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Tema-2.
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Biotecnología Vegetal
3º Grado en Biotecnología
Facultad de Ciencias Experimentales
Reservados todos los derechos.

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BIOTECNOLOGÍAVEGETAL
TEMA 2: MEDIOS DE CULTIVO Y PREPARACIÓN
1. MACRONUTRIENTES Y MICRONUTRIENTES
Para la preparación de un medio de cultivo que permita el crecimiento y desarrollo de las plantas es esencial la
adición de macronutrientes y micronutrientes, así como algún azúcar que sirva como fuente de energía para
promover la división celular. En algunos casos también se añaden vitaminas (sobre todo del grupo B), ya que se ha
demostrado que su presencia en el medio mejora el crecimiento vegetal.
A veces también se añaden componentes que mejoran alguna característica en el desarrollo in vitro, como:
• Aminoácidos.
• Suplementos no definidos: conjunto de componentes que mejoran el crecimiento, como el hidrolizado de
caseína o la leche de coco.
• Tampones (buffers): permiten mantener constante el pH de los cultivos.
• Compuestos quelantes.
• Agentes gelificantes: permiten obtener medios de cultivo sólidos.
Otro componente fundamental de los medios son los reguladores del crecimiento. Gracias a la combinación de los
diferentes reguladores de crecimiento conseguimos diferentes tipos de morfogénesis y organogénesis.

Macronutrientes
Son Nitrógeno (N), Fósforo (P), Potasio (K), Calcio (Ca), Magnesio (Mg) y Azufre (S). Se denominan macronutrientes
porque las plantas los requieren en concentraciones relativamente altas (mM). Un paso decisivo en el desarrollo
de un medio de cultivo es conseguir una adecuada concentración y balance entre estos macronutrientes.
La planta absorbe y transporta estos elementos minerales de forma pasiva o activa (implica un gasto energético).
Para que estos procesos de absorción y transporte ocurran de forma adecuada hay que considerar una serie de
factores:
• Concentración de otros elementos. Si hay mucha concentración de un elemento se limita la absorción y
transporte de otros. Por eso es tan importante conseguir el balance adecuado.
• pH: hay que establecer un control del pH para asegurar la disponibilidad de los macronutrientes.
• Temperatura: afecta a la forma de absorción y transporte de los macronutrientes en los tejidos vegetales.
• Estado fisiológico del tejido.
Los macronutrientes se clasifican en tres tipos principales dependiendo de cuál sea su función:
• Tipo I: son componentes estructurales de los compuestos biológicos.
• Tipo II: actúan como activadores enzimáticos (cofactores de enzimas).
• Tipo III: catalizan reacciones de oxido-reducción. Están implicados en la osmorregulación de las células
vegetales.
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 1
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ABSORCIÓN FUNCIÓN ASIMILACIÓN
En proteínas, ácidos
En forma de ion nitrato Tipo I: forma parte de la estructura de nucleicos, fosfolípidos,
NITRÓGEN
(NO3-) e ion amonio macromoléculas y de otras moléculas vitaminas, fitohormonas,
O (N)
(NH4+). orgánicas. metabolitos secundarios,
etc.
En forma de ion En los nucleótidos mono-, di-
Tipo I: forma parte de la estructura de
FÓSFORO ortofosfato (PO43-), y trifosforilados, en ácidos
macromoléculas y de otras moléculas
(P) monofosfato (HPO42-) y nucleicos, fosfolípidos y
orgánicas.
bifosfato (H2PO4-). metabolitos secundarios.
Tipo II: cofactor enzimático (implicado en
procesos metabólicos).
POTASIO En forma de ion potasio Tipo III: osmorregulador, ya que permite Como ion soluble en las
(K) +
(K ). compensar la carga negativa de aniones vacuolas.
orgánicos e inorgánicos presentes en las plantas
(función estomática, nastias o movimientos…)
Tipo I: forma parte de los pectatos de la lámina
En forma de pectatos de
media y de los puentes de Ca en las membranas
CALCIO Como catión divalente calcio, puentes lipídicos,
(estabilización de membranas).
(Ca) (Ca2+). calmodulinas, oxalato
Tipo II: actúa como cofactor enzimático y
cálcico, etc.
transductor de señales.

En las clorofilas y se unen al
MANGESIO En forma de catión Tipo I: forma parte de las clorofilas.
ATP durante la síntesis de
(Mg) divalente (Mg2+). Tipo II: es activador enzimático.
proteínas y transcripción.
En enzimas redox, en
AZUFRE En forma de ion sulfato Tipo I: forma parte de los aminoácidos
aminoácidos, coenzimas,
(S) (SO42-). azufrados (proteínas), heteropolisacáridos, etc.
vitaminas, etc.
Nitrógeno
El nitrógeno es el macronutriente más importante, ya que el crecimiento y morfogénesis de las plantas están
determinados por su disponibilidad y la forma en la que se añada (amonio (NH4+) o nitrato (NO3-)).
La planta puede absorber de manera indistinta las dos formas en las que se presenta el nitrato: ion amonio (NH 4+)
e ion nitrato (NO3-). Sin embargo, una vez que el nitrato es absorbido por la planta, debe ser reducido hasta ion
amonio para incorporarse a las biomoléculas (proteínas). Esta cuestión nos hace plantearnos si sería más eficiente
añadir solo ion amonio a los medios de cultivo, cosa que no puede ocurrir, ya que en altas concentraciones resulta
toxico para la planta. Por tanto, a los medios de cultivo siempre hay que añadirle las dos formas del nitrógeno
(balance), encontrándose generalmente el nitrato en mayor concentración.
La presencia del amonio en bajas concentraciones, junto con el nitrato, permite controlar el pH:
o Mejora la asimilación y reducción del NO3-.
o Tamponar los medios con NO3-. La absorción de amonio provoca una bajada de pH. Para compensarlo, la
planta absorbe nitrato, que permite que el pH vuelva a subir. Este mecanismo permite un estricto control
del pH, de forma que se mantiene constante durante el desarrollo del cultivo.
Por tanto, los medios de cultivo son capaces de funcionar solo con nitrato, pero lo hacen mejor cuando también se
encuentra presente el ion amonio.
Ejemplo de cultivos realizados con
diferentes objetivos, como la
obtención de callos, ápices, cultivo
en suspensión de embriones…
A estos cultivos se les ha añadido

diferentes concentraciones de
nitrato y amonio. La razón entre
ambos iones normalmente es el
doble de nitrato que de amonio,
nunca más amonio que nitrato
debido a la toxicidad que provoca.
La morfogénesis está muy influenciada por la
disponibilidad de nitrógeno.
En este experimento realizado en la especie

Crysanthemum se ve como al incrementar la
concentración total de nitrógeno se produce una
mayor morfogénesis, que se mide como el
número de ápices formados por explante. Sin
embargo, a concentraciones muy altas de
nitrógeno (120 mM), este provoca toxicidad.

