Tema 8.

Cultivos (cuaderno)
Tema 9. Análisis cromosómico.
Técnicas de análisis cromosómico.
- Técnicas de análisis cromosómico  nos permiten poner de manifiesto los cromosomas
y analizar si presentan algún tipo de anomalía.
- Dos categorías:
Anomalías estructurales, donde se produce alteración del orden o la cantidad de los
genes que portan,
Anomalías numéricas, cuando aparecen o desaparecen cromosomas de la célula.
Existen técnicas para estudiarlos por tinciones, que les dan color
por bandeo, dejando diferentes bandas de
colores
por fluorescencia, resaltando estructuras
marcadas ssssssssssssssssssssssssssssssssscon colorantes fluorescentes.
Los cultivos celulares y el análisis cromosómico es la principal técnica que se realiza en los
laboratorios de citogenética destinados al diagnóstico de anomalías cromosómicas.
Interés del estudio cromosómico.
Se realiza el estudio de cariograma o ideograma en:
- anomalías congénitas en bebés
- alteraciones del correcto desarrollo
- psicomotor de los niños
- problemas relacionados con el desarrollo sexual de los adolescentes o patologías
similares en adultos,
- Infertilidad o problemas genéticos, como hijos con malformaciones o alteraciones en
los genes.
Ideograma  Ordenar representaciones gráficas de los cromosomas uno tras otro, sin
su pareja, en función de su tamaño y tras un bandeado
Cariograma  los ordena mediante imágenes reales de los mismos, por parejas y según tamaño
o posición del centrómero.
Técnicas de obtención de la muestra, sembrado y cultivo celular.
- Las extensiones cromosómicas la obtenemos a partir de muestras biológicas.
- Ya tomadas, se llevan al laboratorio para realizar un cultivo celular de las mismas, lo
cual permite aumentar la densidad celular de la muestra para posibilitar el estudio
cromosómico.
- Se obtienen por venopunción, en el caso de la sangre periférica; por amniocentesis
para el líquido amniótico o por biopsia para las vellosidades coriales.
- La siembra se realiza incorporando la muestra al medio de cultivo, que es un líquido
enriquecido con sustancias para la nutrición y desarrollo y reproducción celular.
- Es fundamental incubar las muestras con las condiciones óptimas de
 pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad, tensión superficial y tiempo de
incubación.
- En el caso de la sangre periférica, es recomendable sembrarla por duplicado y de
manera independiente, para evitar contaminaciones y pérdidas de material.
 - La de sangre periférica requiere una temperatura de 37 o C y un tiempo de 24 a 72
horas, al 5 % de CO2.
- Es importante recordar que el medio de cultivo debe contener sales, aminoácidos
esenciales, vitaminas, glucosa, moléculas orgánicas  como coenzimas, hormonas y
factores de crecimiento, antibióticos y fungicidas.
- También cuentan con mitógenos como la Fito hemaglutinina para estimular la mitosis.
En los medios de cultivo se emplea mucho el suero bovino fetal
Técnicas de sacrificio. Inhibidores de mitosis.
- Sacrificio hace referencia a la detención de la mitosis en la
metafase.
- Para ello, emplearemos sustancias que detienen la mitosis,
entre las cuales las más populares son la colchicina y el
Colcemid.
- Ambos detienen la metafase celular, que es el momento
idóneo, ya que los cromosomas se han formado tras la
condensación y empaquetamiento del ADN.
- Este producto se añade al cultivo y se deja incubar 30
minutos a 37 o C.
- Una vez pasado el tiempo, solo se necesita centrifugar la
muestra para retirar el sobrenadante (el líquido que sobra en
la parte superior del tubo donde lo realicemos) y volver a
provocar la suspensión de las células centrifugadas, que se habrán quedado en el fondo
del recipiente, mediante golpes en el fondo de este.
- El inhibidor de la mitosis debe añadirse de 90 a 120 minutos antes de que termine el
periodo de incubación.
Técnicas de recogida, procesado y extensión de células.
1- Añadimos una solución hipotónica al medio, normalmente cloruro potásico,
mezclándolo con la muestra y dejando que actúe durante 20 minutos.
2- Al encontrarse las células, el agua pasará al interior de las células mediante el
mecanismo de ósmosis.
3- La finalidad es que las células se hinchen para que los cromosomas se separen y, así,
poder verlos mejor.
4- Este paso es delicado y requiere seguimiento estricto de los tiempos y procedimientos,
porque las células podrían quedar muy poco hinchadas y los cromosomas no se verían
como es debido o, por el contrario, podrían hincharse demasiado y romperse.
5- Transcurridos estos 20 minutos, se vuelve a centrifugar, como en el apartado anterior,
retirando el sobrenadante y resuspendiendo la muestra de nuevo.
6- El siguiente paso consiste en fijar la muestra con 5 mL de fijador de Carnoy.
7- Tras 5 minutos, se centrifuga durante 5 minutos y se retira el sobrenadante. Será preciso
realizar 2 o 3 lavados más con el fijador, hasta que obtengamos un botón celular blanco
y limpio.
8- Este material ya estará listo para ser extendido en un portaobjetos, que se realiza
dejando gotear la suspensión sobre este. De esta forma, se rompen las células y se
dispersan sus cromosomas por el portaobjetos.
9- Proporciones para la elaboración de 100 mL de solución fijadora Carnoy:
• Fijador de Carnoy 100 mL
• Etanol 75 mL
• Ácido acético 25 mL
Métodos de tinción y bandeado cromosómico.
Existen diferentes métodos de tinción:
1. Tinción simple: Un ejemplo es la tinción con orceína, una tinción roja-violácea que tiñe los
cromosomas enteros de un color rosado intenso, pero no permite la diferenciación de la
composición de este.
2.Tinción fluorescente: Mediante el empleo de fluorocromos, sustancias que en la
microscopía de fluorescencia le otorgan su característico brillo a la muestra, gracias a la
radiación que emite el colorante.
3. Bandeo:
- Es un tipo de tinción que pondrá de manifiesto diferentes bandas o regiones específicas de los
cromosomas.
- Existen diferentes tipos, como los bandeos G, R, Q, C y NOR.
- Cada uno evidencia un tipo de estructura de los cromosomas. Tenemos:
- El bandeo G se emplea mucho en la elaboración de los cariogramas e ideogramas.
- El bandeo Q es útil para identificar el cromosoma.
- El bandeo C se emplea para estudiar genes que se localizan en regiones conocidas como
heterocromáticas (se verá en el apartado siguiente).
- El bandeo R (reverse), que da un resultado de tonos opuestos al bandeo G, es muy útil para
teñir los extremos distales de los cromosomas.

