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Volumen 36, N° 2. Páginas 203-208

IDESIA (Chile) Julio, 2018

Establecimiento de unin vitroprotocolo de micropropagación paraCantúa

volcánica(Polemoniaceae): potencial planta ornamental del Perú.

Establecimiento de un protocolo de micropropagación in vitro de Cantua volcánica

(Polemoniaceae): una planta con potencial ornamental del Perú

Fiorella Medina Medina1, Herbert Lazo Rodríguez1*

ABSTRACTO
Cantua volcánica (Polemoniaceae)es una especie endémica de Arequipa, Perú. Esta planta, que tiene potencial ornamental, está en peligro de
extinción por la pérdida de hábitat debido a presiones antropogénicas y al cambio climático. Se desarrolló un protocolo parain vitro
micropropagación mediante explantes nodales, permitiendo su propagación masivain vitro. Para la etapa de establecimiento se determinó que ½
MS era el mejor medio de cultivo. En la etapa de proliferación, el balance de regulador de crecimiento que mostró mayor tasa de supervivencia
fue MS + IBA 1 ppm + BA 0.5 ppm. Se probaron diferentes combinaciones de NAA-AIB para el enraizamiento; Se determinó que el mejor medio era
MS + NAA 0,005 ppm + IBA 0,005 ppm. En la última etapa, el 65% dein vitrolas plantas se aclimataron utilizando vermiculita como sustrato y
regando con solución mineral Hoagland al 50%.
Palabras clave:Cantúa volcánica,micropropagación, proliferación de brotes.

RESUMEN
Cantua volcánica (Polemoniaceae) es una especie endémica de Arequipa, Perú, con potencial ornamental que se
encuentra amenazada por la disminución de su hábitat debido a presiones antropogénicas y cambio climático. Por lo
que se elaboró un protocolo, que utiliza nudos de esta planta como explantes permitiendo su propagación masiva
in vitro. El establecimiento de explantes, procesados como mejor medio ½ MS. En la fase de multiplicación el
balance hormonal (IBA-BA, IBA-kinetina), se calcula como mejor medio de multiplicación MS + IBA 1 ppm+ BA 0,5
ppm. La fase de enraizamiento con distintas combinaciones de ANA-AIB, calcula como mejor medio MS+ ANA 0.005
ppm + AIB 0.005 ppm.
Palabras clave:Cantúa volcánica, micropropagación, proliferación de nudos.

Introducción de las características fisiológicas y bioquímicas del

La actividad humana está provocando una progresiva
degradación de la biodiversidad. En consecuencia, un gran
número de especies de plantas están desapareciendo antes
de ser identificadas o evaluadas sus propiedades (Iriondo
2001). Por tanto, para salvar la riqueza florística es
importante proteger estas especies. (Ranganathan y
Uthayasooriya 2016). La estrategia más eficaz y eficiente
para la conservación es la protección del hábitat; sin
embargo, es poco probable que se proteja más del 4% de un
área geográfica (Keshavachandran y Peter 2008). De ahí la
importancia de complementaren el lugarmétodos a través
de ex situtécnicas para facilitar una mejor comprensión
material almacenado y proporcionar propágulos para su
reintroducción al ecosistema (Iriondo 2001). Los
métodos convencionales de propagación vegetativa son
lentos y costosos en algunos casos, lo que lleva al uso de
técnicas más sofisticadas comoin vitromicropropagación
ya que pueden realizarse durante todo el año y
permiten altas tasas de proliferación (Suárez 1993). El
uso de recursos genéticos de especies autóctonas
aumentaría la valoración pública de los recursos
naturales (Negrín y Zalba 2012), por lo que cultivar
plantas autóctonas en espacios públicos y privados es
una forma de mostrar el valor de los elementos
florísticos y difundir su uso (parques, jardines y ollas).

1 Laboratorio de Fisiología y Biotecnología Vegetal, Universidad Nacional San Agustín de Arequipa, Perú
* Autor para correspondencia: hlazor@unsa.edu.pe

Fecha de Recepción: 01 agosto, 2017.

Fecha de Aceptación: 08 mayo, 2018.

DOI: http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292018005000501. Publicado en línea: 16-agosto-2018.

