Facultad de Ciencias Agrarias

Departamento de Norte de
Santander
Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICA No 3. ENSAYO DE PROTEINAS.

Yesenia Carolina Cuellar Barrera (1082217231), Cindy Vanessa Álvarez

Saldarriaga (1148703148), Maíra Alejandra Botia Rincón (1093925340).
Universidad de Pamplona, Norte de Santander, Grupo CC (Agrarias).

RESUMEN
Esta práctica tuvo como fin fundamental reconocer proteínas y aminoácidos
mediante reactivos químicos específicos y comprobar el efecto de algunos
factores físicos y químicos sobre la estructura de las proteínas. Para ello se utilizó
la albumina o clara de huevo. La clara es una solución viscosa de color blanco
translúcido, soluble en agua. Las proteínas del huevo proporcionan los 9
aminoácidos esenciales, que el cuerpo no sintetiza, para poder identificar dichos
aminoácidos fue necesario hacer varias reacciones que fueron las siguientes: La
Reacción de Ninhidrina, Reacción de Millon, Prueba de Biuret , Reacción de
Xantoproteica y el Reactivo de Sakaguchi, las cuales tienen como fin fundamental
identificar aminoácido, dicho anteriormente. Para la Reacción de Ninhidrina y la
Reacción de Millon fue necesario realizar baño maría para poder que ese proceso
se llevará a cabo.