Tenemos representadas dos variedades. Mientras
que a Bravo le afecta mucho la disponibilidad de
nitrógeno, a Super Yellow apenas le afecta.
El efecto del nitrógeno esta por tanto relacionado con el genotipo, pero también con la concentración de sacarosa
que se añada al medio. La sacarosa está formada por Carbono y otros nutrientes, por lo que una elevada
concentración, provoca que la planta tenga menor necesidad de utilizar los iones inorgánicos presentes en el medio
(↑ [Sacarosa] afecta a la absorción de otros nutrientes).
Micronutrientes
Cuando se iniciaron los cultivos in vitro no se conocía cuáles eran los micronutrientes esenciales. Las sales que se
usaban en la preparación de medios de cultivo no eran puras, por lo que se estaban añadiendo micronutrientes sin
tener conciencia de ello.
A medida que los productos químicos para la preparación de medios se fueron haciendo más puros, se observaron
deficiencias en el crecimiento de las plantas. En ese momento se pudo demostrar cuales son los micronutrientes
esenciales: Hierro (Fe), Manganeso (Mn), Cobre (Cu), Zinc (Zn), Molibdeno (Mo), Boro (B), Cloro (Cl), Sodio (Na) y
Cobalto (Co).
Se denominan micronutrientes porque las plantas los requieren en muy bajas concentraciones (µM). Entre sus
funciones destacan:
o Promueven el crecimiento celular y la morfogénesis, por ello son esenciales. En el medio MS se añaden
altas concentraciones de micronutrientes, por eso da tan buenos resultados.
o Son fundamentales para la inducción y mantenimiento de callos.
o También promueven el crecimiento de suspensiones celulares (cultivos de células en medio liquido).
Es importante realizar un control de su concentración, ya que:
• Si se usan sales para la preparación de medios que no son muy puras, puede haber trazas de estos
micronutrientes, dando lugar una concentración demasiado elevada.
• Algunos agentes gelificantes también contienen elementos inorgánicos que elevan la concentración de
micronutrientes.
Al igual que los macronutrientes, los micronutrientes se clasifican en tres tipos dependiendo de su función:
• Tipo I: componentes estructurales de los compuestos biológicos.
• Tipo II: Activadores enzimáticos
• Tipo III: catalizan reacciones de oxido-reducción (osmorregulación).
ABSORCIÓN FUNCIÓN ASIMILACIÓN
En forma de ion En enzimas redox (ferroproteínas sulfuradas,
HIERRO 2+
Tipo I: forma parte de hemoproteínas y
ferroso (Fe ) y citocromos y citocromo oxidasa), catalasas,
(Fe) se une a sulfoferroproteínas.
férrico (Fe3+). peroxidasas, etc.
En forma de iones
MANGANE En complejos enzimáticos, en enzimas de
manganeso Tipo II: cofactor enzimático.
SO (Mn) defensa y respiratorias.
(Mn2+).
En forma de ion
COBRE monovalente (Cu+) Tipo II: cofactor enzimático (implicado En enzimas redox (plastocianinas), citocromo
(Cu) o de ion cúprico en procesos metabólicos). oxidasa, fenolasa, etc.
2+
divalente (Cu )

En enzimas que regulan la síntesis de
Como ion Zinc
ZINC (Zn) Tipo II: actúa como cofactor enzimático. triptófano, como cofactor de una gran
(Zn2+).
cantidad de enzimas…
En forma de ion
En nitrato reductasa, nitrogenasa, xantín
MOLIBDEN hexavalente
Tipo II: cofactor enzimático. deshidrogenasa (metabolismo de purinas),
O (Mo) (Mo6+) o de ion
síntesis de ABA.
molibdato (Mo42-).
Tipo I: forma parte de moléculas que
estabilizan la pared celular.
Como ion borato Forma enlaces con las pectinas de la pared
BORO (B) Tipo II: actúa como transductor de
(H2BO3-). celular y junto al Ca transduce señales.
señales hormonales. Mantenimiento de
la actividad meristemática.
Tipo II: cofactor enzimático.
En forma de ion Tipo III: osmorregulación. Entra y sale
CLORO (B) -
En enzimas redox y se almacena en la vacuola.
cloruro (Cl ). para compensar la entrada y salida de
iones con carga positiva.
En forma de ion Tipo III: función iónica, sustituye al K+
SODIO (Na) Se acumula en la vacuola.
sodio (Na+). (cuando hay deficiencia de este ion).
Tipo II: regula la morfogénesis, inhibe la
COBALTO 2+
Como ion Co . síntesis de etileno, protege de los En varios enzimas y coenzimas.
(Co)
metales pesados.
El Cloro, Sodio y Cobalto se requieren en tan bajas concentraciones que en algunos medios ni siquiera se añaden
de forma específica. Solo con las impurezas que contengan las sales con las que se preparan los medios o su
presencia en el agua es suficiente.
Hierro y Agentes quelantes
El hierro se trata de un micronutriente esencial que es absorbido por la planta en forma de ion ferroso (Fe2+) o
férrico (Fe3+). El problema es que cuando estos iones se encuentran en disolución precipitan como:
• Fosfatos de hierro, cuando el pH se encuentra próximo a la alcalinidad.
• Fe(OH)2 (hidróxido de hierro), en medios aireados con pH próximo a la alcalinidad.
Los precipitados de hierro son compuestos insolubles, lo que provoca una bajada en la disponibilidad de hierro (se
encuentra presente en el medio, pero no puede ser absorbido por la planta). Para evitar la precipitación, el hierro
se añade a los medios en forma quelada.
El agente quelante más utilizado es el EDTA. El complejo formado por Fe-EDTA:
• Mejora la disponibilidad de hierro.
• Aumenta el crecimiento de los cultivos in vitro. El hierro se va soltando de forma progresiva, por lo que
nunca hay una alta concentración de hierro libre y no puede precipitar.
Estos agentes quelantes son compuestos que forman complejos con cationes (lineales o en
anillo “quelato”). Al quelar el ion, evitan que los cationes reaccionen con aniones y se formen
compuestos insolubles. De esta forma siempre se puede mantener una disponibilidad de hierro
adecuada.
Los agentes quelantes tienen una capacidad de unión variable a los compuestos metálicos, que
depende de su estructura química y del grado de ionización.

Las plantas poseen compuestos quelantes naturales, como son: proteínas, porfirinas, ácidos carboxílicos, etc. Pero
en los medios sintéticos se usan compuestos quelantes de síntesis, de los cuales el más usado es el EDTA, aunque
también se usa el EGTA.
Efecto del pH
Otro aspecto que influye en la presencia de macronutrientes y micronutrientes en los medios es el efecto del pH.
El pH del medio debe ser el adecuado para:
o Que no se interrumpa la función de las membranas

celulares.
o Que la eficiencia de la gelificación del agar no se vea
afectada, ya que a pH muy ácidos no se produce la
gelificación (quedan medios líquidos).
o Que se establezca la forma soluble de las sales para que se
encuentren disponibles para las plantas.
o Que la absorción y transporte de estos compuestos no se
vea afectada.
Como vemos en la figura, la disponibilidad de los diferentes

elementos minerales depende del pH del medio. Si en el medio se
usa un pH de 7,4 tenemos una buena disponibilidad de molibdeno,
muy baja de zinc y cobre, pero no tenemos disponibilidad ni de boro
ni de manganeso.
El pH de consenso en el que hay disponibilidad de la mayoría de

elementos minerales es 5,6-5,9 (ligeramente ácido).
2. AZÚCARES Y OTROS COMPONENTES
Los azucares también son componentes esenciales para la planta, ya que son una gran fuente de energía. Es
necesario aplicarlos a los medios de cultivo porque inicialmente los explantes no son autótrofos y por ello necesitan
una fuente externa de azúcares que les aporte la energía necesaria.
El más utilizado es la sacarosa, ya que es el azúcar que da mejores resultados en cultivos

in vitro. Se trata de un disacárido formado por un monosacárido de glucosa y otro de
fructosa.
La sacarosa puede ser hidrolizada en sus monosacáridos de dos formas:

• Enzimáticamente: la invertasa (localizada en las paredes celulares) y otros enzimas extracelulares llevan a
cabo una hidrolisis total o parcial del disacárido. Esto es lo que ocurre dentro de los tejidos vegetales.
• Autoclavado: el autoclavado provoca una hidrólisis parcial de la sacarosa. Dicha hidrólisis puede verse
aumentada cuando el medio presenta, además de agua, otros componentes.
La hidrolisis de la sacarosa depende del pH, pero lo normal es que se produzca tan solo entre un 10-15% de hidrolisis
al pH adecuado del medio (5,5-5,9), por lo que no se pierde una gran cantidad. Si el pH fuera ligeramente alcalino
la hidrolisis sería mayor, por lo que se perdería una concentración importante de sacarosa.
La concentración más efectiva de sacarosa se sitúa entre 2-4% p/v, ya que es cuando se registran mayores tasas de
crecimiento en callos y células.
En la imagen podemos ver otro experimento realizado en

