Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (Instituto de Ciencias Biomédicas)

Bioquímica Básica
Lic. Cirujano Dentista
Kristy Azeneth Talamantes Molina
213565

CUESTIONARIO PRACTICA DE LABORATORIO 5

REACCIÓN DE IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Mencione y describa dos reacciones que sean análogas a la xantoproteica.

Reacción de Biuret. En la reacción de Biuret se utiliza el reactivo de Biuret, el cual, es el sulfato cúprico
diluido en solución alcalina. Los compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos tales como
el Biuret (NH2CONHCONH2) y proteínas, forman complejos organometálicos con los iones cúpricos
para dar un color púrpura característica. Esta reacción es muy general, ya que todos los compuestos
con dos enlaces peptídicos unidos directamente o por medio de un átomo de carbono o nitrógeno
dan reacción positiva. (Hazan, 2015)

Este reactivo da un ensayo positivo con los enlaces peptídicos entre aminoácidos, cuando la solución
queda de color violeta. Esto se debe a que el cobre tiene la propiedad de formar iones complejos,
especialmente entre los enlaces peptídicos. En cambio, cuando la reacción de Biuret da negativa,
queda de color azul. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret,
un método colorimétrico, permite determinar la concentración de
proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-
visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ion
Cu2+). (Rodríguez, 2004)

Método de Bradford. Se basa en la unión de un colorante,

Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El Figura 1. Reacción de Biuret.
colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra
naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un
complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción
mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg),
simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación. Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas. (Fernández, 2017)

Las proteínas se unen al tinte en un ambiente ácido, induciendo

Figura 2. Método de Bradford.
un cambio espectral del color marrón (absorbancia máxima a 465)
al azul (absorbancia máxima a 610). Las interacciones hidrófobas e iónicas con las proteínas de la
muestra estabilizan la forma aniónica del tinte, provocando un cambio de color visible. El color azul
que se desarrolla es, por tanto, proporcional al contenido de proteínas y se puede medir
espectrofotométricamente en 595, una longitud de onda donde la diferencia de absorbancia entre
las dos formas coloreadas del tinte es mayor. (Escobedo, 2021)

2. Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar proteínas.

Cuantificación de proteínas por el método BCA. El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto
capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma
la base de un método analítico capaz de monitorizar el ion cuproso producido en una reacción entre
las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el
cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido,
sensible, y muestra gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. (Fernández, 2017)

Cuantificación por medio del método de Lowry. El principio del método se basa en la utilización de
una mezcla que contiene molibdato, tungstato y ácido fosfórico (reagente Folin-Ciocalteau), que
sufre una reducción cuando reacciona con proteínas, en la presencia del catalizador cobre (II). Esto
produce un compuesto con absorción máxima a 750 nm. Esta reducción ocurre directamente a través
de las cadenas laterales de algunos aminoácidos (tirosina, triptófano, cisteína, asparagina e histidina),
que contribuyen con cuatro electrones, o a través de la eliminación de dos electrones de cada unidad
tetrapeptídica de las proteínas, que es facilitada por la formación del quelato entre el cobre (II) y las
proteínas. De este modo, el método de Lowry envuelve dos reacciones químicas. La primera reacción
es la reducción del ion cobre (II) en condiciones alcalinas (básicas), formando un complejo con enlaces
peptídicos, denominado reacción de Biuret. La segunda reacción envuelve la reducción del reagente
Folin-Ciocalteau por el complejo cobre-enlace peptídico, causando un cambio en la coloración de la
solución para azul. Por espectrofotometría pueden leerse las muestras con este método entre 650 a
750 nm. La cantidad de proteína puede ser estimada utilizando una curva estándar con otra proteína,
es decir, cuya concentración sea conocida como la albúmina bovina sérica. La principal ventaja
del método de Lowry es su alta sensibilidad. El método de Lowry es más sensible que la
determinación UV y también más sensible que el método de Biuret. Algunas desventajas son el
tiempo de la reacción y la incompatibilidad con detergentes y agentes reductores. (Marques, 2018)