Obtención de bandas G, C Y NOR

Bandeo G:
Para la obtención de estas bandas, se añade tripsina sumergiendo el portaobjetos en
una solución y después, se lava.
Luego, se tiñe con Giemsa y se vuelve a lavar el portaobjetos, para finalmente dejarlo
secar.
Nos ofrecerá cromosomas con bandas claras y oscuras; estas últimas serán ricas en A-
T.

Bandeo C:
Con esta técnica vamos a conseguir teñir intensamente zonas heterocromáticas. Tienen
cromatina muy condensada y responde a la zona de los centrómeros. A los cromosomas
se les aplica una solución básica y luego se tiñen con Giemsa.

Bandeo NOR:
Se tiñe a genes del ARN ribosómico.

Protocolo de tinción de Giemsa.

Es una de las más empleadas para el estudio de las células sanguíneas

Eliminación de la tinción de los portaobjetos.

1. Retirar el aceite de inmersión con almohadillas y alcohol.
2. Eliminar el medio de montaje con agua destilada, si es soluble en agua o si es un montaje
permanente con un sustituto del xileno.
3. Secar los portaobjetos.
4. Sumergir los portaobjetos en un fijador de ácido etanol- acético 30 segundos a 5 minutos
hasta que deje de soltar colorante.
5. Secar el portaobjetos

Ordenación de los cromosomas humanos.

Los cromosomas humanos se ordenan según su tamaño y forma, atendiendo a la posición del
centrómero y su patrón de bandas.
Se han clasificado en 7 grupos distintos denominados con letras en mayúsculas, A, B, C, D, E,
F, G y los cromosomas sexuales.
El orden de las parejas de cromosomas, según los grupos, es el siguiente:
• Grupo A: 1, 2 y 3
• Grupo B: 4 y 5
• Grupo C: 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12
• Grupo D: 13, 14 y 15
• Grupo E: 16, 17 y 18
• Grupo F: 19 y 20
• Grupo G: 21 y 22
• Cromosomas sexuales: X e Y

Tema 10. Técnicas de análisis cromosómico diagnóstico citogenético prenatal.