Crysanthemum, en el que se produce una morfogénesis
variable (contabilizado mediante el número de ápices por
explante) en las plantas dependiendo de la concentración
de sacarosa. Al incrementar la concentración de sacarosa
se produce una mayor morfogénesis, ya que se produce
una mayor cantidad de ápices por explante.
Es importante destacar que el efecto de la sacarosa

también depende del genotipo y que a concentraciones
muy altas puede llegar a ser tóxica.
Efecto osmótico de los ingredientes del medio
El potencial osmótico de un medio de cultivo está determinado por

la molaridad de los iones en disolución y en mayor medida por la
molaridad de los azúcares. Es la suma del potencial generado por
los elementos minerales (sobre todo macronutrientes, ya que los
micronutrientes se encuentran en muy baja concentración) y los
azúcares.
Al aumentar la concentración de sacarosa desde un 0,5 hasta un

12%, la osmolaridad va incrementando de forma progresiva, lo que
provoca una importante disminución del potencial osmótico del
medio.
Concentraciones muy altas de azúcar dan lugar a potenciales

osmóticos muy negativos, disminuyendo el potencial hídrico del
medio. Por tanto, no podemos añadir todo el azúcar que queramos, ya que no solo afecta a nivel energético, sino
también a la disponibilidad de agua para los tejidos vegetales.
Además, si el medio es sólido, la adición del agente gelificante provoca una disminución del potencial hídrico debido
a la aparición del potencial matricial. Por tanto, el potencial hídrico de un medio liquido siempre va a ser mayor que
el de un medio sólido.
𝛹𝑠 = 𝛹𝑜 + 𝛹𝑝 + 𝛹𝑚
Otros azúcares
Los azúcares más empleados tras la sacarosa son la glucosa y la fructosa, que
precisamente son los monosacáridos que constituyen la sacarosa. Tienen un mayor coste
que la sacarosa, por lo que tan solo se utilizan para especies que presentan un mejor
crecimiento.
La arabinosa y la xilosa (monosacáridos) rara vez se usan, al igual que disacáridos como
la celobiosa, maltosa o trehalosa. En algunos medios de cultivo también se usan
polisacáridos como el almidón.

La galactosa no es adecuada para ser añadida a los medios, ya que se trata de un compuesto toxico para la mayoría
de las plantas, incluso a concentraciones muy bajas de 0,01%. Es tóxica porque ejerce efectos inhibitorios sobre el
crecimiento y desarrollo y está relacionada con la inducción de la síntesis de etileno, que a su vez provoca inhibición
del crecimiento.
A parte de estos azúcares existen los azúcares alcoholes como el manitol o sorbitol, que no son compuestos
metabolizados por las plantas (no los usan como fuente de energía). Por tanto, no se añaden a los medios como
componentes nutricionales, sino como agentes osmóticos que permiten mantener un potencial hídrico adecuado
para cada cultivo. Se emplean sobre todo para los cultivos de células aisladas o protoplastos.
Vitaminas
Otro de los componentes que se añade de forma generalizada a los medios de cultivo son las vitaminas.
Habitualmente a las plantas no se les adiciona vitaminas porque son capaces de sintetizarlas, pero los cultivos de
células o explantes no tienen esa capacidad, por lo que su adición mejora los resultados de los cultivos in vitro.
Actúan como intermediarios esenciales o catabolitos metabólicos, mejorando de forma considerable el crecmiento,
desarrollo y morfogénesis de los cultivos in vitro. No todas las vitaminas que se describen a continuación son
empleadas de forma simultánea, si bien, hay algunos medios que incorporan prácticamente todas (depende de la
finalidad que se busque con el medio de cultivo). Las cuatro vitaminas más frecuentes son las que se usan en el
medio MS:
• Myo-inositol (Vitamina Bh): es la vitamina más utilizada, pero su función más importante es como
carbohidrato suplementario. Se adiciona a los medios porque:
o Por si solo mejora la estabilidad de las células en cultivo, ya que se incorpora entre los
constituyentes de membrana.
o Además tiene función como mensajero secundario de auxinas. Se ha visto que la presencia de myo-
inositol induce la formación de yemas y ápices, el crecimiento de callos y también tiene función en
el retraso de la necrosis.
• Tiamina (Vitamina B1): es la segunda vitamina más añadida a los medios de cultivo, ya que se ha visto que
su presencia induce el crecimiento celular. Entre sus funciones destacan:
o Es un cofactor del metabolismo de carbohidratos, es decir, de los azúcares que se añaden al medio.
o Se encuentra implicada en la biosíntesis de algunos aminoácidos.
o Interacciona con citoquininas.
• Ácido nicotínico (Vitamina B3).
• Piridoxina (Vitamina B6).
Luego hay otro conjunto de vitaminas que se añaden de forma menos frecuente: ácido pantoténico (Vitamina B5),
ácido ascórbico (Vitamina C), biotina (Vitamina B8), riboflavina (Vitamina B2), ácido fólico (Vitamina B9), α-tocoferol
(Vitamina E), calciferol (Vitamina D) y adenina (Vitamina B4).
Suplementos no definidos
En los inicios de los cultivos in vitro se usaban principalmente sales minerales y suplementos no definidos que
mejoraban el crecimiento y la organogénesis. Dichos suplementos no definidos son fuentes de aminoácidos,
péptidos, vitaminas y reguladores del crecimiento. En la actualidad no son tan utilizados, pero en ocasiones se
añaden a nivel comercial cuando se realiza micropropagación. Entre estos suplementos destacan:
• Extractos de levaduras, malta y carne. Los más empleados en los cultivos vegetales son los extractos de

levaduras.
• Zumos, pulpas y extractos de diversas frutas como plátano o tomate.
• Fluidos nutricionales de embriones cigóticos (leche de coco).
• Extractos de plantas (hojas, patata hervida, maíz, raíces y rizomas). La patata hervida se emplea mucho
para el cultivo de hongos y algunas bacterias.
• Savia de plantas.
• Hidrolizados de proteínas (caseína).
Ácidos orgánicos
Solo se incorporan en los medios de cultivo donde son requeridos. Entre sus funciones destacan:
• La principal es que actúan como tamponadores del medio, permitiendo mantener un pH constante.
• También actúan como agentes quelantes mejorando la disponibilidad de iones en el medio.
• Por sí mismo actúan como nutrientes.
El ácido cítrico y málico son los ácidos orgánicos más abundantes en plantas, pero también se usan ácido succínico,
ácido maleico, ácido fumárico y ácido pirúvico.
3. REGULADORES DEL CRECIMIENTO
Son componentes fundamentales de los medios de cultivo. Los reguladores del crecimiento son fitohormonas
como: auxina, citoquininas, giberelinas, ácido abscísico (ABA) y etileno.
El efecto de estas fitohormonas en los cultivos in vitro no es absoluto ni específico. Esto quiere decir que a pesar de
añadir la misma concentración, no siempre se va a conseguir el mismo efecto. La respuesta in vitro va a depender
de muchos factores:
• Condiciones de cultivo: periodo de día largo o día corto, temperaturas altas o bajas.
• Tipo de explante: el efecto de las fitohormonas es diferente dependiendo de si se usa un trozo de hoja, un
ápice de raíz, etc.
• Genotipo.
• Medio de cultivo: dependiendo de la concentración de sales y azúcar el efecto de las fitohormonas varía.
• Balance e interacción entre reguladores: también influye si los reguladores son aplicados de forma
simultánea o de forma secuencial.
Auxinas
Las auxinas fueron las primeras fitohormonas descubiertas, lo que supuso un gran avance en el desarrollo de los
cultivos in vitro.
La auxina más empleada es el ácido indolacético (AIA), aunque también se emplean otras que son muy similares
como el ácido indolbutírico (AIB), ácido naftalenacético (ANA) y el 2,4-D. La principal diferencia entre ellas es la
estabilidad que tienen en el medio:
• El ácido indolacético (AIA) y el ácido indolbutírico (AIB) son los más lábiles
cuando se calientan. Sin embargo, el AIA no es estable cuando se esteriliza
mediante filtrado, por lo que se suele esterilizar en autoclave perdiendo parte
de su actividad.
• Tanto el AIA como el AIB se degradan de forma más rápida cuando se
almacenan en luz que en oscuridad. Esto puede ser ventajoso para evitar el
cambio de medio, ya que a veces nos interesa que la concentración de auxina
sea alta al inicio del cultivo, pero que vaya bajando para que se induzca la
formación de callo o embriones.
• El ácido naftalenacético (ANA) y el 2,4-D no se desnaturalizan. Decae su
actividad en el interior de los tejidos y las células, pero se mantienen en el
medio por lo que durante el almacenamiento aguantan más.

