Caracterización celular y diferenciación

Ricardo Felm er D .
Bioquím ico, Ph.D .
 Caracterización celular

¿Por qué es necesario?

Para confirmar la especie de origen.

Para correlacionar con el tejido de origen.

• Linaje al cual pertenece la célula.
• Estatus dentro del linaje (Célula precursora madre, o diferenciada).

Para determinar si la célula está transformada o no.

• Es finita o continua
• Expresa propiedades asociadas con malignidad.

Para determinar si la célula es proclive a inestabilidad genética.

Para determinar la ausencia de contaminación cruzada.

 Caracterización celular

¿Por qué es necesario?
 Caracterización celular

Identificación de la especie de origen.

Se puede realizar mediante el análisis cromosómico (Cariotipo).
• Bandeo cromosómico para identificar especies (humano, ratón).
• Pintado de cromosomas, permite identificar cromosomas específicos
mediante sondas moleculares.

Marcadores de tejido o linaje.

•Los órganos están compuestos de tejidos. P Ej. La piel

Tejido epidérmico - Células epiteliales

-Fibrocitos
Tejido dérmico -Células endoteliales
-Células musculares
-Células mesenquimales

Diferenciación normal
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Marcadores de tejido o linaje.
Marcadores de superficie celular
•Ej. El CD11c que es un marcador de diferenciación

Proteínas de filamentos intermedios

•Ej. la proteína fibrilar acídica de la glía
(GFAP) de los astrocitos.

•Ej. desmina de las células musculares.

•Ej. citoqueratina para marcar células

epiteliales y mesoteliales.
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Marcadores de tejido o linaje.

Productos diferenciados
• Ej. Hemoglobina de las células .. eritroides
• Ej. Melanina de los ……........... melanocitos
• Ej. Miosina de las células ……. musculares
• Ej. Albumina de los…………… hepatocitos
Como todos los marcadores de diferenciación, estos productos dependen de la
expresión completa del fenotipo diferenciado.

Ej. El transporte de iones con la consecuente

transferencia de agua es característica de células
epiteliales absorbentes y secretorias.

Otras funciones específicas que pueden ser expresadas in vitro son:

•La contracción muscular.
•La despolarización de la membrana celular de las neuronas.
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Enzimas.

En la caracterización enzimática hay 3 parámetros disponibles.
1. El nivel constitutivo (es decir, en ausencia de inductores o represores).
2. La respuesta a inductores y represores.
3. La presencia de polimorfismos isoenzimáticos.

La actividad enzimática también

se puede comparar
cualitativamente entre cepas
celulares empleando los
polimorfismos de proteínas entre
especies.
 Caracterización celular

Morfología celular.
La observación de la morfología es la forma más simple de identificar una célula. Sin
embargo, debido a su plasticidad, estas pueden adoptar otras formas, especialmente
cuando llegan a confluencia.

Fibroblastos subconfluentes: Asumen

formas multipolares o bipolares y se
extienden bien sobre la superficie de
cultivo.

Fibroblastos confluentes: Son

principalmente bipolares y están menos
extendidos.

Las alteraciones del sustrato y condiciones de cultivo pueden también afectar

la morfología. Por lo tanto, las comparaciones deben hacerse a la misma
densidad, ciclo celular, mismo medio y sustrato.
 Caracterización celular

Morfología celular.

Los términos fibroblasto y epitelial se usan libremente en cultivo celular y a
menudo describen la apariencia más que el origen de las células.

Cuando la identidad de las células no se ha confirmado, se utiliza los términos

“como fibroblasto” o fibroblastoide y “como epitelio” o epiteloide

Fibroblasto: célula bipolar o multipolar

cuya longitud es usualmente más del doble
que su ancho.

Célula epitelial: célula polygonal con más

dimensiones regulares y que crece en
parches o grupos discretos junto a otras
células.
 Caracterización celular

Morfología celular.

