5 de marzo de 2024

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMEDICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS VETERINARIAS

PRÁCTICA #4
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Integrantes del equipo:

Martínez Chica Viviana 217955
Rodríguez García Orlando Gael 240372
Peña Terrazas Alejandro 217580
Gasca Ceballos Mayra Alejandra 224291
ÍNDICE
Introducción ……………………………………………………………………………… 3
Objetivo ………………………………………………………………………………….. 5
Material …………………………………………………………………………………... 6
Método …………………………………………………………………………………… 7
Resultados ………………………………………………………………………………. 9
Discusión …………………………………………………………………………………9
Conclusión ………………………………………………………………………………. 10
Cuestionario …………………………………………………………………………….. 11
Bibliografías ………………………………………………………………………………13

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Formación de un enlace peptídico …...................................................... 3
Figura 2. Formación del complejo coloreado por Biuret …..................................... 5
Figura 3. Resultados del experimentos No.1 y experimento No.2 …………………. 9
Figura 4. Proceso de degradación de Edman ………………………………………. 12
Tabla l. Resultados del experimento No.1 y experimento No.2 ............................. 9
Tabla ll. Peso molecular y composición de aminoácidos ....................................… 9

2
INTRODUCCIÓN
La palabra Proteína proviene del griego preeminente, que significa primero; fué
inicialmente propuesta por Berzeluis en 1838 para referirse a unas series de
compuestos orgánicos nitrogenados con cierta complejidad que se encuentran
altamente distribuidos en la naturaleza y son la base para actividades tanto
estructurales y funcionales de todo organismo vivo.
La unión de dos o más aminoácidos por uniones ácido – amida genera
macromoléculas lineales que a partir de una longitud de cadena de
aproximadamente 100 residuos de aminoácidos se denominan proteínas
(polipéptidos). Las proteínas estas compuestas por aminoácidos naturales
ordenados en una secuencia discreta y unida entre sí por enlaces peptídicos que
siempre involucran los radicales amino y carboxilo de cada aminoácido, lo cual da
lugar a un enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas características
peculiares como (Koolman & Röhm, 2004):

a) El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez
a la molécula.
b) El oxígeno y el nitrógeno quedan en posición trans.
c) Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el
mismo plano.
d) La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos alfa.

El proceso de la síntesis protéica se da siempre en la célula, dónde los aminoácidos

se van uniendo sucesivamente uno tras uno, solamente se utilizan los L-
aminoácidos. El grupo carboxilo de un aminoácido se une al grupo α – amino de un
segundo aminoácido, formando un enlace peptídico y liberando agua (Müller –
Esterl, 2008) (Figura 1).

Figura 1.- Formación de un enlace peptídico

La variabilidad de las proteínas se debe a una serie de aspectos tales como:
complejidad estructural, residuos aminoacídicos que la forman, propiedades
químicas y físicas y funciones específicas de cada proteína en el organismo que la
contiene, estas proteínas pueden llegar a pesar hasta 5000 D (Daltons).

3
Toda organización estructural que implique determinado orden requiere de la
presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría
constituida por diferentes tipos de enlaces o interacciones físicas y químicas que se
enuncian en el cuadro siguiente (Müller – Esterl, 2008; Voet & Voet, 2006):

NIVEL DE ORGANIZACIÓN ENLACES QUE LO MANTIENEN

Primario Enlace peptídico
Secundario Puentes de hidrógeno entre los
elementos del enlace peptídico
Terciario Puentes de hidrógeno entre las cadenas
laterales de los aminoácidos,
interacciones hidrofóbicas,
electrostáticas, puentes disulfuro, enlace
éster
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario,
más las fuerzas de Van der Walls

La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista

funcional en una gran diversidad de funciones biológicas: Enzimas, proteínas
estructurales, de transporte, contráctiles, acción hormonal, de reservas (Peña, et
al., 2004).

