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Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 1

Universidad de San Carlos de Guatemala Área Básica Bioquímica Licenciado Julio Turcios

REPORTE DE LABORATORIO ´MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNASµ

Anelena Ferrigno Cruz Carmen María de León Castillo Angel Michel García Vásquez Karla Paola Castillo Burmester Mónica Christaly Martínez López

2004 2008 2008 2008 200817299

Hay un sinfín de usos para los aminoácidos que sería difícil hacer una lista de cada uno de sus usos. que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminoácidos. El objetivo general planteado para este laboratorio fue: Identificar de forma cualitativa la presencia de determinados componentes en aminoácidos. conservación del equilibrio de nitrógeno y dióxido de carbono e incluso para la elaboración de peinados. por lo tanto. sin embargo. Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y fue el primero en utilizar este término. Las proteínas son parte de las sustancias de mayor abundancia en el organismo. proteínas o carbohidratos. . Existen otros métodos como el uso de reactivos para identificar aminoácidos y proteínas como el de Biuret. a un hidrógeno y a una cadena (habitualmente denominada R) de estructura variable. están formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo. Los aminoácidos pueden ser útiles para producir energía. Los objetivos específicos planteados fueron: Identificar de forma cualitativa la presencia de grupos alfa amino o aminas secundarias en aminoácidos. el cepillado dental. Dos aminoácidos se combinan en una reacción de condensación que libera agua formando un enlace peptídico. el desayuno. son de vital importancia para la supervivencia. Pero ¿Qué son aminoácidos y proteínas? Químicamente hablando. enlaces peptídicos en proteínas o grupos reductores en los carbohidratos. los aminoácidos y proteínas se pueden encontrar en la vida cotidiana. Se le llama proteína a aquellas cadenas que contienen más de 50 aminoácidos. Estamos involucrados con productos y procesos que involucran la presencia de aminoácidos y proteínas. los aminoácido son moléculas orgánicas con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 2 INTRODUCCIÓN Al hablar de aminoácidos y proteínas se tiene la idea de sustancias en un la boratorio químico. pero cual sea el método que se utilice todos tienen la característica de ser de fácil uso. se puede deducir que tanto aminoácidos como proteínas. hoy podemos identificar de manera sencilla los aminoácidos y proteínas en sustancias por medio de cromatografía. aisladas y únicamente al alcance de profesionales. Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son alfa-aminoácidos. a un grupo amino. Gracias a las investigaciones de científicos involucrados con estas sustancias como el botánico ruso Mikhail Tswett. etc. Desde tempranas horas del día. Los aminoácidos más frecuentes y de mayor interés son aquellos que forman parte de las proteínas. tomar un baño. Por lo tanto. Benedict o ninhidrina. ácido).

ninhidrina y Benedict. y procesos como la cromatografía en papel. Para la realización de los objetivos planteados se utilizaron series de reacciones con base a reactivos como Biuret. .Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 3 - Determinar la composición química de los reactivos y la reacción que sucede en cada una de las sustancias utilizadas. algunas sustancias dieron la prueba positiva y otras la dieron negativa. así como algunas sustancias para determinar su contenido de aminoácidos. Se utilizaron otras sustancias extras como el jarabe Medox ABC y Alicol D. proteínas o azúcares reductores.

y una fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. en este caso. Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y se seca.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 4 Resumen CROMATOGRAFÍA EN PAPEL: Proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos. Se colocara la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo. no requiere de ni un tipo de equipo extraordinario y es una técnica muy eficiente. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. se debe a la característica de su polaridad este impide el rompimiento del papel. Cuenta con dos fases una fase móvil. La preferencia en el uso d el papel whatman 1. Se recurrió al uso de cromatografía en papel ya que es más fácil y rápido en su aplicación además de observación de las reacciones. . Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. la ninhidrina es sumamente útil para revelar aminoácidos.

