser también llevada a

cabo por la enzima α-amilasa, que cataliza la hidrólisis específica de los enlaces α-

(1-4) y no son afectados los enlaces α-(1-6). Los productos finales de la hidrólisis

enzimática del glucógeno son glucosa, maltosa e isomaltosa. A medida que procede

la hidrólisis se puede seguir el incremento en el número de los grupos terminales

reductores, usando el reactivo dinitrosalicilato. Esta hidrólisis se sigue igual que la

ácida, es decir, mediante la reducción de 3’-5’-dinitrosalicílico a 3-amino-5-

dinitrosalicílico (producto coloreado que absorbe a 540 nm).

MATERIALES Y REACTIVO
MÉTODO

Obtención de la enzima amilasa

La enzima amilasa se obtendrá de la saliva de una persona no fumadora. Masticar un trozo de

papel filtro para estimular la salivación. Transferir la saliva a un vaso de precipitados de 50 ml hasta
obtener 2 ml.

Preparación de solución de almidón al 2%

Disolver 2 g de almidón en 100 ml de agua destilada.

Preparación de jugo gástrico simulado

Mezclar 40 ml de HCl 0.1 mol/l con 15 ml de ácido acético 0.1 ml/l y 45 ml de agua

destilada en un vaso de precipitado de 250 ml.

Hidrólisis enzimática de almidón

Enumerar los tubos de ensaye del 1 al 8.

Agregar 2 ml de agua destilada, 2 ml de solución de almidón al 2% y 2 ml de solución

base de enzima en los tubos 1 y 2.

Agregar 2 ml de agua destilada y 2 ml de solución de almidón al 2% en los tubos 3 y

4. Colocar los tubos en baño maría a 37°C durante 15 m inutos. Una vez transcurridos

los 15 minutos, realizar reacción de Benedict y prueba de lugol.

Hidrólisis ácida del almidón

Tomar 1 ml de cada uno de los tubos de hidrolisis enzimática y depositar cada

mililitro en tubos diferentes.

Señalar en cada uno de los nuevos tubos, de cuáles tubos provienen.

Agregar 1 ml de jugo gástrico simulado a cada tubo.

Mantener tubos en baño maría a 40°C durante 15 minu tos.

Una vez transcurrido el tiempo, realizar prueba de lugol y reacción de Benedict al

contenido de cada uno de los tubos. Estas pruebas se podrán hacer en los mismos

tubos.

Reacción de lugol

Tomar 0.5 ml del contenido de cada uno de los tubos y depositarlos en diferentes

pocitos de una placa con cavidades de porcelana, y añadir unas gotas de lugol a

cada uno de ellos. La coloración azul indica reacción positiva para almidón y significa

que no ocurrió la hidrólisis. Anotar las observaciones.

Reacción de Benedict

Tomar 0.5 ml del contenido de cada uno de los tubos y depositarlos en diferentes

pocitos de una placa con cavidades de porcelana y agregar 1 ml del reactivo de

Benedict a cada uno de ellos. El precipitado rojo ladrillo indica reacción positiva para

glucosa y significa que si ocurrió la hidrólisis. Anotar las observaciones.

Reacción del DNS

Enumerar 8 tubos de ensaye.

Añadir a cada uno de ellos solución de almidón 2% (excepto al primero que lleva

agua), la α-amilasa y el reactivo DNS a los tiempos indicados en la tabla 1.

Cuando estén listos los tubos con DNS, llevar a un baño de agua hirviendo por 5

minutos.

Enfriar los tubos en baño de hielo.

Una vez enfriados los tubos, completar, en los tubos, hasta un volumen final de 10 ml

con agua destilada. Mezclar bien.

Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm ajustando a 0 con el tubo 1,

que será empelado como blanco.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Se aconseja presentar los resultados de la hidrólisis de almidón de acuerdo a la tabla 1. Indicando

si las reacciones fueron positivas (+) o negativas (-). También se aconseja presentar fotos como
evidencia.

Discusión de resultados:

Se aconseja presentar los resultados de la hidrólisis ácida del almidón de acuerdo a la tabla 2.
También se aconseja presentar fotos como evidencia.
Los resultados obtenidos en la hidrólisis deben corresponderse con un aumento de

dicha hidrólisis a lo largo del tiempo, se mostrarán tanto los valores de absorbancia

obtenidos como los

porcentajes de hidrólisis respecto al tiempo, considerando el 100

% de hidrólisis la del tubo 8.

CUESTIONARIO

1. Elegir un homo- o hetero- polisacárido de interés biológico y realizar la

siguiente investigación:

a. Comentar por qué razones se estudian sus propiedades en la

investigación científica.

b. Mostrar el diagrama de flujo de la técnica de hidrólisis de otro homo- o

hetero- polisacárido de interés biológico de una publicación reciente del

Pubmed u otra base de datos científica.