Métodos para cuantificación de proteínas

Existen diversas técnicas de detección y cuantificación de proteínas algunas más
complicadas que otras y algunas más confiables que otras. A continuación, se
muestra una tabla con los métodos más utilizados:

Método Ventajas inconvenientes

Métodos de absorción No se pierden las Interfieren muchos
muestras compuestos que absorben
en el UV
Métodos Derivados Colorimétricos
Biuret Bastante específico para Tiene poca sensibilidad
proteínas
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Lowry Tiene bastante No todas las proteínas
sensibilidad reaccionan igual

4
 Muestra muchas
interferencias como
detergentes no iónicos,
sulfato amónico, etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con
detergentes
BCA Es el método más sensible
Es el que muestra menos
interferencias
Métodos Derivados Fluorimétricos
o- ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas
contaminantes en la
muestra
No todas las muestras
reaccionan igual

De todas las antes mencionadas, Una de las reacciones más utilizadas es la de

Biuret; en esta reacción, el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que
contienen dos o más enlaces peptídicos, ya que el radical carbamilo que se forma
en el enlace peptídico es muy afín a los iones de cobre (figura 2). Se le da el nombre
de Biuret porque este es un compuesto que da una reacción típicamente positiva
con el sulfato de cobre alcalino. La formación del color violeta es directamente
proporcional al número de enlaces peptídicos que contenga la proteína y no es
sensible a péptidos (Clark J.,1964)

Figura 2.- Formación del complejo coloreado por Biuret

OBJETIVO
Al término de esta práctica, el alumno deberá ser capaz de describir algunas de las
técnicas de detección cualitativa de proteínas en base a los componentes de su
estructura.

5
MATERIAL
• 10 tubos de ensaye
• Una gradilla
• Un vaso de precipitado
• Una pizeta con agua destilada
• Una pinza para tubos de ensaye
• Ocho pipetas de 1 o 2 mL
• Cuatro propipetas de 2 mL

REACTIVOS
• Ácido nítrico concentrado (HNO3)
• Hidróxido de Sodio 5N
• Reactivo de Biuret, Proteínas
• Proteínas 1% (Albúmina, Peptona, Gelatina)
• Tirosina 1 %

MÉTODO
1. Se colocan los 5 tubos de ensayo en la gradilla para cada experimento
2. Se etiqueta con un pedazo de cinta para poder identificar cada tubo.
Experimento No.1 Reacción Xantoprotreíca
3. En el tubo 1 se colocó 1 mL de Agua destilada
4. En el tubo 2 se colocó 1 mL de Albúmina
5. En el tubo 3 se colocó 1 mL de Gelatina
6. En el tubo 4 se colocó 1 mL de Peptona
7. En el tubo 5 se colocó 1 mL de Tirosina

6
8. Se coloco 1 mL de HNO3 a cada uno de los tubos de ensayo (evitando que
la pipeta toque los reactivos)
9. Mezclamos los reactivos y calentamos a baño de agua de ebullición durante
5 minutos y posteriormente enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos
10. Se coloco por estratificación y sin mezclar 0.5 mL de hidróxido de sodio 5N
a todos los tubos

11. Por último, al dejar reposar observamos la formación de un anillo color

naranja en la interfase lo cual significa que es un resultado positivo

Experimento No.2 Reacción de Biuret

1. En el tubo 1 se colocó 1 mL de Agua destilada
2. En el tubo 2 se colocó 1 mL de Albúmina
3. En el tubo 3 se colocó 1 mL de Gelatina

7
 4. En el tubo 4 se colocó 1 mL de Peptona
5. En el tubo 5 se colocó 1 mL de Tirosina

6. Se coloco 1 mL de biuret a cada uno de los tubos (evitando que la pipeta

toque los reactivos)
7. Se agito y se dejó reposar todos los reactivos por 5 minutos
8. Se observo la coloración y su intensidad

RESULTADOS
Tabla I. Resultados del experimento No.1 y experimento No.2
Experimento Agua Albúmina Peptona Gelatina Tirosina
destilada
Reacción
Xantoproteíca (-) (+) (-) (-) (+)
Reacción de Azul - Morado - Morado Morado - Azul -
Biuret intensidad intensidad azulado - intensidad intensidad
baja alta intensidad media baja
baja