Diagnóstico citogenético prenatal
La ecografía que valora la correcta morfología y perfusión (con ecografía Doppler) del feto.
Cuando algunas de estas pruebas nos ofrecen valores alterados o ya tenemos hijos con
anomalías genéticas, se realizan pruebas invasivas para obtener material suficiente para
proceder a un diagnóstico citogenético.
Si se detectan alteraciones cromosómicas antes del nacimiento, podemos hablar de diagnóstico
prenatal. Si se detecta después, corresponderían al diagnóstico postnatal.
Indicadores clínicos del diagnóstico prenatal.
Por el riesgo que trae, el diagnóstico prenatal debe estar debidamente justificado.
Requisitos para realizar diagnóstico prenatal.
• Hijo previo con alteraciones cromosómicas documentadas.
• Ecografía con signos de una posible malformación fetal o síndrome cromosómico.
• Test combinado del primer trimestre (ecografía + marcadores bioquímicos) con alto riesgo de
cromosomopatías.
• Edad materna mayor o igual a 40 años.
• Padres portadores de alteraciones cromosómicas.

Test de screening (para embarazadas)  Test que indican la probabilidad de padecer una
enfermedad, pero que no la diagnostican. Si uno de estos presenta riesgo de patología genética
 realizar pruebas diagnósticas.

Tipos de muestras para el diagnóstico prenatal

Antes al estudio citogenético  necesitamos muestra con células fetales.

Esto requiere de técnicas invasivas, hay mayor riesgo (aborto o lesión en el feto)
Las diferentes muestras que se pueden tomar son:
• Vellosidades coriales:
- Obtención. Biopsia de vellosidades coriales.
- Ventajas. Diagnóstico más precoz que otras técnicas.

• Líquido amniótico:
- Obtención: Punción abdominal se extrae líquido amniótico.
- Cuanto antes se haga, mayor riesgo habrá de aborto, que está normalmente en torno al 1
%.
- Complicaciones: infecciones.

• Sangre fetal:
- Obtención. Se punciona la vena del cordón umbilical y se extrae sangre de ella.
- Es la que mayor riesgo de complicaciones tiene, ya que hasta en un 50 % de los casos se
produce una hemorragia transplacentaria.

Cultivo de vellosidades coriales

- Dentro de las vellosidades coriónicas  hay diferentes tipos celulares (fibroblastos, células
endoteliales y macrófagos en una abundante matriz intercelular. (nos importa mas los
fibroblastos)
- Mas importante  fibroblasto ya que crecen rápidamente in vitro.
- 1er paso: Disgregar las células que nos interesan mediante el empleo de tripsina/EDTA
para eliminar una capa de células de la placenta, luego empleamo la enzima colagenasa, que
digerirá la matriz intercelular.
- 2do paso: Mantener el cultivo adherido al recipiente en cuestión y se cultivan de 5 a 7
días. Pasado este tiempo, se trata con Colcemid (sustancia que detendrá la mitosis celular.)
- 3er paso: Se produce la hinchazón de las células con una solución hipotónica de citrato de
sodio y, entonces, se procesan para su tinción y análisis.

Cultivo de líquido amniótico.

- 1er paso. Es preciso obtener el líquido amniótico, lo cual se realiza mediante el empleo de
largas agujas destinadas a atravesar el útero. Mantener las muestras a Tº ambiente hasta
procesarlo y luego se Re suspenden las células en recipiente.
- 2do paso. Centrifuga la muestra  se aspira el sobrenadante y se añade el medio de
cultivo, se resuspenden las células golpeando suavemente el lateral del tubo y se incuban
los cultivos de 24 a 48 horas.
- 3er paso. Una vez realizado este proceso, se añade nuevamente medio de cultivo
precalentado y se incuban 2 días para que después se cambie los cultivos a nuevos recipientes
y añadir de nuevo medio de cultivo para volver a cultivar.
- Al 5o día de incubación, en un microscopio invertido, se valora el crecimiento celular de los
cultivos, que ya pueden presentar actividad mitótica (si no fuera así, se pueden mantener en
incubación hasta 9 días).
- Una vez presentan actividad mitótica y el crecimiento es el adecuado, se añade Colcemid y,
después, una solución hipotónica para su posterior fijación y tinción.

Cultivo celular de sangre fetal

-1er paso  Una vez obtenida la sangre se añade heparina, una sustancia anticoagulante,
para que la sangre con la que trabajemos sea sangre heparinizada.
- 2do paso  Esta se incorpora a los medios de cultivo, se tapa el tubo y se mezcla bien.
- 3er paso  Se incuban a 37 oC de 48 a 96 horas.
- 4to paso Se añade Metotrexato un día antes de la recolección y se incuban a 37 oC de
nuevo.
- 5to paso  El mismo día de la recolección, se añade timidina y se sigue incubando. Treinta
minutos antes de la recolección se añade Colcemid y se deja incubando a 37 oC.
-6to paso  Se centrifugan los cultivos y se retira el sobrenadante.
- 7mo paso. Se añade KCl para hinchar las células y se re suspende el cultivo celular. Se añade
el fijador, se mezcla bien y se centrifuga otra vez.
Posteriormente, se retira el sobrenadante, se añade fijador de nuevo y se centrifuga una vez
más.
La recolección se llevará a cabo cuando veamos al microscopio que el crecimiento del
cultivo celular es el adecuado.