Los principales efectos fisiológicos en los que se encuentran implicadas las auxinas
son:
• Control del crecimiento y elongación celular.
• Iniciación de la división celular y formación de meristemos.
• En las plántulas son las responsables de la dominancia apical. Esto permite
que crezca el ápice y no las yemas axilares.
En los cultivos in vitro son utilizadas porque:

• Promueven el crecimiento de callos.
• Promueven la dispersión celular en suspensiones celulares. De esta forma las células no se agregan y se
consiguen los cultivos de células aisladas.
• Regulan la morfogénesis junto con las citoquininas.
• Cuando las concentraciones de auxinas son elevadas, inducen la embriogénesis somática.
• Para que se produzca la división de las células pre-embriogénicas se debe bajar la concentración de auxinas.
Compuestos fenólicos
Son compuestos que se descubrieron porque forman parte de la leche de coco y del hidrolizado de caseína.
Se comprobó que tienen una acción sinérgica con las auxinas porque actúan como agentes reductores y son
sustratos de enzimas oxidativos. En concreto, lo que hacen es proteger a las auxinas presentes en los medios frente
a la degradación oxidativa provocada por la enzima ácido indolacético oxidasa (AIA oxidasa). Además, aumentan el
crecimiento de callos, formación de ápices, la tasa de proliferación y el enraizamiento al igual que las auxinas.
Entre los principales compuestos fenólicos se encuentran: floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno), ácido

clorogénico, catecol (1,2-dihidroxibenceno), tirosina y cumarinas.
Anti-auxinas
Las anti-auxinas son inhibidores que se unen a los transportadores de auxinas impidiendo su transporte y, por tanto,
su función en el crecimiento celular. Algunos ejemplos: TIBA (ácido 2,3,5-triiodobenzoico), 2,4,6-T (ácido 2,4,6-
triclorofenoxiacético), PCIB (ácido p-clorofenoxiisobutírico), Naptalam (ácido N-1-naftilamínico) y PTAA (ácido 3-
fenil-1,2,4-thiadiazol-5-thioacético).
En ocasiones se aplican a los medios para modificar la morfogénesis de los cultivos, ya que tienen un efecto
antagonista a las auxinas y permiten supera los altos niveles de auxinas endógenas. Esto es beneficioso porque
cuando se encuentran en alta concentración impiden que ocurran ciertos procesos.
Citoquininas
Todas las citoquininas tienen una

estructura semejante, por lo que
realizan funciones similares en los
cultivos in vitro. La primera de ellas fue
descubierta a partir de esperma de

arenque autoclavado cuando se
buscaban compuestos que indujeran
la división celular y recibió el nombre
de kinetina. Tras esto, fueron aislados
diversos compuestos de síntesis con
actividad citoquinina, como la 6-
benzilaminopurina (BAP) y el PBA.
También se descubrieron otras
citoquininas naturales aisladas a partir
de vegetales: zeatina,
dihidroxizeatina, 2-iP y zeatina ribósido.
Las citoquininas tienen diversos efectos fisiológicos sobre los cultivos in vitro:
• Promueven la maduración de los cloroplastos y retrasan la senescencia. Por esta razón se conoce a las
citoquininas como las fitohormonas anti senescentes.
• Inducen el crecimiento de yemas laterales superando la dominancia apical que imponen las auxinas.
Permiten que se produzca la brotación.
• Estimulan la división celular y controlan la morfogénesis como las auxinas.
Por tanto, en los cultivos in vitro son empleadas principalmente para:

• Estimular la división celular. Esto se hace sobre todo en los cultivos en los que se requiere la proliferación
de callos.
• Inducir la proliferación de ápices axilares (brotación masiva de los ápices).
• Inducir la formación de ápices adventicios, es decir, la formación de meristemos en lugares donde
normalmente no aparecen.
• No son necesarias para la inducción de los embriones somáticos, pero si para su posterior desarrollo.
• Inhibir la formación de las raíces.
Hay que tener en cuenta que cuando los cultivos se van a mantener a una temperatura alta, la eficiencia de las
citoquininas disminuye bastante.
Fenilureas
Las fenilureas fueron descubiertas porque forman parte de ciertos compuestos que se añaden a los medios. Son
usadas porque tienen actividad citoquinina, si bien no son consideradas citoquininas: promueven el crecimiento de
yemas durmientes e inducen la división celular.
Una de las fenilureas mas conocidas es el thidiazuron. Se trata de una marca

registrada de un desfoliante que se aplicaba sobre los cultivos de algodón
para recolectar el fruto de forma más fácil. Se ha visto que este compuesto
tiene una fuerte actividad citoquinina y que algunos cultivos responden
mejor a su presencia que a la adición de otro tipo de citoquininas.
Antagonistas de citoquininas
Los antagonistas de las citoquininas se usan con una idea similar a las anti-auxinas, ya que permiten superar las
concentraciones endogenas elevadas de citoquininas en los cultivos. Son compuestos que inhiben la división celular
promovida por las citoquininas, por tanto, en un cultivo de callos inhiben el crecimiento de los callos.
Encontramos dos tipos de antagonistas de las citoquininas: compuestos químicos de las bases de ARN y
relacionados con la octopamina (tiramina y dopamina).
Interacción auxinas-citoquininas
En el experimento de Skoog y Miller (1957) se hizo una comparación de la interacción que ocurría dependiendo de
las concentraciones de auxinas y citoquininas añadidas al medio. Dependiendo del balance entre ambas
fitohormonas se observan distintos procesos morfogenéticos en los cultivos:
• Cuando la concentración de auxina es muy alta y no hay citoquininas se induce la formación de raíces en

los cultivos de estaquillas. Por tanto, las auxinas son las que inducen el enraizamiento.
• Cuando la concentración de auxinas es alta y prácticamente no hay nada de citoquininas se induce la
formación de callos en monocotiledóneas. Sin embargo, este proceso en dicotiledóneas se induce cuando
la concentración de ambas fitohormonas es similar.
• A concentraciones un poco más
bajas de auxinas y algo más altas de
citoquininas se induce el primer
estadio de la embriogénesis
(inducción de la formación de
embriones somáticos).
• Bajando la concentración de
auxinas y aumentando la de
citoquininas se produce la
formación de ápices adventicios.
• Cuando en el medio tan solo hay
una alta concentración de
citoquininas, se produce la
proliferación de las yemas axilares
(brotación).
Dependiendo del balance en un mismo tejido de una misma planta, se inducen diferentes procesos.
La interacción entre auxinas y citoquininas también se encuentra influenciada por el genotipo. En la imagen
tenemos una comparativa de dos ecotipos de Arabiopsis sometidos a diferentes concentraciones (0-20 µM) de las
dos fitohormonas: zeatina (citoquinina) y ácido naftalenacético (auxina). Dependiendo del balance entre ambas
hormonas se van a producir diferentes respuestas:
• Con muchas citoquininas y nada de auxinas no se produce ninguna respuesta en los tejidos de ambos
ecotipos.
• Conforme se incrementa la concentración de auxinas se van induciendo distintas respuestas como la
formación de raíces y tallos en ambos ecotipos,
• La formación de nuevos brotes en el primer ecotipo se produce a distintas concentraciones (todas las que
se encuentran señaladas con las flechas), mientras que en el ecotipo columbia tan solo se produce a una
concentración concreta de ambas fitohormonas.
Efecto de las Giberelinas en cultivos de tejidos
Las giberelinas son fitohormonas que se usan con fines concretos, las más usadas
son auxinas y citoquininas. En muchos casos tienen efectos similares a las auxinas,
pero se usan sobre todo para conseguir una mayor elongación celular, es decir, un
mayor crecimiento de entrenudos.
Existe una gran diversidad de giberelinas y todas ellas contienen el anillo

denominado giberelano. Sin embargo, tan solo hay unas cuantas activas, dentro de
las cuales se encuentra el ácido giberélico o GA3 que es la giberelina comercial.
La presencia de giberelinas en el medio:

• Estimula el crecimiento de meristemos aislados de ápices.
• Incrementa la proliferación y longitud de los ápices (se producen más ápices y de mayor longitud).
• En ausencia de auxinas estimula la formación de ápices adventicios. Sin embargo, cuando hay presencia de
auxinas en el medio tienen un efecto antagonista provocando la inhibición de la formación de ápices
adventicios.
• Inhibe la inducción de la embriogénesis somática (esto también lo hacen las auxinas).
• Estimula el crecimiento de los embriones somáticos preformados.
• Es esencial en los cultivos que tienen baja densidad (cuando hay pocos explantes).
Anti-Giberelinas
Las anti-giberelinas son conocidas como retardantes del crecimiento. Se usan para bloquear la biosíntesis o acción
de las giberelinas endógenas cuando dan problemas en los cultivos. Existen dos tipos principales de anti-giberelinas.
Su adición a los medios:

• Estimula la embriogénesis.
• Disminuye o reprime el crecimiento de callos dependiendo del genotipo.
• Inhibe la formación de ápices adventicios.
Efecto del ácido abscísico en cultivos de tejidos
Otro de los reguladores del crecimiento es el ácido abscísico (ABA), del cual existen
varias formas, siendo la única activa el cis-(+) ABA. Se sintetiza a través de la ruta de
los carotenoides, por lo que para inhibir su síntesis se usa la fluridona que se trata
de un inhibidor de dicha ruta.
El ABA se conoce como la hormona inhibidora del crecimiento, pero además retrasa la
germinacion porque induce la dormancia en yemas y semillas. Esta dormancia permite que
las semillas terminen su desarrollo y se dispersen antes de germinar en el momento
adecuado. En la imagen tenemos un mutante que no produce ABA, por eso las semillas
aunque no se han terminado de desarrollar germinan (germinación precoz).
En los cultivos in vitro prácticamente no se utilizan, tan solo se aplican con fines concretos.
• Se requiere para el desarrollo normal de los embriones somáticos. Al final del desarrollo de una semilla se
acumula ABA en los embriones para retrasar su germinación.
• Previene la formación de embriones accesorios. Son embriones que aparecen en sitios no habituales y que
normalmente no se desarrollan de forma adecuada (son estériles).
• Acelera la formación de yemas-ápices e incrementa el número.
• A baja concentración estimula el crecimiento de callos.
Producción de etileno in vitro
El etileno es una hormona gaseosa relacionada con la senescencia y maduración. No se añade a los medios de
cultivo, sino que es producida por los propios cultivos con una tasa variable dependiendo de la especie.

En los cultivos in vitro se incrementa la producción de etileno debido a:
• Que se encuentran sometidos a condiciones de estrés. Cuando se corta el explante a partir de la herida se
libera etileno, además a los medios de cultivo se añade manitol, PEG, etc. que son sustancia que disminuyen
el potencial hídrico provocando estrés hídrico al explante.
• La senescencia del material vegetal.
• Que el medio tiene muchas auxinas. Las auxinas inducen la producción de etileno, por eso se piensa que
determinados efectos no son provocados directamente por las auxinas sino por el etileno asociado.
• La presencia de galactosa. Por eso es un azúcar que no se debe añadir a los medios, ya que al aumentar la
tasa de producción de etileno inhibe el crecimiento y la morfogénesis.
El etileno se sintetiza a partir de los cultivos y puede quedar acumulado en los recipientes. En general la acumulación
dependerá del: tipo de cultivo, peso del tejido (a más tejido más acumulación de etileno), volumen del recipiente,
tipo de cierre (si es hermético el gas no puede salir acumulándose más) y condiciones de cultivo (si son estresantes
se produce y acumula más etileno).
El etileno:
• Promueve la maduración y senescencia.
• Es una hormona que inhibe la síntesis de clorofila y el desarrollo de los cloroplastos. Esto hace que los
cultivos comiencen a amarillear.
• En muchos casos provoca la desfoliación, es decir, que los cultivos pierdan las hojas.
En general cuando el etileno se acumula en los recipientes tiene efectos inhibidores:

• Produce necrosis en callos (comienzan a ponerse marrones) e inhibe el crecimiento.
• Inhibe el crecimiento celular.
• Inhibe la inducción del desarrollo de ápices.
• En algunos casos promueve la salida de dormancia de yemas.
Carbón activo
Este compuesto se introduce dentro de los reguladores del crecimiento, pero no porque sea una hormona, sino por
su capacidad de absorber un amplio rango de compuestos. Debido a esta habilidad, modifica la composición del
medio, mejorando y regulando el crecimiento in vitro. Sin
embargo, los resultados pueden ser impredecibles
provocando en algunos casos una inhibición del crecimiento y
la morfogénesis.
Con modificación de la composición del medio se hace

referencia a que atrapa grandes cantidades de reguladores de
crecimiento. Por tanto, si la concentración de carbón activo es
demasiado alta, puede que por mucho que se añadan dichos
reguladores, no tengan ningún efecto sobre el cultivo. Por eso
es importante controlar la cantidad de carbón activo que se
adiciona al medio.
Entre sus aplicaciones más importantes destacan:
• Absorbe compuestos inhibidores. Cuando se hace una herida en un explante, expulsa grandes cantidades
de compuestos fenólicos. Como son inhibidores del crecimiento, si se acumulan alrededor del explante van
a tener efectos negativos sobre el mismo. El carbón activo permite absorberlos y que no se encuentren
disponibles para la planta.
• Promueve la formación de raíces. En algunas especies de plantas las raíces no se desarrollan cuando se
encuentran expuestas a la luz. El carbón activo hace que el medio sea más oscuro facilitando la formación
de raíces en estas especies.
• Previene el crecimiento de callos no deseados.
• Promueve la morfogénesis (embriogénesis).
Habituación

Es la capacidad de las células de cambiar de un estado dependiente de una fuente exógena de un compuesto a un
estado parcial o totalmente autosuficiente. Cuando ocurre esto, se dice que la célula o tejido está habituado a una
sustancia X o Y. La dependencia de la sustancia exógena puede ser total o parcial, por lo que se dice que existen
diferentes “grados de habituación”.
La habituación no se produce a compuestos inorgánicos, sino a moléculas orgánicas que la célula o el tejido es capaz
de sintetizar. Es un proceso que ocurre de forma frecuente frente a muchos tipos de compuestos, pero lo más
habitual es la habituación a las auxinas y citoquininas que son las hormonas vegetales que se añaden de forma más
abundante. Este tipo de habituaciones destacan por:
• Son frecuentes y estables. Que sean estables indica que aunque el tejido se corte y se pase a un medio
nuevo va a seguir estando habituado.
• Se inducen por diferentes tratamientos.
• Puede revertir en la regeneración. Son estables, pero no permanecen habituados para siempre, ya que en
distintos subcultivos este proceso puede revertir y perderse la habituación.
La habituación no aparece como consecuencia de una alteracion en la información genetica, sino que se produce
como consecuencia de una alteración en la expresión de ciertos genes, es decir, que se trata de un cambio
epigenético. Los cambios en la expresión de los genes tienen varias características:
• Son dirigidos a moléculas concretas, no son aleatorios.
• Están restringidos por el genotipo, es decir, por la capacidad genética de la célula. Esto que hace que haya
genotipos que se habitúan más fácilmente que otros.
• Son potencialmente reversibles.
• Implican un gran número de conversiones celulares.
• No alteran la totipotencia celular ya que las células siguen teniendo toda la información genética y la
capacidad de desdiferenciarse.
Se han ofrecido dos hipótesis en las que un mecanismo de feed-back positivo es responsable del proceso de
habituación:
• Estimulación de la producción. El tejido gasta la misma cantidad del compuesto pero se produce un
aumento de la tasa biosintética, por lo que se incrementa el nivel del regulador dentro de la célula o tejido.
Por eso por mucho que se añada de forma exógena no responde.
• Retardo de la degradación. Se sintetiza lo mismo porque la tasa biosintética no se ve afectada, pero se
produce un descenso del metabolismo. Esto provoca un incremento gradual del nivel del regulador.
4. TIPOS DE MEDIOS (CONSISTENCIA)
Medios sólidos
En función de la consistencia podemos encontrar tres tipos de medios: sólidos, líquidos y de consistencia
intermedia.
Los sólidos son aquellos a los que se incorpora un gel para que solidifique. Tiene ciertas ventajas
en comparación con los otros medios:
• Permite el uso de explantes pequeños. Estos explantes se colocan sobre el medio y no
se hunden.
• Los explantes mantienen la orientación adecuada.
• No se requiere aireación excepcional, ya que el tejido tiene todo el aire necesario en
la parte superior del recipiente.