En el experimento no.1, no se observó coloración ni cambio en el agua destilada,

peptona y gelatina; solo en la albúmina y tirosina se observó una leve coloración
amarilla-naranja, con una reacción positiva, y la albúmina presentó leve densidad.
En el experimento no.2, en el agua destilada y tirosina presentaron una coloración
azulada con baja intensidad, la albúmina obtuvo una coloración morada de alta

8
intensidad, la peptona presentó una coloración morada con tono azulado, y de baja
intensidad. Por último, con la gelatina se observó una coloración morada con una
intensidad media.

Figura 3. Resultados del experimento No.1 y experimento No.2.

DISCUSIÓN
El Reactivo de Biuret contiene hidróxido de potasio, sulfato cúprico (CuSO4) y
tartrato de sodio y potasio. Este reacciona a los enlaces peptídicos, estos son los
enlaces covalentes que unen los aminoácidos en las proteínas. En presencia de
enlaces peptídicos, los iones Cu2+ del sulfato cúprico reaccionan con los átomos de
nitrógeno en los enlaces peptídicos. Se forma un complejo entre los iones Cu2+ y
los enlaces peptídicos, este complejo da lugar a un color violeta o púrpura (Cuanta
más intensidad del color violeta se puede utilizar para estimar la concentración de
proteínas en la muestra). La prueba de Biuret es específica para proteínas y
polipéptidos.

Tabla II. Peso molecular y compocicion de aminoacidos

Peso molecular Composición de

aminoácidos
albumina 32.03 g/mol Alanina
Cisteína
Ácido aspártico
Ácido glutámico
Fenilalanina
Peptona 28.79 g/mol Alanina
Cisteína
Ácido aspártico
Ácido glutámico
Fenilalanina
Gelatina 22.28 g/mol Alanina
Cisteína

9
 Ácido aspártico
Ácido glutámico
Fenilalanina
Tirosina 181.19 g/mol Alanina
Cisteína
Ácido aspártico
Ácido glutámico
Fenilalanina

El Biuret se basa en la reacción del sulfato de cobre con compuestos que tengan
dos o más enlaces peptídicos en un medio alcalino. El producto es un color violeta
cuya intensidad de color depende de la cantidad de enlaces peptídicos presentes.
En este experimento dio resultado de dos tubos que reaccionaron positivamente
presentando el tubo con peptona un violeta claro y los tubos con albumina y gelatina
un violeta más intenso, esto debido a la cantidad de enlaces peptídicos presentes
en cada uno. (Vejar, 2005) La gelatina, según (Dumitriu Y Popa, 2013), es una
proteína derivada del colágeno compuesta de prolina, hidroxiprolina, entre otros.
Este consiste de tres cadenas polipeptídicas, y es por esto que reaccionó con el
reactivo de Biuret.

La Xantoproteica reacciona con el ácido nítrico (en este caso HNO3), presentando
un cambio de color amarillo, el cual se intensifica al estar en un medio alcalino.
(Vejar, 2005), Posteriormente al agregar el hidróxido de sodio logramos obtener una
coloración naranja en la interfaz. De acuerdo a (Anjana et al, 2012), existen cuatro
aminoácidos aromáticos que se encuentran en las estructuras proteicas:
fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina. Un aminoácido aromático, como la
prolina, contiene un anillo aromático que es proporciona mayor estabilidad. Los
aminoácidos presentes en la peptona y en la gelatina no presentan ningún anillo
aromático.

A nivel clínico es más confiable la prueba con biuret ya que es mas sencillo de
elaborar y rápido.