3. Describa el método de Sanger y mencione el papel que juega en la identificación de proteínas.

Esta estrategia se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN complementaria a una
hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de ADN polimerasa, los cuatro 2’-
deoxinucleótidos que componen la secuencia del ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y cuatro
dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP). Estos últimos nucleótidos “especiales” o
nucleótidos de parada, están diseñados para que carezcan del grupo 3’-OH, que permite la adición
del nucleótido consecutivo, de forma que cuando uno de ellos es incorporado por la polimerasa se
interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a que se obtengan fragmentos secuenciados de
diferente tamaño, según dónde se incorporen los dideoxinucleótidos. De este modo, y tras una
simple electroforesis, se va a poder dilucidar la secuencia. (Garrigues, 2017)

En primer lugar, se llevan a cabo cuatro reacciones distintas en tubos diferentes. Cada uno de los
tubos va a contener una mezcla que contiene la misma cadena molde (ADN de simple cadena,
obtenido o no tras una desnaturalización, o ADNc procedente de una retro transcripción de ARN), la
ADN polimerasa, un cebador marcado radiactivamente, los cuatro nucleótidos normales (dNTP) y uno
de los cuatro dideoxinucleótidos (ddNTP). Así, el cebador, por complementariedad, se une a la hebra
molde favoreciendo su reconocimiento por la ADN polimerasa y el inicio de la síntesis de la nueva
hebra. La ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que, de forma aleatoria, incorpora el ddNTP,
por ejemplo, el ddATP (cada uno de los tubos contiene un ddNTP distinto) y se interrumpe la síntesis.
De esta forma, en el tubo van a aparecer fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e
interrumpidos por el ddNTP del mismo tipo (en este caso ddATP). En el segundo tubo, habrá una
mezcla de fragmentos secuenciados interrumpidos por otro ddNTP (por ejemplo, ddGTP), en el
tercero por otro (ddCTP) y en el cuarto por el último (ddTTP). A continuación, el contenido de cada
uno de los tubos se corre en carreras diferentes de un gel de acrilamida. Finalmente, tras separar en
función del tamaño, y gracias al cebador marcado radiactivamente, se van a poder contemplar
diferentes bandas que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos. (Garrigues, 2017)

Figura 3. Método de Sanger.

Este método juega un papel muy importante en la identificación de proteínas, debido a que usa
nucleótidos modificados con la ausencia del extremo 3’OH, grupo esencial para la polimerización por
la ADN Polimerasa. De esta forma, cuando se incorpora un dideoxinucleótido, queda un trozo trunco
de ADN que puede ser separado electroforéticamente. Si cada uno de los cuatro monómeros de ADN
(los nucleótidos adenina, guanina, citosina y timina) se marca con una molécula fluorescente
diferente, se puede determinar rápidamente el orden de los nucleótidos, ayudando de esta manera
a identificar la proteína correspondiente de acuerdo al orden de sus bases nitrogenadas. (Peña, 2013)

4. Defina el término secuenciación proteica.

La secuenciación de proteínas es el proceso por el cual la secuencia de aminoácidos se deduce sin

conocimiento previo de la secuencia de ADN o de proteínas. Esto difiere de la confirmación de
secuencias, donde la secuencia de proteínas/ADN ya se conoce y los datos de la secuencia obtenida
se usan para confirmar que es correcta. La secuenciación de proteínas se utiliza en la identificación
de proteínas desconocidas en los análisis proteómicos. Esto sirve para identificar a la proteína o
caracterizar sus modificaciones postraduccionales. Usualmente, la secuenciación parcial de una
proteína provee la información suficiente (uno o más fragmentos) para identificarla con bases de
datos de proteínas derivadas de la traducción. (SGS, 2021)

5. Mencione tres reacciones de identificación que se utilicen en la secuenciación de proteínas.

Análisis de aminoácidos N -terminales. Se determina qué aminoácido forma el extremo N de una

cadena de péptidos mediante los siguientes pasos: Reaccionar el péptido con un reactivo que
marcará selectivamente el aminoácido terminal. Hidroliza la proteína. Determina el aminoácido por
cromatografía y comparación con estándares. (Alterman, 2011)
Análisis de aminoácidos C-terminales. El método más común es agregar carboxipeptidasas a una
solución de la proteína, tomar muestras a intervalos regulares y determinar el aminoácido terminal
mediante el análisis de una gráfica de concentraciones de aminoácidos frente al tiempo. La
secuenciación C-terminal ayudaría enormemente a verificar las estructuras primarias de proteínas
predichas a partir de secuencias de ADN. (Alterman, 2011)