Métodos de análisis citogenético. (tecnias de análisis cromosómico)

Tinción. Simple y fluorescente. CGH
Bandeo Array: CGH y SPN
FISH. Sky -FISH, multi – FISH o cariotipo
multicolor.

Ventajas y desventajas de las técnicas citogenéticas.

- Entre las diferentes técnicas  valorar coste, equipo necesario y precisión.

- Las tinciones  Técnicas más económicas y con menor equipo, tiene precisión
limitada y han sido sustituidas por el bandeo cromosómico)
- Técnica de bandeo  Proceso más complejo, mayor entrenamiento del personal,
ofrece nuevos límites diagnósticos que superan notablemente los de la tinción
convencional.
- Tinciones fluorescentes Emplear material fluorescente y debemos de realizarlo en
una sala de fluorescencia y esto incrementa el coste de las técnicas, xq necesita de
 instalaciones específicas, pero genera nuevas posibilidades diagnósticas, como
ocurre con la CGH.
- Técnicas microarray para CGH y SNP  Técnicas mas precisas. Son las más
costosas. Nos permite identificar alteraciones genéticas mínimas.

Técnicas invasivas en diagnóstico prenatal

Biopsia corial.
 Se toma la muestra del trofablasto por: Via transcervical o via transabdominal.
 Permite realizar estudios: citogenéticos, moleculares y bioquímicos.
 Permite estudiar el cariotipo fetal antes de la semana 15 de gestación.
 Nos ofrece resultado en el 99% (alta precisión).
Complicaciones:
- Perdida de la gestación
- Infección aguda

Amniocentesis
 Punción abdominal para llegar a la cavidad uterina y extraer L. Amniótico.
Dos tipos: La precoz (se realiza entre las semanas 11 y 14)
La clásica (se realiza a partir de la semana 15 o del 2do trimestre)
 Nos ofrece resultado por encima del 99% (alta precisión).

Cordocentesis
 Obtener sangre fetal a partir del cordon umbilical.
Tecnicas invasiva mas difícil.
 Es una técnica importante ya que cuando la sospecha de cromosomopatía aparece tarde,
ahorra tiempo frente a las demás.

Tema 11. Anomalías cromosómicas

CLASIFICACIÓN
Anomalías numéricas:
- Mismo número de cromosomas.
- Las estructuras de 1 o más cromosomas gana o pierde contenido o altera su posición.
- Por ejemplo, ocurre en la trisomía del 21 (origina el síndrome de Down), teniendo tres
cromosomas 21 en lugar de dos.
• Anomalías estructurales:
- Aumenta o disminuye el numero de cromosomas.
- La estructura de los cromosomas permanece intacta.
ANOMALÍAS NUMÉRICAS
 Consisten en una alteración en el número normal de cromosomas.
 Causa: Habitualmente por un mal reparto de los cromosomas o las cromátidas durante
la meiosis.
 Dos tipos
• Poliploidía:
 o El individuo gana un conjunto completo de cromosomas adicional. Es decir, en
lugar de tener un par de cada cromosoma, tiene 3 (triploidía) o 4 (tetraploidía).
• Aneuploidía: se gana o pierde algún cromosoma.
o Si la célula pierde un cromosoma  monosomía (2n – 1).
o Si la célula gana un cromosoma  trisomía (2n + 1)
 Se produce por un mal reparto de los cromosomas o las cromátidas durante la
meiosis.
 Las aneuploidías producen diferentes enfermedades cromosómicas.
 Las poliploidías, habitualmente, desembocan el aborto.
Algunas de las trisomías más conocidas son:
• Trisomía del 21: síndrome de Down.
• Trisomía del 18: síndrome de Edwards.
• Trisomía del 13: Labio leporino y paladar hendido, microcefalia, Microftalmia, polidactilia,
pie en mecedora, malformaciones viscerales.

ORIGEN DE LAS ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS

- Origen Por un reparto erróneo de los cromosomas en la meiosis.

- Si el error ocurre  primera división meiótica en una pareja de cromosomas (si no en más),
no se producirá la separación de estos en el anafase, lo que conllevará a que la mitad de las
células hijas arrastren la pareja entera de cromosomas, mientras que la otra mitad no tendrá
ninguno.
- Meiosis  se da en células sexuales.
- La otra célula hija de esta meiosis tendrá carencia de cromosoma, por lo que, al juntarse con la
otra célula sexual, solo dispondrán de un cromosoma, en lugar de la pareja.
- SI el error ocurre  segunda división meiótica.
1. No se separan las cromátidas entre las células hijas, de tal manera que una parte recibirá dos
cromátidas (es decir, el cromosoma entero), mientras que otra parte no recibirá ninguno.