CONCLUSIÓN
La importancia del conocimiento de las diferentes técnicas para las reacciones de
identificación de proteínas es fundamental para la comprensión de los procesos y el
funcionamiento de las proteínas asi como su reacción ante diferentes pruebas en el
laboratorio, el conocimiento de estas pruebas nos es fundamental para la detección
de proteínas. Al momento de la practica pudimos observar diferentes resultados en
cada una de las pruebas siendo mayormente positivas dado a que se observaron
los cambios de color característicos a la prueba, tan solo siendo en 2 en lo que se

10
observó una mayor coloración siendo de un morado intenso y bajando la tonalidad
hasta un leve violeta, asi como 2 de ellas esto siendo observado en la figura 3.

CUESTIONARIO
1. Mencione y describa dos reacciones que sean análogas a la
xantoproteica.
a. Reacción de Biuret
i. Esta reacción detecta la presencia de enlaces peptídicos, que
son característicos de las proteínas. En la reacción de Biuret,
se forma un complejo de color violeta cuando el reactivo de
Biuret (una solución de hidróxido de sodio y sulfato de cobre)
se añade a una solución que contiene proteínas. Esta
reacción es positiva en presencia de polipéptidos de cadena
corta.
b. Método de Bradford
i. Este método se basa en la unión de un colorante azul-naranja
a una proteína para formar el complejo colorante-proteína. El
colorante utilizado en este método es el azul de Coomassie,
que se une a las proteínas en presencia de ácido.

2. Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar proteínas

a. método de Bradford
i. Este método se basa en la unión de la tinción azul Coomasie a
las proteínas. La medición de la absorbancia se compara con
los valores de una curva estándar para determinar la
concentración de proteína de la muestra
b. método de Lowry
i. Se basa en la unión de iones Cu2+ en el medio alcalino al
enlace péptico con aminoácidos que contienen grupos
fenólicos en su estructura, produciendo una coloración azul de
la muestra proporcional a la concentración de proteína
presente en él.

3. Describa el método de Sanger y mencione qué papel juega en la

identificación de proteínas.
El principio de este método es la incorporación selectiva de dideoxinucleótidos
trifosfato (ddNTPs), estos nucleótidos carecen del OH en el extremo, por lo que si
se incorporan durante la síntesis se impide la incorporación de un nuevo nucleótido
y se termina la elongación de la cadena, de esta forma se generan fragmentos de
distintos tamaños que terminan en todos los nucleótidos de la molécula de ADN, los
cuales son separados por electroforesis para determinar la secuencia a partir del
ddNTP incorporado y el tamaño de los fragmentos (Ongay Larios, L. Códiz Huerta,
G. 2021. página 23).

11
 4. Defina el término Secuenciación proteica.
Según, (Danaher en Life Sciences), Permite el análisis de secuencias de
aminoácidos, la confirmación junto con la estructura y función de las proteínas. La
secuenciación proteica es el proceso de examinar la estructura covalente y la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido completamente desarrollado, que se
considera un componente de las modificaciones

5. Mencione tres reacciones de identificación que se utilicen en la

secuenciación de proteínas.
Según, (Danaher en Life Sciences)
1) Reacción de edman
2) Ruptura de polipéptidos en pequeños fragmentos
3) Ruptura química de las proteínas

6. Analice detalladamente una técnica que se utilice para secuenciar a las

proteínas.

Según, (Chicano, E en 2011) El procedimiento de la degradación de Edman o

secuenciación de Edman marca y elimina sólo el residuo N-terminal de un
polipéptido, dejando el resto de enlaces peptídicos intactos. Para ello, se hace
reaccionar el péptido con PITC eliminándose el residuo N-terminal en forma de
derivado de fenilhidantoína (PTH). Después de la eliminación e identificación del
residuo N-terminal mediante HPLC, el nuevo residuo N-terminal puede ser marcado,
eliminado e identificado por repetición de la misma serie de reacciones. Este
procedimiento se repite hasta que se ha determinado toda la secuencia.

