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GUA N 5

Cuantificacin de Protenas por el Mtodo de Bradford

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de


laboratorio ampliamente utilizada en diferentes contextos, como por ejemplo: durante la
purificacin de una protena concreta, cuando se necesita conocer la actividad especfica
de una preparacin enzimtica o como marcador para el diagnstico de enfermedades,
entre otros.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas, muchos de estos se basan


en las siguientes propiedades de las protenas:

I. son capaces de absorber luz en el rango UV.


II. son capaces de formar derivados qumicos.
III. son capaces de unir ciertos colorantes.

En relacin a las propiedades mencionadas anteriormente, (I) la determinacin de


absorbancia en el rango UV a 280 nm permite cuantificar protenas basndose en la
capacidad de los aminocidos triptfano, tirosina y fenilalanina (aminocidos aromticos)
de captar esa longitud de onda. De esta forma, como es de esperar la concentracin de
una protena calculada por absorcin a 280nm depende directamente de la proporcin de
estos aminocidos en su cadena. (II) Mediante la formacin de derivados coloreados de
las protenas, base de los mtodos de BIURET o de LOWRY, en los que se forma un
complejo coloreado de cobre con el enlace peptdico; en el mtodo de Lowry, adems del
complejo anterior tambin se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la
absorbancia total. Otro mtodo es el uso del reactivo de Bradford, el cual ser utilizado en
el prctico y se detalla ms adelante.
A modo de resumen en la Tabla I se recogen los mtodos ms usados para cuantificar
protenas as como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos mtodos tiene sus
ventajas e inconvenientes, y son usados para distintas aplicaciones, las principales se
recogen en la Tabla II.
Como se mencion anteriormente, en el prctico se utilizar el mtodo de Bradford, el
cual emplea un colorante hidrofbico (Coomassie Blue G-250) cuyas disoluciones
acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo, sin embargo al
encontrarse en un medio hidrofbico al interior de una protena (complejo protena-
colorante), origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente mediante
espectrofotometra (posee un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre y la
absorcin del colorante cambia de 465 nm a 595 nm). En este mtodo la interaccin entre
el colorante hidrofbico y el sutrato es relativamente sensible a la presencia de
contaminantes tales como detergentes y lquidos orgnicos como el metanol lo que
representa una desventaja. Por otro lado, su principal ventaja es la rapidez y facilidad en
el procedimiento y la mayor sensibilidad en comparacin a la absorbancia a 280 nm.

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Para determinar la concentracin de protenas totales presente en una muestra mediante
Bradford, es necesario interpolar en una curva de calibracin la cual es llevada a cabo
utilizando una protena patrn de concentracin conocida, la cual suele ser la Albmina
Srica Bovina.

Tabla I. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus rangos de


sensibilidad

MTODOS RANGO DE SENSIBILIDAD (g)


Absorcin
A280 100-3000
A205 3-100
A280 - A260 100-3000
A235 - A280 25-700
A224 - A236 5-180
A215 - A225 2-45
Derivados colorimtricos
Biuret 1000-10000
Lowry 25-100 a 500 nm
2-30 a 660 nm
1-2 a 750 nm
Bradford 1-15
BCA 0.5- 10
Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehdo 1-5 excitacin a 340 nm
emisin a 475 nm

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Tabla II. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, principales ventajas e
inconvenientes

MTODO VENTAJAS INCONVENIENTES


ABSORCIN
280 nm No se pierden las muestras Interfieren muchos compuestos que
absorben en el UV
DERIVADOS COLORIMTRICOS
Biuret Alta especificidad. Baja sensibilidad
Pocos interferentes
Bajo costo
Lowry Alta sensibilidad No todas las protenas reaccionan igual
Muchos interferentes (detergentes no
inicos, sulfato amnico)
Bradford Alta sensibilidad Interferencias con detergentes
BCA Alta sensibilidad (por sobre Existen algunos interferentes en la
los dems mtodos) medicin. *** El que tiene menos
interferentes ***
DERIVADOS FLUORIMTRICOS
o-ftalaldehido Alta sensibilidad La interferencia de aminas
contaminantes en la muestra
No todas las muestras reaccionan igual

PROTOCOLO

OBJETIVO

Realizar extractos totales de clulas HeK293T y determinar la concentracin de protenas


totales obtenidas.