ANOMALÍAS ESTRUCTURALES. TRANSLOCACIONES E INSERCIONES

En anomalías estructurales --> el cromosoma sufre alteraciones en su estructura, perdiendo,

ganando o alterando la posición de su material genético.
Las principales enfermedades que produce son: leucemia mieloide crónica y linfoma de Burkitt.
Entre todos los tipos de alteraciones, tenemos:

Translocaciones (t): Se produce un intercambio de regiones entre cromosomas no

homólogos. Se distinguen:
- Translocaciones recíprocas: dos cromosomas intercambian parte de sus brazos
mutuamente.
- Translocaciones robertsonianas: se dan en cromosomas acrocéntricos, donde pierden
los brazos cortos y se fusionan los largos.
Inserción (ins.): Un fragmento de cromosoma se desplaza a otra posición el mismo o a
otro cromosoma diferente. Es en realidad, una traslocación, solo que no es recíproca, ya que
cuando se dona el fragmento a otro cromosoma, este no devuelve ningún otro a cambio.
Las inserciones intracromosómicas (en el mismo cromosoma) pueden ser
homobraquiales (en el mismo brazo)
heterobraquiales (entre los dos brazos)
 En cualquier caso, pueden ser directas (dir) si las bandas se mantienen en el mismo
orden que tenían, o inversas (inv) si invierten su orden

Inversiones (inv.): Se invierte la orientación de un segmento del cromosoma. Se separa y

se da la vuelta, invirtiendo sus polos, para luego reincorporarse al cromosoma de nuevo.
a. Paracéntricas o paracentroméricas: cuando no implican al centrómero.
b. Pericéntricas o pericentroméricas: cuando implican al centrómero.

Deleción (del.):
Consiste en una pérdida de material genético.
Durante la meiosis o a consecuencia de agentes externos, un fragmento del cromosoma se
pierde y con él, los genes que codificase.
Marginales si tienen lugar en los telómeros e intersticiales si lo hacen en segmentos
intermedios del cromosoma.
Las principales enfermedades:
- Sindrome de maullido de gato (pérdida de material genético del cromosoma cinco)
- Síndrome de William (pérdida en el cromosoma siete),
- Tumor de Wilms (microdeleción) y retinoblastoma.

Duplicaciones (dup.):
- Aquí se duplica el material genético. Así, parte de un cromosoma estará repetido.
- Cuando se repiten porciones contiguas se denominan en tándem. Si están separadas,
entonces se llaman desplazadas.

ANOMALÍAS DE LOS CROMOSOMAS SEXUALES.

 Los cromosomas sexuales
- Son la pareja de cromosomas que define el sexo biológico del individuo.
- La pareja número 23 es el cariotipo humano.
- Hay de dos tipos, X e Y  El varón se define por tener un cromosoma X y otro Y,
siendo heterogenérico.
- La mujer tiene dos cromosomas X, por tanto, es homogamética.
 Alteraciones en los cromosomas sexuales,
- Las alteraciones numéricas por monosomía o trisomía de alguno de los dos
cromosomas sexuales.
 Alteraciones más típicas de estos cromosomas (síndrome de Turner, se produce una
monosomía del cromosoma X (45, X), y el síndrome de Klinefelter, que es debido a
una trisomía de los cromosomas sexuales (47, XXY).
 A los caracteres que se originan en los genes que se encuentran en los cromosomas
sexuales se les conoce como herencia ligada al sexo, porque la ausencia o alteración
del cromosoma X puede hacer que un gen no se exprese, y no tenga contraparte en el
cromosoma Y.

MOSAICO GENÉTICO
- Condición de un organismo por la cual existen diferentes cariotipos en sus células.
- Si el mosaicismo genético afecta  a células germinales (espermatozoides y óvulos) es
 mosaicismo de línea germinal.
- La quimera  coexistencia en un individuo de células con ADN totalmente
diferentes, no solo pequeñas mutaciones.
Aplicaciones diagnósticas

Con la citogenética
 Podemos identificar las alteraciones numéricas o estructurales.
 Puede realizarse de manera prenatal para confirmar una enfermedad de origen
cromosómico.
 A veces la citogenética nos permite establecer el diagnóstico certero, siendo la prueba
indiscutible que confirme la enfermedad en estudio.
 Investigación a conocer mejor el origen de múltiples.