204 IDESIA (Chile) Volumen 36, Nº 2, Julio 2018
Cantúa volcánica(Polemoniaceae) es una especie endémica
de Arequipa, Perú; es una planta herbácea con potencial
ornamental, ya que tiene vistosas flores azul violeta (Fig. 1A) y
crece entre los 2200-3200 m de altitud. Su distribución está
restringida a la Cuenca de Chili y al pie del volcán Misti (Porter y
Prater 2008). Debido a su pérdida de hábitat, cambios climáticos,
baja viabilidad de las semillas, ataque de insectos e intervención
antropogénica, se observa una disminución poblacional. Sin
embargo, no existen estudios publicados que indiquen el estado
actual de su conservación.
Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo establecer un
protocolo para la micropropagación masiva deC. volcánicay
obtener propágulos porin vitrotécnicas de cultivo, que servirán
para la conservación de esta especie.
Materiales y métodos
El estudio se realizó de julio de 2016 a mayo de
2017 en el Laboratorio de Fisiología Vegetal y
Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa.
Material vegetal.plantas silvestres deCantúa volcánica
(10 a 20 cm) fueron colectados en Characato, Arequipa,
Perú, en un radio de aproximadamente 100 m alrededor de
las siguientes coordenadas: 16°27'55.6”S 71°28'45.5''W y
2464 m de elevación. Se enviaron muestras botánicas
representativas al Herbario Austral del Perú (HSP) para su
determinación taxonómica.
Figura 1: Micropropagación enCantúa volcánica(A) Flores deC. volcánica, (B) Formación de múltiples brotes a partir de un
explante nodal, (C) Formación de raíces, (D) Planta aclimatada.
Etapa de esterilización de superficies.Los explantes se
obtuvieron del primer, segundo y tercer nudo de cada rama
(Olesen y Fonnesbech 1975). Se lavaron en agua destilada con
Tween 20 (100 µl por 100 ml) durante 10 min, luego los explantes
se desinfectaron mediante inmersión en etanol al 70% durante 1
min y 20 min en una solución de hipoclorito de sodio al 10% (lejía
comercial 4,63%). Luego, todos los explantes se enjuagaron 3
veces en agua destilada estéril durante 5 minutos cada vez.
Etapa de establecimiento.Los explantes se sembraron en
condiciones asépticas en medio nutritivo (1 explante por matraz). Se
probaron dos medios de cultivo para determinar cuál era el más
adecuado; un medio basal MS (Murashige y Skoog 1962) y un medio
MS de concentración media (½ MS); ambos fueron suplementados con
3% (p/v) de sacarosa. Los medios se ajustaron a pH 5,7 antes de la
adición de agar-agar al 0,8 % (p/v) y se esterilizaron a 121 °C y 1 atm
de presión durante 20 minutos. Los explantes se cultivaron bajo un
fotoperiodo de 16 h de luz, con una intensidad de 792 Lux (tubos
fluorescentes Philips TL-D 36W/865), a 23 °C. Después de tres semanas
se evaluó la tasa de supervivencia contando explantes vivos y muertos.
Etapa de proliferación. Se realizaron dos tratamientos para
determinar la combinación de reguladores de crecimiento adecuada
para la proliferación de brotes:
- BA-IBA: Benciladenina 1 ppm y ácido indol-3-butírico
0,5 ppm
- Kin-IBA: Kinetina 2 ppm y ácido indol-3-butírico 0,5 ppm
 Establecimiento de unin vitroprotocolo de micropropagación paraCantúa volcánica(Polemoniaceae): un potencial... 205

Luego se aplicaron los siguientes tratamientos para trasplantado a macetas que contengan una mezcla de arena, musgo y

determinar el mejor equilibrio entre BA y AIB: tierra agrícola (2: 1: 1). Al final de este proceso se evaluaron las tasas

de supervivencia y se expresaron en porcentajes.

T1: control (medio basal MS)
T2: MS + IBA 1,5 ppm
T3: MS + IBA 1 ppm + BA 0,5 ppm
T4: MS + IBA 0,5 ppm + BA 1 ppm
T5: MS + IBA 1,5 ppm
Después de 3 semanas se realizó un subcultivo y después
de 6 semanas se evaluó el número y tamaño de los brotes
producidos.
Etapa de enraizamiento.in vitroSe utilizaron plantas con 8
semanas de cultivo para realizar los siguientes tratamientos:
T1 = MS + NAA 0,001 ppm y IBA 0,01 ppm T2
= MS + NAA 0,005 ppm y IBA 0,005 ppm T3 =
MS + NAA 0,01 ppm y IBA 0,001 ppm
Después de cuatro semanas se evaluó el número de raíces
por planta.
Etapa de aclimatación.Arraigadoin vitroLas plantas se lavaron
cuidadosamente con agua destilada para eliminar los restos de agar y
se trasplantaron a pequeñas macetas de plástico que contenían
vermiculita esterilizada en autoclave. Las plantas se regaron hasta la
capacidad de campo con una solución de Hoagland al 50% (Hoagland y
Análisis estadístico.Para la etapa de establecimiento, las
diferencias en las tasas de supervivencia entre dos medios de
cultivo (MS y 1/2MS) se determinaron aplicando la prueba t de
Student (p <0,01). Los datos brutos se transformaron con la
fórmula √(x+1). Se realizaron treinta réplicas por tratamiento
conformando 60 unidades experimentales (UE), cada una de las
cuales corresponde a un explante en 20 ml de medio nutritivo..
Para la etapa de multiplicación se realizaron dos
experimentos. El primero determina diferencias en las tasas
de supervivencia entre Kin-IBA y BA-IBA aplicando la prueba
t-Student (p <0,01). Se plantaron sesenta y cuatro explantes,
haciendo un total de 128 UE. En el segundo experimento, se
aplicó un CRD para establecer el mejor equilibrio entre BA-
IBA, se plantaron 18 réplicas por tratamiento, haciendo 90
UE.
Para la etapa de enraizamiento se aplicó un CRD y se
determinó el número de raíces. Se realizaron 16 réplicas,
haciendo un total de 48 unidades experimentales. En los dos
últimos diseños los datos registrados se sometieron a análisis de
varianza ANOVA y prueba de especificidad de Tukey (p<0,05).
Todos los datos fueron procesados utilizando el software
STATISTICA 7.