MATERIALES

1- Clulas HEK293T: esta lnea celular adherente proviene de clulas de rin


humano embrionario las cuales fueron extradas y transformadas viralmente para su uso
en investigacin. Estas clulas son muy fciles de crecer y transfectar por lo cual son
usadas en una variedad de aplicaciones cientficas. En este prctico se harn cultivos en
placas de 60 mm para despus estimular la va Wnt con distintas concentraciones de litio
y as poder ver la acumulacin de la protena -Catenina mediante Western Blot.
2- Va Wnt/-catenina: La va de sealizacin Wnt/-catenina es conformada por
una red de protenas que transducen una seal desde receptores de membrana en las
clulas al ncleo, permitiendo finalmente controlar la expresin gnica. Esta va se ha

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visto que participa en la regulacin de proliferacin/diferenciacin, procesos
regenerativos, mantenimiento de clulas madres y su disfuncin lleva a enfermedades
degenerativas y cncer. En s, -catenina es la responsable de la entrada al ncleo y la
activacin de genes de respuesta a Wnt. Por esta razn mutaciones en -catenina o en
esta va llevan a la sobreexpresin de los genes blancos. Una forma de activar la va Wnt
es induciendo la estabilizacin de -catenina en las clulas, lo que se realiza estimulando
las clulas con Cloruro de Litio (LiCl).

3- Buffer de lisis celular: Est diseado para promover una lisis rpida y total de las
clulas en cultivo sin la necesidad de raspado o ciclos de congelamiento y
descongelamiento.
4- Reactivo de Bradford: se prepara mezclando 10 mg de Comassie Blue G-250
con 10 ml de cido fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Se aade H2O hasta 100
ml. Se filtra a travs de papel de filtro y se guarda en oscuridad.

5- Patrn de albmina. Preparar BSA a una concentracin de 1 mg/ml. Diluir desde


una solucin stock de 10 mg/ml.

Protocolo Extractos Totales

1. Descartar el medio de cultivo de las placas (HEK293) y realizar un lavado con 2


mL de PBS 1x.

2. Agregar 300 l de buffer de lisis por placa. Re-pipetear para homogenizar y llevar
a un tubo de 1,5 ml. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.

Comenzar con el Mtodo de Bradford

Blanco: Este tubo no contiene protenas, se reemplaza la muestra por agua y se le


agrega el correspondiente volumen de reactivo de Bradford. Se realiza para determinar la
absorbancia basal del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los
tubos con muestra.

Curva de calibracin: Para su realizacin se utilizarn soluciones de concentraciones


conocidas de protena (BSA). Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo
la cantidad de protenas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva
de calibracin (grfico g de protena vs A595). Es necesario realizarla cada vez que se
procesen las muestras.

Muestra: Se procesa en simultneo y en las mismas condiciones que la curva de


calibracin. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los

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anteriores. Para conocer la cantidad de protenas de la muestra (g), se determina la
absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibracin.

1. Preparar la curva patrn de albmina de suero bovina (BSA) en un rango desde 0


hasta 10 g; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de 1000 l. Mezclar
para ello el volumen adecuado de la disolucin madre de BSA de un 1 g/l y el
correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla:

#TUBO CONCENTRACIN H2O BSA MUESTRA* REACTIVO Abs. PROTENA


(g/ml) (l) (l) (l) DE 595 (g)
BRADFORD nm
(l)
I 0 800 -------- ---------- 200
II 2 798 2 ---------- 200
III 4 796 4 ---------- 200
IV 6 794 6 ---------- 200
V 8 792 8 ---------- 200
VI 10 790 10 ---------- 200

VII Desconocida 798 ---------- 2 200

* La muestra corresponde al lisado de protenas totales obtenidas desde clulas HEK293

2. Una vez realizadas las mezclas, incubar 5 minutos a temperatura ambiente en


oscuridad (cubrir con papel metlico - alusa foil -).

3. Medir la absorbancia de las muestras y completar la tabla con los valores


obtenidos. Realizar el grfico g de protena vs A595.

4. El valor de abosorbancia obtenido para la muestra, se debe interpolar en la Curva


de calibracin, para obtener as la concentracin

REFERENCIA
BRADFORD, M.M.; A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-
254 (1976).

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