INTRODUCCIÓN Las proteínas son polímeros lineales

construidos a partir de cadenas de
Las proteínas son las monómeros llamados aminoácidos, y
macromoléculas más versátiles de los contienen ciertos grupos funcionales
seres vivos y desempeñan funciones tales como alcoholes, tioles, tioeteres,
cruciales en los procesos biológicos. ácidos carboxílicos, carboxiamidas, y
Funcionan como catalizadores, grupos básicos. La mayoría de estos
transportan y almacenan otras grupos son químicamente activos,
moléculas como el oxígeno, siendo los responsables de las
proporcionan apoyo mecánico y funciones de la proteína. Estas
protección inmunológica, generan macromoléculas pueden interaccionar
movimiento, trasmiten impulsos entre sí para formar asociaciones
nerviosos, y controlan el crecimiento complejas.
y la diferenciación.
Los aminoácidos son los
constituyentes de las proteínas, un α-
aminoácido consiste en un grupo de
carbono α unido a un grupo amino,
un ácido carboxílico y una cadena
lateral ® característica. Solo los L-
aminoácidos son constituyentes de
proteínas y habitualmente se
encuentran 20 tipos de cadenas
laterales que varían en tamaño,
forma, carga, capacidad de formar
puentes de hidrogeno, carácter
hidrofóbico y reactividad química.
(Berg, Tymoczo & stryer 2009, pg
25-27).
Los aminoácidos son un grupo
heterogéneo de moléculas que
poseen unas características
estructurales y funcionales comunes.
Estos se unen mediante enlaces
covalentes y formando largas
cadenas de péptidos y polímeros. La
disposición lineal concreta de los
aminoácidos de una proteína
constituye su secuencia primaria, y
esta determina la estructura
tridimensional.
Esto hace que los grupos amino y
carboxilo de todos los aminoácidos
estén unidos por enlaces peptídicos,
por esto la naturaleza química de la
cadena lateral es la que va a
condicionar su solubilidad en agua,
su reactividad y el tipo de
interacciones que se pueden
establecer.
El estudio detallado de la estructura
tridimensional de las proteínas
permite comprender la importancia de
esta distribución espacial en las
diversas funciones de las proteínas
como son la función catalítica,
estructural, recepción y trasmisión de
señales. Cada proteína tiene una
estructura tridimensional
característica indispensable para
realizar su función. Esta estructura es
mantenida por interacciones débiles
formándose la estructura secundaria,
terciaria y cuaternaria.
Según el nivel de organización se
suelen considerar como globulares y
fibrosas. Las primeras se caracterizan
por su forma esférica, su solubilidad
en medios acuosos y presentar
diferentes estructuras secundarias en
una misma molécula. Las proteínas
fibrosas presentan una única
estructura secundaria que disponen
en forma de largas hebras y son
insolubles en agua. (Feduchi,
Blasco, Romero & Yañez 2011, pg
78-85)
Como la estructura tridimensional se
mantiene mediante interacciones
débiles, si se alteran las condiciones
que mantienen estas fuerzas de
atracción se produce la
desnaturalización de la proteína.
La desnaturalización de una proteína
implica la alteración de su estructura
tridimensional, la proteína nativa
pierde su actividad biológica o
función. En algunos casos el proceso
de desnaturalización es reversible. La
desnaturalización de proteínas ocurre
por su exposición a diversos factores
como la agitación, la temperatura, la
luz ultravioleta, la adición de
sustancia s acidas o básicas,
disolventes orgánicos, sales, metales
pesados y reactivos con grupos tiol,
estos agentes alteran las fuerzas de
dispersión, los puentes de hidrogeno
y los enlaces iónicos. (Acuña, 2008,
pg. 315)
El albumen es una solución acuosa
de numerosas proteínas globulares y
una proteína fibrosa, la ovomucina,
que le confiere la textura gelificada.
El ovomucoide es una glicoproteína
que contiene 0,5- 4% de D-galactosa,
7-8% de Dmannosa, 10 al 18% de D-
glucosamina y 0,03 a 2,2% de ácido
salicílico. Las unidades glucídicas
están ligadas a la molécula proteica a
nivel de residuos de asparragina. La
molécula está constituida de tres
subunidades, las zonas estructurales
en α hélice representan 22% de las
cadenas polipeptídicas; la proteína es
muy resistente al calor salvo en
medio alcalino. Posee una actividad
antitrípsica.
La lisozima contiene 129 residuos de
aminoácidos, el PH isoeléctrico de
esta molécula es muy elevado (cerca
de 10). Esta proteína posé una
actividad enzimática β Gradilla.
glucosaminidasica, se trata de un
mucopéptido N-
acetilmuramoilhidrolasa. La lisozima
puede separarse de la clara por una
precipitación en cloruro de sodio (5%)
a PH isoeléctrico.
La ovomucina es una glicoproteína
constituida de dos subunidades, de
contenido en glúcidos cerca al 30%,
con 6-23% de hexosas, 6-16% de
hexosaminas y 1-14% de ácido
sálico. Su estructura es alargada y
fibrosa, y es la responsable de la
viscosidad de la capa espesa
gelificada del albumen. Es insoluble
en agua y soluble en soluciones
salinas a PH >= 7. Es
termorresistente pero sensible a la
desnaturalización superficial. Forma
con la lisozima un complejo insoluble
en agua.
Las ovoglobulinas G2 y G3 poseen
un poder espumante elevado. La
avidina está compuesta de tres
constituyentes (A, B, C) siendo capaz
de formar un complejo con la biotina.
El ovoinhibidor es una proteína que
inhibe la actividad de la tripsina y de
la quimotrípsina. La flavoproteína
puede fijar la riboflavina. (Cheftel
1989, pg 167-177).
MATERIALES Y MÉTODOS
Potenciómetro (pH-metro), Pipeta
graduada de 1 ml , Pipeta graduada
de 5 ml, Vidrio reloj, Pipeteador,
Beaker de 500 ml, Frasco lavador,
Beaker de 50 ml, Termómetro,
Espátula, Balón aforado de 50 ml,
Balanza analítica, Bureta de ml,
Soporte universal con aro, Malla, 2
Pinzas para bureta , Tubos de ensayo
REACTIVOS
 NaOH en lentejas
 HCl Concentrado
 KCl
 Etanol
 Cloroformo
 HNO3 concentrado
 Ninhidrina 0.2 %
 Reactivo de Millon
 Nitrito de sodio 1% p/v
 Acido pícrico 2%
 CuSO4.5H2O
 Ácido tricloroacético 20%
 Nitroprusiato de sodio 2% p/v
 Hidróxido de amonio
 Solución de albumina
 Soluciones buffer patrón
PROCEDIMIENTOS: Parte IV. REACCIÓN DEL
NITROPRUSIATO.
Mezclar 2 ml de la muestra con 0,5 ml
Parte I. REACCIÓN DE de nitroprusiato de sodio al 1%.
NINHIDRINA:
Adicionar40 gotas de hidróxido de
Colocar 1 ml de solución de amonio. Observar
aminoácido en un tubo de ensayo y
ajustar el pH cercano a 7.
Agregar 5 gotas de la solución de Parte V. PRUEBA DE BIURET
Ninhidrina y dejar hervir por 2 min. PARA ENLACES PEPTÍDICOS.
Parte II. REACCIÓN A 2 ml de muestra agregar 5 gotas de
XANTOPROTEICA. la solución de sulfato de cobre al 10%
m/v.
Agregar volúmenes iguales de ácido
nítrico a aproximadamente 0.5 ml Luego 2 ml de hidróxido de sodio 10
desolución de aminoácido M.
Dejar enfriar y observar el cambio de Mezclar vigorosamente y observar.
color.
Agregar suficiente hidróxido de sodio
hasta que la solución alcance Parte VI. REACTIVO DE
alcalinidad. El cambio de color SAKAGUCHI PARA LA ARGININA.
amarillo en solución acida a naranja
Colocar 2 ml de una muestra de
brillante en solución básica,
proteína en un tubo de ensayo
constituye un resultado positivo.
Adicionarle 1 ml de hidróxido de sodio
2 N, mezclar bien
Parte III. REACCIÓN DE MILLON. Luego agregarle 2 gotas de reactivo
A 1 ml de muestra agregar 5 gotas de de Sakaguchi.
reactivo de Millon
Calentar en un baño de agua RESULTADOS
hirviendo por 10 min.
Como punto principal de todos los
Dejar enfriar a temperatura ambiente procedimientos, se hizo el proceso de
y agregar 5 gotas de nitrito de sodio la solución de albumina se preparó
al 1%. batiendo una clara de huevo durante
La aparición de un color ladrillo da un un tiempo, y luego se mezcló con 5
veces su volumen con agua destilada
resultado positivo.
(Figura 1)
La mezcla se filtró con papel de filtro
y el filtrado fue el que se utilizó para
 la realización de la práctica. (Figura
2,3)

Figura 2. Preparación para la filtración.