Fibroblasto Epitelial

Endotelial Neuronal
 Caracterización celular

Tinción.

La tinción de Giemsa proporciona un
método conveniente para preparar un cultivo
de células ya que permite teñir:
•El núcleo celular de rosa o magenta.

•El nucléolo azul oscuro.

•y el citoplasma pálido o gris azulado.

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Análisis Cromosómico
 Contenido cromosómico.
También conocido como cariotipo, es el criterio mejor definido para relacionar una
línea celular con la especie y el sexo desde donde fue derivada.

De qué especie
sería esta muestra?

c
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Análisis Cromosómico
 Recuento cromosómico.
Se deben contar un total de 50-100 metafases. Se puede ayudar con una cámara
fotográfica o un sistema de TV-video.

Se puede también contar el n°

diploide más cercano (2n, 4n etc).
Los datos se pueden graficar
como un histograma.

c
 Caracterización celular

Análisis Cromosómico
Bandeo cromosómico
Se utiliza para identificar pares de cromosomas individuales cuando hay muy poca diferencia
morfológica entre estos. Permite evidenciar "bandas" transversales (oscuras y claras) a lo
largo de los mismos, y que corresponden a los distintos tipos de cromatina.

Ej: La tinción estándar de Giemsa permite ver bandas oscuras y claras en el cariotipo: Las
bandas oscuras son regiones ricas en A-T, que tienen por tanto una alta afinidad al Giemsa.

Brazo corto

Cada brazo cromosómico es

numerado empezando desde
el centrómero :

Brazo largo

Metacentrico Sub metacentrico Acrocentrico

NOMENCLATURA
Ej. 46,XX, del(1)(p21.2):
Humano, Mujer, cromosoma 1, brazo corto, Region = 2, Banda = 1 y sub banda = 0.2
 Caracterización celular

Análisis Cromosómico
 Técnicas de Bandeo cromosómico
Bandeo G Bandeo Q Bandeo C
(Técnica estandard (Bandas fluorescentes usando (Hidróxido de bario
de tripsina –Giemsa) Quinacrina) utilizando Giemsa)

Fig. 16.7. Chromosome Staining.

(a) Human chromosomes banded by the standard trypsin-Giemsa technique.
(b) The same preparation as in (a), but stained with Hoechst 33258.
(c) Human–mouse hybrid stained with Giemsa at pH 11. Human chromosomes are less intensely stained than
mouse chromosomes.
 Caracterización celular

Análisis Cromosómico
 Cariotipo.
Se obtienen fotos digitales de las metafases y usando un Editor de imágenes se corta
y pega los cromosomas individuales para formar el cariotipo.
 Caracterización celular

Análisis Cromosómico
 Pintado de cromosomas
Gracias a las sondas marcadas fluorescentes que se unen al ADN se pueden
identificar genes específicos, translocaciones o identificar la especie de origen de los
cromosomas.
Translocación

DNA probes specific to regions of particular chromosomes are attached to fluorescent markers and
hybridized with a chromosome spread. The picture shows a computer-generated "false colour" image,
in which small variations in fluorescence wavelength among probes are enhanced as distinct primary
colours. The combination of probes that hybridize to a particular chromosome produces a unique
pattern for each chromosome. This makes it particularly easy to detect segmental deletions and
translocations among chromosomes
 Caracterización celular

Marcadores únicos
Huella dactilar de ADN (DNA-Fingerprinting).
• Empleando sondas minisatélites.

Repeticiones en tandem de secuencias de
nucleotídicas ( 12 – 200).

GGTTGTGAGTGGGCACAT

Fig 16.9. Four human glioma cell lines.

MOG-G-CCM, U-251 MG, SB-18, and MOG-G-
UVW (three separate feezings)-and duplicate lanes
of BHK-21 controls.
 Caracterización celular

Marcadores únicos
Huella dactilar de ADN (DNA-Fingerprinting).
•Empleando sondas microsatelites.