• Permite el crecimiento ordenado de ápices y raíces. Las raíces se desarrollan en la
parte basal y los tallos en la parte superior, por encima del medio.
• No se disgregan los callos. Al estar en un medio estable los callos crecen sin
disgregarse.
A pesar de todas las ventajas mencionadas, los medios sólidos también tienen diversos inconvenientes:
• Presencia de inhibidores de crecimiento en los agentes gelificantes.
• Las tasas de crecimiento son más lentas que en otro tipo de medios.
• No difunden los exudados tóxicos. Dichos exudados permanecen alrededor de los explantes afectando a
su crecimiento.
• Al sacar la planta para aclimatarla no se puede eliminar completamente el gel que queda adherido a las
raices. Este gel es una potencial fuente de crecimiento de hongos que afectan al cultivo.
Para solidificar los medios es necesario aplicar agentes gelificantes que solidifican cuando se enfrían, pero primero
es necesario esterilizarlos mediante autoclavado. En general, una de las desventajas de los cultivos sólidos es que
el crecimiento es más lento que en los medios líquidos y se ha demostrado que es inversamente proporcional a la
concentración de gelificante (mayor concentración de gelificante, menor crecimiento).
Esta ralentización del crecimiento puede ser debida a que la presencia del agente gelificante:
• Reduce la difusión: dentro de la matriz que forma el gel se inmovilizan los compuestos tóxicos y enzimas,
que se quedan rodeando al tejido; se ralentiza el transporte de iones; algunos iones pueden quedar
atrapados en la matriz dejando de estar disponibles para los vegetales y la matriz que forma el gel limita la
concentración de oxígeno.
• Reduce el potencial hídrico: esta reducción del potencial hídrico es consecuencia de una bajada del
potencial osmótico como consecuencia de la adición del agente gelificante.
• Limita el contacto del tejido con el medio: cuanta mas cantidad de agente gelificante se añada al medio,
este va a ser más duro y el contacto con el tejido vegetal va a ser peor.
Lo que está claro es que a pesar de que el crecimiento sea más lento, la utilización de los medios sólidos estimula
de forma más eficiente la morfogénesis.
Los agentes gelificantes usados son:
➢ AGAR: es uno de los agentes gelificantes más usados. Se trata de un producto natural extraído de algas
rojas, cuya calidad es distinta dependiendo de las diferentes concentraciones de agarosa que tenga. Existe
una gran diferencia entre las marcas comerciales e incluso dentro de ellas, entre los propios lotes. Su
principal característica es que forma geles semisólidos a concentraciones entre 0,5-1% p/v. La firmeza del
gel va a estar relacionada con el pH de autoclavado (si el autoclavado se hace a pH ácido el medio no llega
a gelificar y queda blando), las cenizas (impurezas) que acompañen al agar y si se añade o no carbón activo
al medio (da más firmeza cuando se añade). Las ventajas del agar frente a otros agentes gelificantes son:
o Forma geles estables a la temperatura de incubación (22-25ºC). Normalmente se disuelve a unos
100ºC y se solidifica cuando enfría sobre los 45ºC.
o No es digerido por enzimas vegetales, por lo que no se altera.
o No reacciona fuertemente con los constituyentes del medio. No atrapa los constituyentes del
medio haciendo que no se encuentren disponibles para el cultivo.
➢ AGAROSA: la agarosa es un agente gelificante más purificado que se extrae del agar. Se encuentra formado
por polímeros de β-D(1-3)galactopiranosa y 3,6-anhidro α–L(1-4)galactopiranosa, con una longitud de
entre 20 y 160 unidades. Gelifica a una temperatura inferior a 30ºC, lo que supone una ventaja para los
cultivos de protoplastos, que pueden dañarse si se añaden cuando la temperatura es demasiado alta. El
problema es que la agarosa es bastante más cara que el agar y además, si se usa a bajas concentraciones
provoca problemas de hiperhidratación. Por tanto, se usa de forma puntual para cultivos muy concretos.
➢ GELRITE (Kelco Division of Merck and Co.): es un heteropolisacárido producido por Pseudomonas elodea
que origina un gel transparente. Contiene potasio, calcio, magnesio y sodio, por lo que altera la
composición de los nutrientes minerales añadidos al medio. Sin embargo, se encuentra completamente
libre de impurezas orgánicas, cosa que no ocurre con el agar o la agarosa. Forma geles semisólidos a
concentraciones entre 0,1-0,5% p/v, siendo bastante más baja que la de agar (casi la mitad), por lo que en
cada cultivo se gasta menos. El margen de la temperatura de gelificación (35-50ºC) es tan amplio porque

depende de la concentración de gel que se añada y de la cantidad de iones que contenga. Permite una
buena difusión de agua y los componentes del medio (no los atrapa tanto, por lo que en general tienen
buena disponibilidad para el cultivo). También es más adecuado cuando se quiere observar el desarrollo
de las raíces, ya que es más transparente.
➢ ALMIDÓN (maíz, cebada o alimentario): forma geles ligeros, estables y consistentes a la temperatura
normal de cultivo. El problema es que se deben añadir mayores concentraciones (superiores a 7% p/v) para
que el almidón de consistencia al medio.
➢ ALGINATOS: es un heteropolímero lineal extraído de algas pardas. Se usa sobre todo en el cultivo de
protoplastos, ya que ofrece una serie de ventajas: gelifica con la adición de Ca2+, no al enfriarse, por lo que
los protoplastos pueden quedar suspendidos en el medio sin dañarse y los geles se pueden licuar con la
adición de ácido cítrico, lo que permite la extracción de los protoplastos o células para transferirlos a otros
medios. Sin embargo, tiene dos desventajas:
o No se puede autoclavar, por lo que la esterilización se debe hacer mediante un método en frío.
o Reacciona con cationes divalentes, lo que puede originar déficit nutricional.
Medios líquidos
Presentan ciertas ventajas con respecto a los medios sólidos:
• Las tasas de crecimiento son mucho más rápidas que en los medios sólidos, ya que tienen una mayor
superficie de contacto y no se generan gradientes. En los sólidos conforme se van consumiendo los
nutrientes, su concentración en el medio que rodea el explante va disminuyendo.
• Se produce una dispersión efectiva de metabolitos tóxicos, de forma que se diluyen. En el medio sólido
estos exudados tóxicos se quedan rodeando al tejido.
Sin embargo, también presentan una serie de inconvenientes:
• El medio debe ser aireado mediante agitación o flujo de aire estéril para que el tejido tenga una buena
disponibilidad de oxígeno.
• Muchas especies cultivadas en medios líquidos presentan fallos en su crecimiento. Esto es debido a que la
agitación impide que las células tengan una polaridad definida.
• La agitación también puede provocar daños en los tejidos delicados.
• Al ser medios líquidos el potencial hídrico es mayor, por lo que existen más problemas de vitrificación o
hiperhidratación que con los medios sólidos.
Para aprovechar las ventajas de los medios líquidos, pero sin perder las ventajas de los medios sólidos se han
encontrado distintos tipos de alternativas:
➢ Soportes mecánicos: los soportes mecánicos más destacados son:
o Celofán perforado: White en 1953 comenzó a utilizar un medio líquido sobre
el que se introducía papel de celofán perforado. En cada una de las
perforaciones se colocaban los explantes.
o Papel de filtro humedecido: fue desarrollado por Heller y Gautheret en
1949. Consiste en introducir un papel de filtro en forma de “U” en el medio
líquido y sobre el colocar el explante. Como el papel de filtro es absorbente,
el explante no se encuentra directamente sumergido en el medio líquido,
sino que se encuentra sobre él.
o Placas Petri perforadas: desarrollado por Skidmore y colaboradores
(1988). En la parte basal se coloca el medio líquido y sobre él la placa
Petri perforada que actúa como soporte del explante.
o Materiales porosos: estos materiales se esterilizan y se introducen en
el medio. Algunos ejemplos son la espuma de poliuretano, la lana de
roca y la lana de poliéster.
➢ Medios de doble fase: fue patentado en Hungría por Molnár en el año 1987. Están formados por
una capa de medio sólido que aporta consistencia y por encima, una capa de medio líquido que
proporciona una mayor disponibilidad de nutrientes al inicio del cultivo. Se ha visto que la
utilización de este sistema mejora la propagación en masa in vitro y que induce la embriogénesis
somática en anteras, así como la elongación y enraizamiento de ápices.
En esta tabla realizada por Serrano-