Figura 1. Albumina o clara de huevo

mezclada con agua destilada.

Figura 3. Filtración de la albumina o clara de

huevo.

Figura 4. Prueba de agua, Figura 5. Prueba de bulmina,

con Ninhidrina al 0,2%,
negativa.
Parte I. REACCIÓN DE
con Ninhidrina al 0,2%, NINHIDRINA.
positiva.
Aquí se utilizó el mismo el mismo
procedimiento, tanto para agua, como
para la albumina, pues a las dos
pruebas se le agregó 5 gotas de
Ninhidrina al 0.2%.
 Parte V. PRUEBA DE BIURET
PARA ENLACES PEPTÍDICOS.

Parte VI. REACTIVO DE

SAKAGUCHI PARA LA ARGININA.

DISCUSIÓN
Proteínas de la clara de huevo:
Ovoalbúmina, Ovomucina,
Conalbúmina, lisozima,
Ovoglobulinas y Ovomucoides.
Nihdrina
Al momento de reaccionar la muestra
de Serina y de Prolina se formaron
complejos coloreados de violeta y
amarillo respectivamente. La causa
Parte II. REACCIÓN principal de este comportamiento en
XANTOPROTEICA. la prueba se debe a que durante la
reacción se consumen dos
equivalentes de Ninhidrina por cada
aminoácido. En el primer paso de la
reacción el aminoácido se oxida,
Parte III. REACCIÓN DE MILLON. descarboxilandose y liberando
amoniaco, mientras que uno de los
equivalentes de Ninhidrina se reduce
a Hindrindantina. En el segundo paso
la Hindrindantina formada y otro
Parte IV. REACCIÓN DEL equivalente de Ninidrina reaccionan
NITROPRUSIATO. con el amoniaco formando un
complejo de color purpura (Purpura
Ruhemann). La Prolina produce un
complejo color amarillo. (Maria de la
Luz Velasquez Monroy, 2013)
BIURET
Se formó una coloración violeta al
reaccionar la muestra de clara de
huevo con el reactivo de Biuret,
debido a la formación de un complejo
de coordinación entre los cationes
cúpricos (𝐶𝑢2+) en medio alcalino
con las uniones peptídicas (los pares
de electrones no compartidos del
nitrógeno).
XANTOPROTEICA
Reacción Xantoproteica La
interacción entre ácido nítrico y la
clara de huevo produjo una solución
con coloración naranja, esto producto
de la reacción del ácido nítrico con
los aminoácidos aromáticos de las
proteínas de la clara, los cuales
formaron posteriormente
nitroderivados de anillos aromáticos.
Lo aminoácidos aromáticos que se
reconocieron y dieron positivo
durante la prueba son la Tirosina,
Fenilalanina y Triptófano los cuales
están considerablemente presentes
en proteínas de la clara como la
Ovoalbúmina.
CONCLUSIONES
Es muy importante tener presente
el conocimiento de las expresiones
que nos ayudan a conocer lagunas
de las características básicas de una
solución, con las cuales se pueden
calcular soluciones de diferentes
grados de concentración.
Se logró tener habilidad y experiencia
en la realización de las diferenntes
soluciones llevadas a cabo en el
laboratorio.
Gracias a la experiencia en el
laboratorio ya podemos iden
identificar y diferenciar facilmente los
diferentes instrumentos del
laboratorio y su uso.
BIBLIOGRAFÍA
BERG, Jeremy; TYMOZCO, Jhon y
STRYER, Lubert. Bioquímica. 6 ed.
España: Reverté, 2007. FEDUCHI
CANOSA, Elena. Et al. Bioquímica.
Conceptos esenciales. Madrid:
Médica Panamericana, 2010.380 p.
ACUÑA. Química Orgánica. Costa
Rica: Universidad Estatal a Distancia.
2008 CHEFTEL. Proteínas
alimentarias. España: Acribia, S.A.
1989 Calvo, D. J. (2004). Homepage
del Dr Juan Carlos Calvo. Obtenido
de Homepage del Dr Juan Carlos
Calvo:
http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/Prec
ipitacion%20por%20desnaturalizacio
n%20selectiva.htm Maria de la Luz
Velasquez Monroy, M. A. (7 de Junio
de 2013). Slide Share. Obtenido de
Proteínas:
http://es.slideshare.net/OswaldoAnge
les/protenas-22595188 Ochoa, S. H.
(s.f.). UAM-Iztapalapa. Obtenido de
Precipitación:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/u
ami/sho/Precipitacion.pdf Virginia
Melo, O. C. (2007). Desnaturalización
de las proteínas. En O. C. Virginia
Melo, Bioquímica de los procesos
metabólicos (pág. 98). Barcelona:
Reverte.