Repeticiones en tandem de
pequeñas secuencias (“Short
Tandem Repeats, STR) de 2-4
nucleótidos.
CACACACACACACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Caracterización celular
 Diferenciación

Expresión del fenotipo in vivo.
El fenotipo de las células cultivadas y propagadas es distinto al tipo celular
predominante en el tejido de origen, y esto se debe a los factores que regulan la
geometría, crecimiento y función in vivo que están ausentes en el microambiente in
vitro.

Algunos conceptos importantes.

Diferenciación: proceso que conduce a la expresión de las propiedades fenotípicas in
vivo, características de las células funcionalmente maduras.

Diferenciación terminal: implica que la célula ha progresado hasta un punto en que

el fenotipo es completamente expresado y no puede progresar más allá de este punto.

Ej. Neuronas, células musculares.

Desdiferenciación: Indica la pérdida de las propiedades diferenciales de un tipo

celular en cultivo.

Ej. hepatocitos/ almacenar glucógeno).
 Diferenciación

Etapas de la Diferenciación.
Existen 2 vías principales para la diferenciación celular.
1. Tejidos en constante renovación

Epidermis

Mucosa Intestinal

Sangre

2. Tejidos con baja renovación

En respuesta a traumas, la células maduras pueden re-entrar a división.

Ej. Fibrocitos del tejido conectivo responden a una reducción local
de la densidad celular perdiendo su capacidad de diferenciación para
re-ingresar al ciclo celular.

Si el tejido ha alcanzado la densidad celular, se detiene la división y

se re-induce la diferenciación.
 Diferenciación

Proliferación y Diferenciación.
•A medida que progresa la diferenciación, disminuye la división celular hasta que
eventualmente cesa. Fenómeno que es característico a la mayoría de las células.
•La proliferación celular es por tanto incompatible con la expresión de propiedades
de células diferenciadas.

Compromiso y Linaje.
•La progresión de una célula madre (Stem cell) a una vía particular de
diferenciación implica un incremento en el “compromiso” a medida que progresa la
diferenciación .

•Idem. Una célula madre neuroectodermal

primitiva, una vez comprometida para
convertirse en neurona no cambiará hacia
una célula glial.
 Diferenciación

Plasticidad de las células madre.
•La teoría convencional de las células madre (Stem cells) predice que
mientras más primitiva la célula madre, mayor potencia tendrá.
Célula madre unipotente: es una célula que dará lugar a 1 sólo linaje.
P.ej. Células madre de la capa basal de la epidermis = Queratinocitos.

Queratinocitos
 Diferenciación

Plasticidad de las células madre.
Célula madre bipotente: es una célula que dará
lugar a 2 linajes.

P.ej. Célula madre linfoide = Linfocitos B o T .

Célula madre multipotente: es una

célula que dará lugar a más de 2 linajes.

P.ej. Célula madre de la médula ósea.
 Diferenciación

Plasticidad de las células madre.
Célula madre Totipotente. es una célula que dará lugar a todos los tipos celulares
conocidos.

P.ej. Célula madre embrionarias (ES cells).
 Diferenciación

Plasticidad de las células madre.
A > grado de compromiso > probabilidad de encontrar una célula madre en el tejido.

Ej. Células madre hematopoyéticas se encuentran en la médula ósea.

Células madre keratinociticas, en la epidermis.

Este compromiso implica una pérdida de potencia.

Uno podría esperar que células madre en el hígado produzcan sólo células del
hígado (hepatocitos, células del ducto biliar etc.)

O que en tejidos con poca regeneración (neuronas en el SNC) no haya células
madre.

Este concepto de compromiso, localización y potencia está siendo

cuestionado actualmente por diversos trabajos.

Ej. Con la demostración de que en el cerebro sí hay células madre (Vescovi et al.,
2002).

Células del hígado sí pueden generar neuronas (Deng et al., 2003).

Células madre de la médula ósea pueden generar células cardíacas (Mangi et al.,
2003).