Degradación de Edman. Es una reacción muy importante para la secuenciación de proteínas, porque
permite descubrir la composición ordenada de aminoácidos de una proteína. Los secuenciadores de
Edman automatizados se utilizan ahora ampliamente y son capaces de secuenciar péptidos de hasta
aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. (Alterman, 2011)

Identificación por espectrometría de masas. Es el proceso de asignar un nombre a una proteína de

interés (POI), en función de su secuencia de aminoácidos. Normalmente, sólo es necesario
determinar experimentalmente una parte de la secuencia de la proteína para identificar la proteína
con referencia a las bases de datos de secuencias de proteínas deducidas de las secuencias de ADN
de sus genes. (Alterman, 2011)

6. Analice detalladamente una técnica que se utilice para secuenciar a las proteínas.

Degradación de Edman. Este método para determinar la secuencia de aminoácidos en un péptido o

proteína, puede ser utilizado para analizar un péptido sintético incluso si aún se encuentra adherido
a la resina. Sin embargo, no produce datos útiles en la región C-terminal. Consiste en la degradación
repetitiva de los péptidos a partir de una reacción con el grupo amino terminal libre y con fenil
isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es
entonces tratado con ácido fluorhídrico para liberar el aminoácido que ha reaccionado del resto de
la cadena peptídica mediante la formación de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un
derivado mas estable (un aminoácido PHT) por la adición de TFA. Como consecuencia el péptido tiene
ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificación de los PHT-
aminoácidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC. (Navarrete, 2011)

Los péptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta metodología no
presentan ninguna consideración especial, no así cuando el péptido analizado aún se encuentra
adherido a la columna. Debido a que este método requiere del grupo amino libre, los grupos
protectores utilizados en la síntesis para proteger al a-amino deben ser removidos o de otra forma
no será posible analizar el péptido sintetizado mediante la degradación de Edman. Con respecto a los
grupos protectores de las cadenas laterales, estas solo tendrán un efecto durante la identificación
del aminoácido, ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales más hidrofóbicas;
por la tanto el gradiente utilizado para eludir los PTH-aminoácidos en RP-HPLC deben extenderse,
aunque esto no sucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues los aminoácidos serán
desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final. (Betancourt, 2014)

Pasos para secuenciar una proteína pura por el método de Edman. (Universidad de Loja, 2015)

1. Desnaturalizar, con urea, por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro.

2. Bloquear los grupos -SH, con iodoacetamida, por ejemplo.
3. Fragmentar la proteína en péptidos más pequeños, usando dos métodos diferentes (por
ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN).
4. Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase reversa (RP-HPLC).
 5. Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, en un
secuenciador automático.
6. Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados de feniltiohidantoína
(PTH-aminoácido) online en el secuenciador.
7. Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de ruptura de la proteína.
8. Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por ambos métodos.

"La mayoría de los métodos alternativos a la degradación de Edman surgen con la utilización de la
espectrometría de masas (MS) como técnica analítica más efectiva para el estudio de la estructura
primaria de las proteínas. Ellos se basan en la combinación de digestiones enzimáticas y/o en la
modificación química de los grupos aminos primarios, con algún paso cromatográfico previo".

Figura 4. Degradación de Edman.

7. Describa la técnica de Millón y especifique el tipo de proteínas que puede identificar.

La reacción es debida a la presencia del grupo hidroxifenílico (C6H4OH) en la molécula proteica.

Cualquier compuesto fenólico no sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, fenol y timol, dan
positiva la reacción. El mecanismo de la reacción es poco conocido, posiblemente por la formación
del complejo óxido de mercurio y fenol. (Horton, 2006)

Es específica para el grupo fenólico, por lo tanto, la dan positiva todas las sustancias que poseen esta
función, como la Tirosina y todas las proteínas que contengan Tirosina. El primer paso de la reacción
de Millón consiste en la nitración del anillo fenólico de la Tirosina, por el ácido Nítrico del reactivo. La
Tirosina nitrada forma complejos con los iones Mercurioso Hg (I) y Mercúrico Hg (II) del reactivo
produciendo un precipitado rojo o una solución roja, ambos resultados positivos. (Horton, 2006)

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