Al momento de sembrar la muestra se requirió el uso de capilares para tener una muestra más exacta. La Cisteina hizo que la mezcla de ambos aminoácidos corriera mas pero al mismo tiempo la Gluteina impidió que siguiera avanzando esto se debe a la diferencia de los pesos moleculares que existe entre ellas. Era importante secar la fase estacionaria porque se tenía que revelara con ninhidrina. si el papel de la fase estacionaria toca las paredes. en . Todos los trazos se hicieron a lápiz porque si se usaba lapiceros hubiera reaccionado con los aminoácidos impidiendo la observación de los mismos debido a la tinta orgánica de los lapiceros. Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase móvil era necesario colocarse guantes debido a los componentes químicos que podrían afectar la mano. lo único importante era colocar la misma cantidad de aminoácidos en cada punto. rompiendo la estructura requerida de la fase estacionaria. el papel que las recubre absorbe fácilmente el agua ya no se puede observar con claridad el avance de los aminoácidos. Las paredes internas de la cámara se revistieron con papel alto en celulosa. Obteniendo así la coloración de los aminoácidos. Esto previno que las que la presión externa de la cámara interviniera en los procesos cromatográficos. El orden de la siembra de las muestras no afectaba nuestros resultados. La cisteína corrió mas debido a su bajo peso molecular. porque si hubiéramos utilizado masking tape se hubiera despegado. La fase estacionaria no toca la cámara cromatográfica porque está saturada de agua (para la adherencia) en sus paredes. Para llevar a cabo esto se tomaron 6 tubos de ensayo. disminuyendo así la cantidad de los eluentes para evitar la reacción de los mismos. Al momento de realizar fase móvil tuvimos el cuidado de que la cámara estuviera tapada para que no se contaminara o no reaccionara con ot ro compuesto. y no contaminar el papel de la fase estacionaria. y la Gluteina corrió menos debido a su alto peso molecular. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: REACCIÓN DE BIURET: La Reacción de Biuret se utiliza para detectar la presencia de proteínas. La fase estacionaria se doblo hacia fuera para que las muestras de los aminoácidos no entraran en contacto entre ellos (y así fuera más fácil la absorción de la fase móvil) colocándole grapas en los extremos para unirlos. En la combinación de los aminoácidos se puede observar que su recorrido es el promedio de los recorridos de la Cisteina y la Gluteina. péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 5 La línea trazada más importante fue la inferior que media 2cm esto nos daba la pauta de inicio de los aminoácidos.

La ninhidrina reacciona rápidamente con el grupo amino. Para determinar esto. lo oxida y libera amonio el cual se condensa con la ninhidrina reducida. REACCIÓN DE BENEDICT: . se mezcló vigorosamente cada uno de los tubos y se dejaron reposar por 15 minutos para observar los cambios sucedidos en la intensidad de color con el transcurso del tiempo. Se colocaron 10 gotas en cada tubo de las siguientes sustancias: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 2: 10 gotas de gelatina + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 3: 10 gotas de caseína + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 4: 10 gotas de albúmina + 10 gotas de Na OH + 10 gotas de Biuret Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Luego. se mezclaron y se colocaron 5 minutos en baño maría para observar los cambios de coloración que hubo debido a la presencia de calor. para producir un producto púrpura .Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 6 cada uno de ellos se colocaron diversas sustancias para verificar la presencia o ausencia de enlaces peptídicos. se utilizaron 6 tubos de ensayo con diversas sustancias dentro de ellos de la siguiente manera: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de solución de ninhidrina Tubo 2: 10 gotas de cisteína + 10 gotas de solución de ninhidrina Tubo 3: 10 gotas caseína + 10 gotas de solución de ninhidrina Tubo 4: 10 gotas de albúmina + 10 gotas de solució n de ninhidrina Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solución de ninhidrina Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solución de ninhidrina Teniendo los 6 tubos de ensayo con las sustancias debidas. REACCIÓN DE NINHIDRINA: La Reacción de ninhidrina cuantifica la reacción de los aminoácidos del grupo alfa amino. y con otra molécula de ninhidrina libre.