Células madre neuronales pueden generar endotelio (Wurmser et al., 2003).
 Diferenciación

Marcadores de diferenciación.
 Los marcadores expresados tempranamente y que son mantenidos
durante las subsecuentes etapas de maduración, son considerados como
marcadores de linaje.

Ej. Proteínas de filamentos intermedios, como las citoqueratinas
(Epitelio).

Proteína acídica fibrilar glial (Astrocitos).

 Los marcadores del fenotipo maduro que representan la

diferenciación terminal, son usualmente productos celulares
específicos o enzimas involucradas en la síntesis de estos.

Ej. Hemoglobina en Eritrocitos.

BSA en Hepatocitos.

Transglutaminasa en Keratinocitos

GPDH en Oligodendrocitos.
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Hay 5 parámetros principales que controlan la diferenciación:

Interacción célula-célula.

Interacción célula-matriz.

Forma celular.

Tensión de O2

Factores solubles.
Tensión de Oxigeno
Célula-Célula Forma celular

Factores exógenos
solubles Interacción
célula matriz
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Interacción celular.

Homotípica: interacción celular mediada por el contacto celular entre células
del mismo tipo y ocurre principalmente a alta densidad celular.
• Metabolitos Comunicación entre
•Segundos mensajeros (cAMP, DAG, Ca 2+ etc) las células

Heterotípica: ocurre entre células de distinto linaje (mesoderma-ectoderma, o

mesoderma-endoderma). Es responsable del inicio de la diferenciación.
•Participan factores paracrinos

Homotípica

Heterotípica
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Factores exógenos.

Inductores fisiológicos:.
Inductores no-fisiológicos:.
• Hormonas • DMSO
• Vitaminas • N-metil-acetamida
• Iones inorgánicos (Ca 2+ ) • benzodiacepinas
• Factores paracrinos • Metotrexato

Factores exógenos

Ej DMSO: Rossi and Friedn 1967, observaron que las células de eritroleucemia de ratón tratadas con
DMSO para inducir la producción de virus, se volvían rojas por la producción de hemoglobina.

Control sin inducir Células inducidas con 2% DMSO

 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Factores exógenos.
Ej. DMSO: Esto también se confirmó por el aumento en la
expresión del gen de la globina

Hibridación in
situ

Control sin inducir Células inducidas con 2% DMSO

 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Interacción Célula-Matriz.
Los componentes de la matriz extracelular que rodean la superficie de la mayoría de
las células inducen la diferenciación.

Colágeno

Laminina

Proteoglicanos
Proteoglicanos

Citoquinas

Interacción
Célula-matriz
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Polaridad y forma celular.
En algunas células como los hepatocitos se requiere
para su completa maduración el crecimiento sobre un
gel de colágeno y la posterior liberación del gel desde
el fondo de la placa con una espátula, lo que hace
comprimir el gel y la alteración de la forma de la
célula (desde aplanada a cuboide).

Forma celular
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Aspectos prácticos de la diferenciación.
Con las condiciones ambientales adecuadas y asumiendo que se tiene
la célula apropiada, es posible obtener una diferenciación parcial o
completa en cultivo.
Algunas indicaciones importantes para la Diferenciación
celular:

Seleccionar el tipo celular adecuado.

Crecer las células a alta densidad y en la matriz adecuada.

Cambiar las células a un medio de diferenciación en vez de
proliferación.

Agregar los agentes inductores de la diferenciación.
 Diferenciación

Inducción de la Diferenciación.
 Ej. Diferenciación de pre-adipocitos 3T3L1 hacia
adipocitos in vitro.
Subconfluentes Confluentes 5 días Post-Inducción

Medio de proliferación: Medio de Diferenciación

DMEM + 10 % FCS. -Insulina (final conc. 1,7 µM).
-Dexametasona (final conc. 1 µM).
-IbuMeXan (final conc. 0,5 mM).
-DMEM + 10%FCS