NOMENCLATURA CROMOSÓMICA Y DE LA ANOMALÍA NUMÉRICA

- Un genomio es una dotación cromosómica completa, es decir, el conjunto de los diferentes

tipos de cromosomas que tiene una especie.
- En los organismos diploides (2n), tenemos un genomio del padre y otro de la madre, estando
los diferentes tipos de cromosomas en parejas homólogas;
- En los organismos haploides (n), existe un genomio únicamente.
- Si un organismo tiene tres genomios  triploide (3n)
Cuatro genomios  tetraploide (4n)
Si tiene los juegos cromosómicos  euploide

- Todas las células de una misma especie tienen el mismo número de cromosomas.
- a excepción de las células sexuales que pertenece a organismos diploides  son haploides.
- El brazo corto de los cromosomas -- letra p
- El brazo largo de los cromosomas ---letra q

Las fórmulas cromosómicas

número total de + , + especificación de los cromosomas sexuales

cromosomas que no tengan ninguna anomalía
estructural.

• Un varón normal: 46,XY

• Una mujer normal: 46,XX

Nomenclatura de las mutaciones:

número total de + cromosomas + ( +) o (-) seguido del cromosomas

cromosomas sexuales

En el caso de mosaicos, se escribe primero una línea celular y, tras una barra, se escriben las
demás.

Anomalías numéricas:
• Trisomía: 47,XY,+21 (hombre con una trisomía en el cromosomas 21)
• Monosomía: 45,XY,-21
• Monosomía de cromosoma sexual: 45, X o 45, X0.
• Mosaicos: 45, X/46, XY
Formula del mosaico

Nomenclatura de las anomalías estructurales.

Deleción:
Cariotipo + (número del cromosoma) + (región/es afectada/s)
Ejemplo
- Hombre con deleción intersticial del brazo corto del cromosoma 4 cuya ruptura se
produce entre los puntos p12 y p13: 46, XY, del (4) (p12p13)
- Mujer con deleción terminal del brazo corto del cromosoma 7 con rotura en
p14: 46, XX, del (7) (p14)

Duplicación
Cariotipo + (dup con el número del cromosoma) + (la/s región/es afectada/s.)
Ejemplo 
- Mujer con duplicación en tándem directo desde q23 hasta q30 en el cromosoma 8: 46,
XX, dup (8) (q23q30). En este caso, es una duplicación directa, por lo que se comienza
por el número menor.
- Hombre con duplicación en tándem inverso desde q23 hasta q30 en el cromosoma 8:
46, XY, dup (8) (q30q23). Como es un tándem inverso, se invierte el orden de los
números.
- Hombre con duplicación desplazada directa del segmento q21 hasta q31 insertada en el
punto p12 del cromosoma 6: 46, XY, dup (6) (p12q21q31). Al ser desplazada, se
escribe primero el punto del cromosoma donde se ubica la duplicación seguido de los
tramos afectados.

Inversión
Cariotipo + inv (número del cromosoma) + (región/es afectada/s)
Ejemplo 
- Mujer con inversión en cromosoma 2 cuyos puntos de ruptura y reunión son q20 y q25:
46, XX, inv (2) (q20q25)

Translocación

Recíproca:
cariotipo + t (los cromosomas que intercambian información) + (los segmentos intercambiados)
Ejemplo 
- Mujer con una translocación recíproca entre los cromosomas 5 y 14 cuyos puntos de
translocación son 5p22 y 14q23: 46, XX, t(5; 14) (p22; q23). Se escriben las partes
intercambiadas en el mismo orden que se pusieron los cromosomas que intervienen.
 - Hombre con una translocación recíproca entre los cromosomas X y 18 cuyos puntos de
intercambio son Xq25 y 18q12: 46, Y, t(X; 18) (q25; q12). No escribimos el
cromosoma X en el cariotipo porque lo vamos a escribir a continuación.

Translocación robertsoniana:

cariotipo + t o rob (los cromosomas que intercambian información) + (los segmentos

intercambiados)
Además, recordemos que la translocación robertsoniana supone la pérdida de un cromosoma, es
decir, una monosomía.
Ejemplo
- Hombre con translocación robertsoniana entre los cromosomas 14 y 21: 45, XY, rob
(14; 21) (q10; q10).