que precipita de la solución alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. y celobiosa. Al igual que los dos reactivos anteriores. la glucosa. pueden reducir el Cu 2+ que tiene color azul a Cu +. como la lactosa. En soluciones alcalinas. la maltosa. se utilizaron 6 tubos de ensayo con diversas sustancias para verificar la existencia de azúcares reductores de la siguiente manera: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de solución de Benedict Tubo 2: 10 gotas de glutamina + 10 gotas de solución de Benedict Tubo 3: 10 gotas de caseína + 10 gotas de solución de Benedict Tubo 4: 10 gotas de albúmina + 10 gota s de solución de Benedict Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solución de Benedict Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solución de Benedict Se mezcló la solución formada en cada uno de los tubos y se expusieron 5 minutos a baño maría para observar los cambios en cuanto a color que sucedieron debido a la presencia de calor.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 7 La reacción de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos que tienen su OH anomérico libre). .

una superior de color café oscuro y otra inferior de color amarillo suave. La solución se encontraba dividida en dos partes. una superior de color morado oscuro.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 8 RESULTADOS REACCIÓN DE BIURET REACCIÓN DE NINHIDRINA Tubo 1 2 contenido 10 gotas de agua + 10 gotas de ninhidrina 10 gotas de cisteína + 10 gotas de solución de ninhidrina Resultado Solución incolora. La solución presentaba dos coloraciones. Solución con color celeste. y una inferior de color amarillo. Solución de color blanco y apariencia lechosa. 3 10 gotas de caseína + 10 gotas de solución de ninhidrina 4 5 10 gotas de albúmina + 10 gotas de solución de ninhidrina 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solución de ninhidrina 6 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solución de ninhidrina Reacción de Benedict Tubo 1 2 Contenido 10 gotas de agua + 10 gotas de solución de Benedict 10 gotas de glutamina + 10 gotas de solución de Benedict Resultado Solución con color celeste muy suave. una superior de color azul oscuro y un residuo al fondo del tubo de ensayo de coloración blanca. 3 10 gotas de caseína + 10 gotas de solución de Benedict . Solución color rojo. La solución presentó dos coloraciones. aunque una tonalidad más oscura que la solución del tubo 1. una inferior café y una superior café oscuro. transparente. La solución presentaba dos coloraciones.

Solución color amarillo fuerte. transparente. Solución color café oscuro.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 9 4 5 6 10 gotas de albúmina + 10 gotas de solución de Benedict 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solución de Benedict 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solución de Benedict Solución color café. .

Este producto colorido. péptidos y proteínas. Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos. Calentar en presencia de ninhidrina produce la desaminación oxidativa de los grupos amino lo que implica la reducción asociada de la molécula de ninhidrina.violeta. con los aminoácidos en medio ácido (pH entre 3 y 4) dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. . llamado púrpura d e Ruhemann. La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm. El cálculo de la concentración se basa en la relación de Beer-Lambert. se estabiliza por resonancia. El método se basa en la reacción entre la ninhidrina y el grupo -amino de aminoácidos. estos son amarillos t tienen su máxima absorción a 440 nm. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 10 DISCUSIÓN DE RESULTADOS CROMATOGRAFÍA EN PAPEL: REACCIÓN BIURET: REACCIÓN DE NINHIDRINA: La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis. dand o un compuesto coloreado azul o azul . también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.

La prolina y la oxiprolina reaccionan con la ninhidrina. aunque su valor varía de un aminoácido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del análisis. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol. Tubo 1: El resultado fue una solución incolora debido a que el agua carece de péptidos y de grupos alfa amino. pero dan un positivo de color amarillo. se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla. así como en la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por electroforesis o por cromatografía. aminas ácidas y algunos otros compuestos. por lo tanto. La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos. no es un aminoácido y la prueba es negativa.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 11 La ninhidrina reducida reacciona con el amonio y con otra ninhidrina oxidada para dar ligar a un compuesto coloreado llamado azul .violeta de Ruhermann. cuando se añade 2. Sin embargo. En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado. Durante este proceso. La reacción entre un aminoácido y la ninhidrina es: Todos los tubos de ensayo fueron expuestos a baño maría durante 5 minutos con el objetivo de producir una desaminación oxidativa de los grupos amino de las sustancias utilizadas y su reducción asociándose con la molécula de ninhidrina. las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos. las sustancias liberaron diversos aromas debido a la presencia de grupos aromáticos en la solución de ninhidrina. La reacción de la ninhidrina puede dar positivo con ciertas aminas. Tubo 2: El resultado fue una solución de coloración amarilla debido a la presencia de aminas secundarias y resultan en una sal de imino y la coloración café se debe a la ausencia de .4-6colidina.