Figura 4. Proceso de degradación de Edman

12
 7. Describa la técnica de Millón y especifique el tipo de proteínas que
puede identificar.
Según, (el trabajo práctico Nº3 Proteínas, peptidos y aminoácidos, s.f), Es
específica para grupos fenólicos, por lo tanto dan positivo todas las sustancias que
poseen esta estructura, por ejemplo, la tirosina. En una primera instancia se procede
a la nitración del anillo fenólico con el ácido nítrico del reactivo. La tirosina nitrada
forma complejos con los iones mercurio Hg (I) y Hg (II) del reactivo produciendo un
precipitado rojo o una solución roja, ambos resultados positivos (a veces se observa
un precipitado blanco, que debe calentarse para que vire a la coloración roja).

Reactivo de Millon (preparación según Farmacopea Nacional Argentina 7° Ed.):

transferir 2 ml de mercurio a un erlenmeyer, agregar 20 ml de ácido nítrico. Agitar el
erlenmeyer bajo campana extractora para deshacer el mercurio en pequeños
glóbulos. Luego de aproximadamente 10 minutos agregar 35 ml de agua destilada
y, si aparece un precipitado o cristales, agregar ácido nítrico diluido (1 en 5,
preparado a partir de ácido nítrico al que se le hayan retirado los óxidos haciendo
pasar aire a través de él hasta que se torne incoloro) en cantidad suficiente para
disolver el sólido separado. Agregar una solución de hidróxido de sodio (1 en 10)
gota a gota, mezclando minuciosamente, hasta que el precipitado grumoso que se
forma luego del agregado de cada gota ya no se redisuelva, pero se disperse para
formar una emulsión. Agregar 5 ml de ácido nítrico diluido y mezclar.

BIBLIOGRAFÍAS
• Vejar, E. (2005) Prácticas de Bioquímica Descriptiva. España: UniSon.
• Dumitriu, S., Popa, V., (2013) Polymeric Biomaterials: Structure and function,
Vol. 1,CRC Press, pp.920
• Anjana, R. et al (2012), Aromatic-aromatic interactions in structures of
proteins and protein-DNA complexes: a study based on orientation and
distance, Bioinformation. 8(24):1220-1224.
• Trabajo práctico no3 proteínas, péptidos y aminoácidos. (s. f.).
Farmacognosia. http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/farmacognosia/wp-
content/uploads/2017/03/TP3-_PROTEÍNAS-PEP-AA-2017.pdf
• Farmacopea Argentina, 7° Ed., 2003.
www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/fra.asp
• Danaher Life Sciences. (s. f.). Protein Sequencing: Methods, Technologies &
Applications
Sciences. https://lifesciences.danaher.com/us/en/library/protein-
sequencing.html

13
 • Chicano, E. (2011, 17 octubre). Secuenciación de Edman.
ProteomePlus. https://proteomeplus.wordpress.com/2011/10/12/secuenciaci
on-de-edman/
• Vázquez-Jorge, Yanira G.; Guerra-Molina, Leticia; Quintana-Tamayo, Jabiel F.;
Ramírez Arzuaga, J.; Fernando-Ballestero, Rafael; Vázquez-Jorge, Yahumara.
(2014). Caracterización físicoquímica y contenido de proteínas de extractos fluidos
del ostión de mangle (Crassostrea rizophorae). Revista Cubana de Química, vol.
XXVI, núm. 1, enero, 2014, pp. 66-74.
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=443543737009
• TORRES CABRA, E. HERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ, J. PERÉZ RUBIANO, C.
(2013). Cuantificacion de proteinas totales en extractos crudos de cepas nativas
de Bacillus thuringiensis aisladas de boyaca y cundinamarca. Facultad de Ciencias
Agrarias, Conexión Agropecuaria JDC - Vol III No. 2 - Julio - diciembre 2013 • pp.
37-43
• Abyntek Biopharma. (enero 2 del 2023). 5 metodos para cuentificar proteinas.
Abyntek Biopharma. https://www.abyntek.com/5-metodos-para-cuantificar-
proteinas/
• Ongay Larios, L. Códiz Huerta, G. (2021) Secuenciación de ADN por el método de
terminación de la cadena de Sanger. Unidad de Biología Molecular, Instituto de
Fisiología Celular, UNAM. http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-
content/uploads/2021/06/6-Ongay-Larios-secuenciacion.pdf

14