Martínez y colaboradores en 2017
se muestran las composiciones de
los medios sólidos y líquidos que
forman parte de los medios de
doble fase empleados en diferentes
especies para lograr la mejor
propagación.
En la mayoría de los casos las
composiciones de ambos medios
son iguales. Sin embargo, en
medios como el de Nicotiana
tabacum las composiciones varían.
➢ Sistema de inmersión temporal (SIT): es un sistema

semiautomatizado (diseñado por Adelberg y Simpson en
2002) que permite poner los explantes en contacto con el
medio de forma intermitente durante un corto periodo de
tiempo. Consiste en dos recipientes: en uno de ellos se
encuentra el explante y en el otro el medio de cultivo. Cada
cierto tiempo el medio se mueve hacia el recipiente de los
explantes, los moja totalmente durante un tiempo (por
ejemplo 10 minutos) y tras esto, el medio vuelve hacia su
recipiente inicial. De esta forma, los explantes quedan
mojados por el medio líquido, pero no totalmente cubiertos.
Entre las ventajas de este sistema podemos destacar:
o Permite un contacto completo de los explantes con el medio.
o Facilita una mayor incorporación de nutrientes, ya que todas las partes del explante se encuentran
mojadas.
o Se renueva la atmósfera gaseosa a consecuencia de la entrada y salida del medio.
o Se evita la hiperhidratación de los tejidos y cultivos.
o Se incrementa la tasa de multiplicación.
Cuando el medio pasa de un recipiente a otro debe atravesar unos filtros de 0,22 µm para impedir la
contaminación. Este sistema se ha usado con éxito para la propagación en masa de plátanos, cítricos, café,
piña, yuca, papaya, patata, etc.
Hay distintos tipos de sistema de inmersión temporal (SIT):
▪ RITA®: recipiente para inmersión temporal desarrollado por el laboratorio Biotrop del CIRAD en
Montpellier, Francia. Es el más difundido y se ha utilizado con éxito para la propagación de varias
especies de interés agrícola, ornamental y medicinal, por organogénesis y embriogénesis. Los
explantes se encuentran sobre el medio líquido, que sube y baja para mojarlos.
▪ BIT®: biorreactor de inmersión temporal desarrollado por Escalona y colaboradores en el año 1999.
Son dos recipientes gemelos interconectados por tubos de silicona.
▪ BIG: biorreactor de inmersión por gravedad no automatizado. Para poner en contacto el medio
líquido con los explantes hay que darles la vuelta de forma manual.
▪ SETISTM: biorreactor de inmersión por gravedad que funciona de forma automatizada.
5. DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Y COMPOSICIÓN
Las recetas de los diferentes medios de cultivo se han ido formulando a lo largo de los años y han sido publicadas.
Por tanto, se nombran con el apellido de los investigadores que lo publicaron por primera vez.
En esta tabla se compara la composición de
sales minerales de diferentes medios y
muestra la progresión entre los primeros
medios, como el de Knoop y Pfeffer, y otros
más evolucionados.
En la época en la que fueron publicados los
medios de Knoop y Pfeffer no se conocía la

esencialidad de los micronutrientes, por lo
que en las formulaciones tan solo se
aplicaban macronutrientes. La principal
diferencia entre estos dos medios es que el
de Pfeffer fue mejorado mediante la
adición de Cloruro potásico (todo lo demás
es igual, ya que se usaban las mismas sales
y en proporciones más o menos similares).
Estas formulaciones se fueron quedando obsoletas, ya que en muchos tipos de cultivo no se conseguía inducir la
morfogénesis. Se descubrió la esencialidad de los micronutrientes, por lo que su adición supuso una de las primeras
mejoras de los medios de cultivo. Además, el nitrógeno se dejó de añadir solo en forma de nitrato y se comenzó a
añadir también en forma de amonio (sulfato amonico, fosfato amónico, etc.). Otra de las mejoras fue la adición de
agentes quelantes, en concreto el EDTA para mejorar la disponibilidad del hierro.
Medios de cultivo más utilizados
A continuación, vemos los cuatro medios de cultivo más utilizados:

➢ Medio Murashige y Skoog (1962) – MS: es el medio más usado. Fue desarrollado en un laboratorio de
Estados Unidos con el objetivo de mantener cultivos de callos de tabaco durante largos periodos de tiempo.
Fue mejorado en comparación con los medios desarrollados anteriormente debido:
o Al incremento de la concentración de nitrógeno, llegando a tener 40 mM de nitrato (NO3-) y 20
mM de amonio (NH4+).
o Al incremento del contenido de potasio hasta 20 mM. Esto supone un incremento de once veces
con respecto a los medios anteriores.
o Al incremento del fosfato hasta 1,25 mM.
o También incrementaron los niveles de otros nutrientes minerales, dentro de los cuales se
encuentran los micronutrientes.
Se considera un medio muy rico en sales que da muy buenos resultados en los cultivos de tejidos de muchas
especies. Con él consiguieron incrementar el crecimiento de los callos hasta un 167%.
➢ Medio Gamborg y colaboradores (1968) – B5: en su laboratorio trabajaban en cultivos de suspensiones
celulares de soja. Este medio es distinto al medio PRL-4 desarrollado previamente por ellos, ya que:
o Incrementaron los niveles de nitrato (NO3-) y potasio (K+).
o Disminuyeron la concentración de amonio (NH4+).
o Añadieron una concentración de 1 mM de Ca2+ y Mg2+.
➢ Medio Schenk y Hildebrandt (1972) – SH: intentaban inducir el crecimiento de callos en muchas especies
de monocotiledóneas y dicotiledóneas, mediante un ensayo general para ver como respondían las
diferentes especies. Es una formulación muy parecida a la del medio B5, pero que se consiguió de forma
independiente a la del laboratorio de Gamborg. Se diferencia del B5 en que incrementa los niveles de Ca2+,
Mg2+ y H2PO4-. Cuando analizaron la tasa de crecimiento de los tallos en este conjunto de especies: en 19
consiguieron incrementarla, en 11 el tallo tenía la misma longitud que cuando se usaban otros medios y en
7 era perjudicial, ya que el crecimiento del tallo era menor. Por tanto, daba mejores resultados en más
especies que los anteriores medios.
➢ Medio Lloyd y McCown (1980) – WPM: es un medio más empleado para el cultivo de especies leñosas
como Bétula, Kalmia, Rosa, etc. Para las leñosas la concentración tan alta de sales (NO3- y NH4+) que
contiene el medio MS no es beneficiosa, por tanto, en el medio WPM se disminuye dicha concentración a
¼ de la que contiene el medio MS. Además, se incrementa el SO4-, el fosfato (PO43-) y el hierro (Fe3+). Estos
dos últimos componentes se encuentran al doble de concentración que en el medio MS.

6. ELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
Cuando necesitamos un medio para propagar una planta, ¿cuál elegimos? Para elegir el medio adecuado se deben
seguir los siguientes pasos:
I. Lo primero es realizar un análisis de la bibliografía. Se comprueba si hay grupos de investigación que
trabajan con esa especie y están obteniendo buenos resultados in vitro.
▪ Si ya existe una experiencia previa en la que el medio B5 u otro da buenos resultados, se aprovecha
para llevar a cabo el trabajo.
▪ Si por el contrario no existen investigaciones con la especie en concreto con la que trabajamos,
usamos medios empleados para el cultivo de especies próximas o emparentadas.
II. Si los medios encontrados en bibliografía no funcionan, se hace una prueba con el medio MS, ya que en
general da buenos resultados.
III. En caso de que ninguno de los pasos anteriores de resultado, se aplica un protocolo en el que se establecen
distintas combinaciones de cuatro variables: porcentaje de azúcar, concentración de auxinas,
concentración de citoquininas y contenido de macrosales (sales minerales). Dichas variables se podrán
encontrar en baja, media o alta concentración. De esta forma, se obtienen hasta 81 medios distintos, de
los cuales la mayoría no funcionará. Sin embargo, dentro de todos ellos habrá algunos que favorezcan la
organogénesis y la división celular, que son los que se seleccionan para mejorar. Esto permite finalmente
aproximarnos al medio más adecuado para la
especie con la que vamos a trabajar.
7. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Para acelerar la preparación de los medios es conveniente preparar las soluciones madre o stock de los principales
componentes, de esta forma, se evita tener que pesar todos los componentes cada vez que se vaya a preparar el
medio.
Tanto las macrosales, como microsales y el hierro se preparan de forma separada para evitar los problemas de
interacción y precipitación:
• Macronutrientes: la solución madre se prepara a una concentración de 10-20X. Si se va a usar rápidamente
(1-2 semanas), se almacena en oscuridad y a temperatura ambiente. Si no se va a usar rápido se almacena
en el frigorífico o en alícuotas que se congelan.
• Micronutrientes: a esta solución se añaden todos los micronutrientes excepto el hierro. Se prepara a una
concentración de 100X. Se almacenan siempre en frigorífico o congelador.
•
Hierro: se prepara a parte porque es lo que da más problemas de precipitación. Se disuelve la sal de hierro
(la más usada es el sulfato de hierro FeSO4·7H2O) en una solución acuosa de Na2EDTA. Normalmente se
añaden concentraciones equimolares de Fe y EDTA, pero cuanto mayor sea la concentración de EDTA más
se disminuyen los problemas de precipitación. Esta solución es fotosensible por lo que se debe almacenar
en condiciones de oscuridad y en el frigorífico.
También se preparan las soluciones madre del resto de los componentes que se añaden al medio de forma habitual:
• Vitaminas y aminoácidos: se preparan a 100-1000X. Si se van a usar rápido (1-2 semanas) se guardan en el
frigorífico, sino se almacenan en alícuotas a -20ºC en el congelador.
• Reguladores del crecimiento: también se preparan a 100-1000X. Normalmente se almacenan en el
frigorífico o en el congelador. Se preparan sobre todo las soluciones de citoquininas y auxinas, que son
fitohormonas que no se disuelven en agua.
o Las citoquininas se disuelven en soluciones ligeramente ácidas de HCl (0,1-1 N) o DMSO.

o Las auxinas se disuelven en soluciones ligeramente básicas de sosa (NaOH 0,1 M), potasa (KOH) o
etanol absoluto.
Existen dos formas de preparar los medios de cultivo:
➢ Cuando no hay compuestos termolábiles: se pone un poco de agua en un recipiente y se añaden las sales
minerales (macronutrientes), azúcar, reguladores de crecimiento, etc. Cuando todos los componentes se
han disuelto se lleva la solución hasta el volumen final y se ajusta el pH entre 5,7-5,9. Una vez ajustado el
pH si el medio es sólido se añade el agar y se funde en el microondas. Finalmente el medio se distribuye en
los recipientes y se autoclavan.
➢ Cuando hay compuestos termolábiles: el problema en este caso es que se añade un compuesto que pierde
actividad a consecuencia de las altas temperaturas, como puede ser la zeatina (citoquinina). El
procedimiento es igual, la única diferencia es que se esteriliza el medio en el autoclave, se deja enfriar y
finalmente se añade el compuesto termolábil. Por último se agita bien y se distribuye en los recipientes
estériles.
La forma más habitual de esterilización de los medios es el autoclavado a una temperatura de 121ºC y una
presión de 1,05 kg/cm2. El tiempo de autoclavado varía en función del volumen del medio en el contenedor,
pero lo normal es 15-20 minutos o 30 cuando el volumen es mayor. Si existe algún componente que se degrada
se puede bajar la temperatura hasta 115ºC.
La esterilización mediante ultrafiltración tan solo se usa cuando tenemos medios con compuestos
termolábiles, entre los que destacan:
• Aminoácidos y vitaminas.
• Azúcares como sacarosa, disacáridos y trisacáridos. Debido al aumento de temperatura los azúcares
se hidrolizan, caramelizan y dan lugar a la formación de ácidos.
• Reguladores de crecimiento como la zeatina.
• Antibióticos.
Sin embargo, también hay algunos componentes que son inestables cuando se esterilizan mediante filtración.
En estos casos lo que se hace es disolverlos en una solución de DMSO para esterilizarlos.

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Facultad de Ciencias Experimentales

Reservados todos los derechos.

TEMA 2: MEDIOS DE CULTIVO Y PREPARACIÓN

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 1

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 2

A estos cultivos se les ha añadido

En este experimento realizado en la especie

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 3

ABSORCIÓN FUNCIÓN ASIMILACIÓN

Reservados todos los derechos.

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 4

El agente quelante más utilizado es el EDTA. El complejo formado por Fe-EDTA:

Reservados todos los derechos.

o Que no se interrumpa la función de las membranas

Como vemos en la figura, la disponibilidad de los diferentes

El pH de consenso en el que hay disponibilidad de la mayoría de

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL. Tema 2: medios de cultivo y preparación 5

El más utilizado es la sacarosa, ya que es el azúcar que da mejores resultados en cultivos

La sacarosa puede ser hidrolizada en sus monosacáridos de dos formas:

En la imagen podemos ver otro experimento realizado en

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Es importante destacar que el efecto de la sacarosa

Efecto osmótico de los ingredientes del medio

El potencial osmótico de un medio de cultivo está determinado por

Al aumentar la concentración de sacarosa desde un 0,5 hasta un

Concentraciones muy altas de azúcar dan lugar a potenciales

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3. REGULADORES DEL CRECIMIENTO

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En los cultivos in vitro son utilizadas porque:

Entre los principales compuestos fenólicos se encuentran: floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno), ácido

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Todas las citoquininas tienen una

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Por tanto, en los cultivos in vitro son empleadas principalmente para:

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Una de las fenilureas mas conocidas es el thidiazuron. Se trata de una marca

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Existe una gran diversidad de giberelinas y todas ellas contienen el anillo

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La presencia de giberelinas en el medio:

Su adición a los medios:

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Producción de etileno in vitro

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En general cuando el etileno se acumula en los recipientes tiene efectos inhibidores:

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Con modificación de la composición del medio se hace

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