REACCIÓN DE BENEDICT: Una de las reacciones más comunes en la identificación de carbohidratos es la reacción de Benedict. este color identifica la presencia de grupos alfa amino en la solución. Tubo 6: El resultado fue una solución de color rojo. el morado oscuro indica que el medicamento llamado Medox ABC posee grupos amin o en sus diferentes componentes como la lisina y el color amarillo indica que no presenta grupos amino libros. por lo tanto la prueba es positiva. este color realmente no está representando nada. lo que implica que posee pocos grupos aminos libres para reaccionar. Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. La coloración dependerá de la concentración de óxido de cobre y ésta a . pero la sacarosa no los posee. lo que proporciona la coloración p ositiva de la reacción. la prueba es negativa. por lo tanto. sino que. Tubo 3: Se obtuvo como resultado una solución de color azul oscuro con un precipitado de color blanco al fondo del tubo de ensayo. así que la prueba es negativa. Tubo 4: El resultado fue una solución de color blanco con apariencia lechosa debido a que la solución de ninhidrina no pudo identificar ningún grupo alfa amino en la estructura debido a que la albúmina es una proteína que reaccionaría de mejor manera con alguna solución para identificar proteínas.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 12 grupos amino libres pero la presencia de un grupo amino en la cadena lateral. Los disacáridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres. por lo tanto. La caseína es una fosfoproteína. la glucosa. Todos los monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O. y celobiosa. La reacción o prueba de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos que tienen su OH anomérico libre) como la lactosa. presenta grupos imin o en las estructuras. sin embargo. ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando ésta es formada. así que se puede deducir que no hubo cambio de coloración. la maltosa. ya que la solución era originalmente roja. Tubo 5: Se obtuvo como resultado una solución de dos colore s. son suficientes para que la solución de ninhidrina los identifique y de un resultado positivo. no hay presenci a de grupos alfa amino en ningún lugar dentro de las estructuras de los componentes del medicamente Alicol D.

al igual que la solución en el tubo # 3. en presencia de un azúcar o carbohidrato que posea libre su grupo carbonilo. la prueba para identificar carbohidratos es positiva. El almidón no da esta reacción de oxidación de glúcidos. Tubo 2: La solución obtenida es de color celeste intenso. la prueba es negativa. va desde verde. que precipita rojo (ladrillo o terracota). la prueba es negativa. así que. amarillo. Por ejemplo la glucosa formará ácido glucurónico mientras el cobre precipita. Los disacáridos demoran en dar la reacción. hay ausencia de grupos reductores libres. el sulfato de cobre óxida el monosacárido al ácido correspondiente. por lo tanto se puede deducir que no es un carbohidrato debido a la ausencia de grupos reductores libres e n la estructura de la glutamina y el resultado es negativo. Tubo 3: El resultado obtenido fue una solución de dos col ores. es decir. se sabe que las pruebas positivas dan coloración desde verde a roja. Los almidones no darán esta reacción a menos que primero sufran hidrólisis. la prueba par a carbohidratos es negativa. dependiendo de la coloración. El color café no identifica ningún grupo reductor libre en su estructu ra.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 13 su vez de la reducción del cobre. Tubo 5: La solución de este tubo fue de color amarillo. el color celeste no se encuentra en esta clasificación. por lo tanto. Tubo 1: El resultado obtenido fue una solución de color celeste suave. Tubo 4: El resultado obtenido fue una solución de de color café suave. Tubo 6: . por lo tanto. La coloración amarilla se debe a que los carbohidratos se encuentran en un medio alcalino. uno inferior café y una acumulación densa superior de color café claro. por lo tanto. no se identificó ningún grupo reductor libre en la estructura de albúmina. se oxida el Cu+1 y se precipita en forma de Cu2O. mientras el cobre II se reduce a cobre I. lo cual indica que el medicamento llamado Medox ABC contiene grupos reductores libres en las estructuras de sus componentes debido a la presencia de algún edulcorante como la sacarosa. anaranjado o rojizo. sin embargo. En Todos los casos.