Inserción

Se indica el punto de inserción y le siguen los extremos del fragmento que se inserta, poniendo
en primer lugar el extremo que se ubique más cerca del centrómero en su nueva ubicación.
Ejemplo 
- Hombre con inserción en la banda q22 del segmento p14 p12, siendo una inserción
hetero braquial inversa: 46, XY, inv ins (5) (q22 p14 p12)
Tema 12. Citogenética y cáncer. (estudiar punto 3 y 7 más, y las definiciones)
Punto 3  Bases genéticas y moleculares del cáncer
En la célula existe un equilibrio entre estímulos y el cáncer aparece cuando se altera este
equilibrio y la célula se divide sin control.
Estos mecanismos pueden verse alterados por:
- factores intrínsecos (hormonales, inmunológicos o genéticos)
- factores extrínsecos (factores físicos, químicos o biológicos del medio que lesionan la
célula).
4 grupos de genes responsables de la aparición de las células tumorales:
• Protooncogenes u oncogenesregulación de la proliferación celular (ejm Ret, C-erb-B1).
Propician la aparición de tumores.
•Genes supresores de tumores,controlan y regulan la proliferación y muerte celular. (ejem
P53). Protegen de la aparición de tumores.
• Genes de reparación del ADN Evitan la acumulación de mutaciones en el ADN y repara
daños en el ADN.(ejem MSH2 y MSH3). Evitan la aparición de tumores.

 Genes reguladores de la apoptosisControlar la “muerte celular programada”. Son

antiapoptóticos (Bcl2 y Bcl-x) y proapoptóticos (Bax, bad y bid). Regulan la apoptosis para
evitar la proliferación de tumores.
Punto 7  Diagnóstico molecular del cáncer.
• Alteraciones cromosómicas: Deleciones, inversiones, pérdida o ganancia de material genético.
Para estudiar estas alteraciones  técnicas de citogenética.
• Mutaciones: Cambios en la secuencia de nucleótidos que origina un nuevo orden de
aminoácidos en la traducción del material genético, dando lugar a proteínas diferentes a las que
deberían producir. Para estudiar las mutaciones  secuenciar el material genético.
Definiciones
Metabolómica. Estudio de los procesos bioquímicos y celulares a través del estudio de
metabolitos.
Metabolito. Diferentes moléculas que se producen en una reacción química que serán la pieza
clave para conocer diferentes fenómenos que tengan lugar en el organismo, siendo los
biomarcadores.
Biomarcador. Es un metabolito. Sustancia en el cuerpo que determina un estado biológico
reflejando el estado de salud del paciente. (endógenos o exógenos).
 Marcadores tumorales
- Sustancias que producen las células cancerígenas o células normales en presencia de
células cancerígenas) y se pueden detectar en líquidos biológicos. (definición según la
profe)
- Sustancias que nos hacen sospechar de la presencia de un tumor (definición según el
pdf)
Marcador tumoral. sustancias producidas por las células tumorales o por células normales del
cuerpo, como respuesta a la presencia de un cáncer o también a ciertas afecciones benignas
(premalignas) del cáncer.
Marcador genético. Es una secuencia de ADN con una ubicación física conocida en un
cromosoma, ayudar a vincular una enfermedad hereditaria con el gen responsable.
Tema 13.

1. Técnicas de extracción y aislamiento de ADN

Para extraer ácidos nucleicos, tenemos que seguir los sgt pasos:
• Producir la lisis celular. Se realiza rompiendo las células para que puedan liberar el material
genético al medio.  se emplea detergentes o proteasas.
• Purificar los ácidos nucleicos. Separar los ácidos nucleicos del resto de sustancias, como
proteínas y lípidos. Existen diversos métodos:
• Precipitando el material genético mediante sales y alcoholes.
• Extracción empleando solventes orgánicos
• Adsorción en columna de sílice.
• Separación magnética.

2. Procesamiento de las muestras. Sangre y medula ósea y tejido

en parafina.
Vemos el pretratamiento de dos de las muestras más empleadas en el laboratorio:
• Sangre y médula ósea. Debe haberse recibido anticoagulada con EDTA, heparina o citrato
sódico y procesarse en las 24 horas siguientes tras su obtención, pudiendo conservarse hasta 3 o
4 días a 4° C.
 Lisis celular: empleando una solución comercial específica, en proporción 1:3 (1 de
sangre y 3 de solución).
 Centrifugado de la muestra, obteniendo un precipitado.
 Eliminación del líquido sobrenadante con pipeta Pasteur.
 Conservación del sedimento.
• Tejidos fijados en parafina. Debe procederse a la desparafinación:
 Obtención de cortes al microtomo de 5 a 10 micras.
 Pasar los cortes a un tubo Eppendorf.
 Incubar con xilol y etanoles de concentraciones descendentes y agua destilada.

2.1. Homogenización de las muestras

Antes de extraer los ácidos nucleicos, hay que homogeneizar la muestra con métodos físicos o
químicos para liberar sus células:
• La homogeneización mecánica
- Consiste en aplicar una acción que triture, abrase o desmenuce la muestra, mecanismos
automatizados o un mortero.
- Una vez que se obtiene una muestra homogeneizada, se continúa con el proceso de lisis
celular.