Arnon 1950) y se sellaron herméticamente con vasos de plástico Resultados y discusión

transparente. Luego las plantas se colocaron bajo iluminación artificial

de 950 Lux (fotoperiodo 16h/8h) y 22-23 °C con humedad relativa del Etapa de establecimiento.La Figura 2 muestra que los

34%. Después de una semana, se hicieron 10 agujeros en los vasos de explantes cultivados en medio basal MS tuvieron una tasa de

plástico. En la tercera semana los vasos de plástico quedaron supervivencia menor (6,6%) que los explantes cultivados en medio ½

parcialmente descubiertos. Luego, en la cuarta semana, se quitaron MS (83,3%), con una diferencia altamente significativa (p <0,01). Los

los vasos de plástico y en la quinta semana las plantas se trasladaron explantes en el medio basal MS mostraron pardeamiento y oxidación.

al invernadero. En la sexta semana, las plantas fueron Begonia venosa, Hevea brasilensisyMusaAB,

100

90

80

70
Tasa de supervivencia (%)

60

50

40

30

20

10

0
EM 1/2 ms

Sales de macronutrientes

Figura 2: Efectos de la concentración de sal de MS en la tasa de supervivencia deC. volcánicaexplantes (los valores se expresan como
porcentajes, n = 30) MS: (medio basal Murashige Skoog).
206 IDESIA (Chile) Volumen 36, Nº 2, Julio 2018

estaban en la misma situación y el pardeamiento producido Rahman et al 2012) quienes encontraron que los tratamientos con Kin-IBA

por el estrés oxidativo se redujo cuando se cultivó en ½ eran mejores que los tratamientos con BA-IBA.

medio MS y ¼ de medio MS (un cuarto de la concentración La Figura 4 muestra la respuesta de regeneración de brotes a los

de sal). (Azofeifa 2009). reguladores de crecimiento BA-IBA. Hubo diferencias significativas

Etapa de proliferación.La mejor combinación de reguladores (p<0.05) entre los diferentes tratamientos. El que indujo mayor

del crecimiento fue BA-IBA (Fig. 1B, 3) con una tasa de supervivencia número de brotes por nudo fue el tratamiento 3 (BA 0.5 ppm + IBA 1

más alta del 65,6% en comparación con el tratamiento Kin-IBA, que ppm). La mejor respuesta de regeneración de brotes se ha informado

disminuyó significativamente la tasa de supervivencia (28,1%) (P en muchas especies con concentraciones de citoquininas inferiores a

<0,05). Sin embargo esta respuesta es contraria a lo descrito para las de auxinas. Sin embargo en este estudio se encontró la relación

Emblica officinalis, Arachis hipogaea, Syzygium cumini, Olea europaea contraria, relacionada con su estado fisiológico.in vitro. (Parveen y

yGyrinops versteegii(Hidayat, 2011; Shahzad 2014).

100
90
80
70
Tasa de supervivencia (%)

60
50
40
30
20
10
0
BA-IBA kin-IBA

Reguladores del crecimiento

Cifra 3: Efectos de los tratamientos BA-IBA y Kin-IBA sobre la tasa de supervivencia deC. volcánica explantes
(los valores se expresan como porcentajes, n = 64) BA: benciladenina; Kin: Cinetina; IBA: ácido indolbutírico

3
Número de brotes

0
Tratos

T1: Control (medio basal MS) T2: MS + IBA 1,5 ppm

T3: MS + IBA 1 ppm + BA 0,5 ppm T4: MS + IBA 0,5 ppm + BA 1 ppm

T5: MS + IBA 1,5 ppm

Figura 4: Efectos de los tratamientos BA-IBA sobre el número de brotes por explante deC. volcánica(los valores se
expresan como porcentajes, n = 18) BA: Benciladenina; IBA: ácido indolbutírico; ppm: partes por millón
 Establecimiento de unin vitroprotocolo de micropropagación paraCantúa volcánica(Polemoniaceae): un potencial... 207