1 favorecen la captación y transporte de agua. Las interacciones del solvente y el soluto dieron a mostrar las características de cada aminoácido. El reactivo de Biuret se utiliza para detectar la presencia de proteínas. péptidos o simplemente enlaces peptídicos en sustancias acuosas dando una coloración rosada a violeta. mientras que las que se desplazaron más muestran menos afinidad al agua y más afinidad al solvente. por lo tanto la prueba es negativa. al dar un prueba positiva se presenta una coloración violeta o azul y este proceso se conoce como condensación de la ninhidrina. CONCLUSIONES La técnica de cromatografía en papel se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una fase móvil sobre una estacionaria que puede ser sólida o liquida. Las fibras rectas del papel cromatográfico Whatman no. . debido a esta coloración se puede deducir que hay ausencia de grupos reductores libres. La ninhidrina identifica grupos libres y grupos alfa amino en sustancias. Esta diferencia será la que nos permita tanto identificar cuantos componentes tiene una disolución como separarlos. Durante el uso de la ninhidrina ocurre un proceso de oxidación del grupo amino para liberar amonio. además conforme avanza el tiempo la corrida del papel variara dependiendo del peso de los aminoácido s a mayor peso más lento el recorrimiento a menor peso más veloz.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 14 El resultado obtenido fue una solución de col or café oscuro. El método de identificación por cromatografía en papel es efectivo ya que los elementos utilizados como eluentes son ideales para correr en el papel alto en celulosa y disolver los aminoácidos. Las sustancias que se movilizan menos en la fase estacionaria son las que tienen más afinidad al agua.

amarilla. Observar detenidamente las soluciones utilizadas para la identificación de aminoácidos. proteínas y azúcares fermentables ya que el cambio de coloración al pasar el tiempo es un indicio de que una reacción se está llevando a cabo. a una temperatura adecuada para que se puedan ver los resultados de la desaminación oxidativa de los grupos amino lo que implica la reducción asociada de la molécula de ninhidrina. . RECOMENDACIONES Al realizar la cromatografía en papel es de importancia tomar en cuenta las medidas de protección necesarias ya que algunas sustancias utilizadas como el ácido acético pueden causar graves irritaciones y quemaduras en la piel o en los ojos y llevar a daño ocular. Durante el proceso dentro de la fase estacionaria es de importancia colocar la disolución mediante instilación. Tomar en cuenta los 5 minutos exactos en baño maría. Mantener las ventanas abiertas para evitar la inhalación de cualquier sustancia y evitar daños en las vías respiratorias superiores. sino se hace de esta manera puede haber una saturación de disolución en la fase móvil. pero en las que lo hicieron sus resultados fueron totalmente claros.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 15 El reactivo de Benedict se utiliza para identificar azucares reductores en sustancias y da como respuesta positiva la coloración verde. naranja o rojiza. No todas las sustancias dieron la prueba positiva.

776 pp.analitica/qa_arch_matdi d/arch_teoria/Temas%20teoricos/Profesorado/Cromatografia. Valcárcel.edu. España. España. A. 2006. Segunda Edición. 2007.htm http://exa. Internet: http://latina. M. Primera Edición. Editorial Elsevier.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.ar/depar/areas/quimica/quimica. 1988. Pratt. Voet. Editorial Médica Panamericana.net/panreac/spanish/practicas/practicas25. 703 pp. Argentina.cinvestav.unne. Fundamentos de Bioquímica. 626 pp.patacake.pdf Revistas: .. John. Editorial Reverté S. Segunda Edición.Métodos de Identificación de Aminoácidos y Proteínas 16 BIBLIOGRAFÍA Libros: Bioquímica Médica. Técnicas Analíticas de Separación.htm http://www.chem. Baynes.