• La homogeneización química
- Se realiza mediante proteasas y detergentes que destruyen el tejido.
- Es más apropiada para piezas pequeñas o congeladas.
- El protocolo consiste en añadir los reactivos citados e incubar la muestra de 24 a 48 horas. -
Pasado este tiempo, se continúa con el proceso de lisis celular.
3. Purificación
La purificación es el proceso de separar los ácidos nucleicos del resto de sustancias, ya que se
encuentran en una solución con restos de la lisis celular y los propios reactivos.
Tipos:
• Purificación mediante solventes orgánicos:
- Utilizamos compuestos basados en el carbono: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico
- Los componentes del lisado celular tienen distintas solubilidades frente a estos
compuestos por lo que podremos separarlo.
- Fases: Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos. Se centrifuga
---------y queda el ADN en fase acuosa.
Precipitación del ADN. Al añadir acetato sódico e isopropanol.
Lavado del ADN (con etanol)
Re-suspensión del ADN. Añadiendo agua destilada.
• Purificación mediante precipitación con sales.
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía de adsorción
• Unión por esferas magnéticas
• Ultrafiltración

4. Técnicas automatizadas
La automatización ha llegado a la extracción y purificación de ácidos nucleicos, aportando:
calidad, rendimiento, velocidad y seguridad a este proceso. Requiere calibración y
mantenimiento.
Algunos tipos: Cromatografía de adsorción y el uso de partículas magnéticas.

5. Cuantificación del ADN

- Una vez extraídos y purificados los ácidos nucleicos se debe conocer su
concentración antes de almacenarlos.
- Podemos usar la espectrofotometría para hallar su concentración. Otra técnica
empleada es la fluorescencia.
• Mediante espectrofotometría
- Podemos conocer la cantidad de ADN concentrada en una disolución teniendo su absorbancia,
con aplicarle un factor de dilución y un factor de conversión, empleando la siguiente fórmula:
Concentración de material genético = (Absorbancia a 260 nm – Absorbancia a 320 nm) x
Factor de dilución x Factor de conversión.
Para conocer la concentración específica de ADN:
Concentración de ADN = Absorbancia obtenida (nm) x 50 (μg/mL) x Factor de dilución
• Para la fluorescencia, igual que en el resto de las técnicas de esta índole, se mide la
fluorescencia que emiten fluorocromos unidos al ADN.
 6. Extracción de ARN
- En comparación con el ADN, el ARN requiere mayor precaución por ser una molécula más
fácilmente degradable.
- En cuanto a su purificación, se realiza mediante cromatografía en columnas con resinas.

6.1 Técnicas de cuantificación de ARN

La cuantificación y determinación de la pureza del ARN se realiza mediante
espectrofotometría.
Tres longitudes de onda:
• 260 nm para ARN (igual que el ADN).
• 230 nm para contaminantes orgánicos.
• 280 nm para proteínas y compuestos fenólicos.

7. Protocolos de seguridad en el proceso de las muestras

- La extracción de material genético y la preparación de los reactivos deben hacerse en una
habitación limpia, es decir, con asepsia.
- Esterilizar todo el material es necesario.
- Evitar todas las fuentes de contaminación potenciales.
- Se preparan las muestras en zona limpia, con presión positiva.
- El análisis se realiza en una zona sucia, con presión negativa.

8. Conservación
ADN  CORTO PLAZO. 4ªC
 LARGO PLAZO. -80ºC

9. Control de calidad de ácidos nucleicos

Es preciso conocer la calidad del material genético que hemos obtenido para saber si los
resultados serán válidos y fiables.
Se valora la integridad (si las moléculas se han fragmentado)  con electroforesis en gel de
agarosa.
La pureza (el grado de contaminación de la muestra)  con espectrofotometría.
Concentración con espectrofotometría.

Resumen
1. Pretratamiento de la muestra

Tejido  suspensión celular

 Distintos métodos dependiendo tipo muestra

Métodos
 (Homogenización mecnanica)
(Homogenización química)  Detergentes
 Enzimas

2. Extracción de ácidos nucleicos

Suspensión celular  Restos celulares

- Recuperamos la célula
!! - Inactivar las nucleasas

Métodos Solución de lisis  EDTA

Detergentes
 Enzimas
3. Purificación

Suspensión de restos celulares Ácidos nucleicos aislado.

o Purificación mediante solventes orgánicos:

o Purificación mediante precipitación con sales.
Métodos o Cromatografía de intercambio iónico
o Cromatografía de adsorción
o Unión por esferas magnéticas
o Ultrafiltración