30

25

Tamaño de los brotes (mm)

20

15

10

0
Tratos

T1: Control (medio basal MS) T2: MS + IBA 1,5 ppm

T3: MS + IBA 1 ppm + BA 0,5 ppm T4: MS + IBA 0,5 ppm + BA 1 ppm

T5: MS + IBA 1,5 ppm

Figura 5: Efectos de los tratamientos BA-IBA y Kin-IBA sobre el tamaño de los brotes deC. volcánica(los valores se
expresan como porcentajes, n = 18) BA: Benciladenina; IBA: ácido indolbutírico; ppm: partes por millón

En la Figura 5 se muestra que los tratamientos con mejor
efecto en talla longitud fueron el tercero (27 mm) y el quinto
(27,25 mm). Hubo diferencias significativas (p<0.05) entre
tratamientos en el tamaño de brotes producidos.
Como se informó para las plantas medicinales.
Tylophora indicayRauvolfia tetraphylla(Faisal et al. 2012), el
mayor número de brotes por nudo y el mejor tamaño de
brotes se obtuvieron con el tratamiento 3 (MS + AIB 1 ppm
+ BA 0,5 ppm), por lo que se seleccionó como medio de cultivo de
proliferación.
Etapa de enraizamiento.En esta fase se probaron
diferentes combinaciones de NAA e IBA porque se ha descrito en
muchas especies que la inducción de enraizamiento es
más eficaz cuando se utiliza una combinación de auxinas en
lugar de solo una (George 1993).
La Figura 6 muestra que el mejor tratamiento de
enraizamiento fue el T2 (MS + NAA 0.005 ppm y IBA 0.005
ppm), que produjo un 80% de plantas enraizadas (Fig. 1C).
Hubo diferencias significativas entre los tratamientos.
Al-Bahrany (2002) informó que enCitrus aurantifolia la
mejor forma de enraizamiento fue utilizar la combinación de NAA
0.5mg/l + IBA 2mg/l. También Lewandowski (1991) determinó
NAA 0.001 mg/l + IBA 0.005 mg/l como medio de enraizamiento
paraVistis labrusca. El mismo equilibrio regulador del crecimiento
fue utilizado por Zhang et al. (2008) para enraizar Phlox subulata.

100
90
80
70
Enraizamiento (%)

60
50
40
30
20
10
0
Tratos

T1 = MS + NAA 0,001 ppm y IBA 0,01 ppm

T2 = MS + NAA 0,005 ppm y IBA 0,005 ppm

T3 = MS + NAA 0,01 ppm y IBA 0,001 ppm

Figura 6: Efecto de los tratamientos NAA-IBA sobre el enraizamiento de plantas deC. volcánica(valores expresados
como porcentajes, n=16). NAA: ácido naftalenoacético; IBA: ácido indolbutírico; ppm: partes por millón
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Aclimatación.Después de 7 semanas de aclimatación (Fig. 1D)
se obtuvo un índice de supervivencia del 64,71%; este resultado es
similar al informe de Zhang et al. (2008), quienes lograron un 60% de
plantas aclimatadas en 90 días. También Nava et al. (2011)
describieron que el 46,9% deLaelia eyermaniana las plantas se
aclimataron en 90 días. La aclimatación es un proceso largo, siendo el
resultado de una mala fotosíntesis debido a las condiciones
inadecuadas de crecimiento (Pierik, 1987). Además, durante el proceso
de aclimatación las plantas deben regular adecuadamente los
procesos de absorción de agua, translocación y transpiración, lo que
hace que la adaptación sea más larga y delicada (Hurtado y Merino
1987).
Conclusiones
El objetivo de este estudio fue establecer un
protocolo para la micropropagación deC. volcánica. El
Literatura citada
Al-Bahrany, A.
2002. Efecto de las fitohormonas sobre la multiplicación de brotes in vitro.
y enraizamiento de calCitrus aurantifolia(Navidad.)
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Se determinó ½ medio MS (reducido a la mitad de la concentración)
como medio de establecimiento del explante. El mejor medio para la
proliferación de brotes fue MS + IBA 1 ppm/l.
+BA 0,5 ppm. Determinado como mejor medio de enraizamiento,
MS + ANA 0.005 ppm + AIB 0.005 ppm obtuvo 65% de
supervivencia luego de la aclimatación.
Agradecimientos
El apoyo financiero fue brindado por la Universidad
Nacional de San Agustín de Arequipa a través de Cienci
Activa con contrato N° TT-0016-2016. Agradecemos
sinceramente al Mg. Luis Martínez Manchego de la
Universidad Nacional de San Agustín por su guía en el
análisis estadístico de esta investigación. También
reconocemos la asistencia de laboratorio de Patricia
Viveros Flores y Ana Caldas Araujo.
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