UD4.

Técnicas de obtención de Cromosomas

El análisis cito genético consiste en la visualización de los cromosomas. Es
decir la obtención de un cariotipo de una persona con el fin de detectar la
presencia de alteraciones en el número o estructura de los cromosomas.

Para visualización de cromosomas se hacen cariotipos. Se distinguen el

cariotipo constitucional y el hematológico. En ambos casos se siguen
pautas comunes pero tienen diferencias.

El cariotipo constitucional es el que está presente en todas las células de un

individuo. Excepto en las células sexuales (óvulos y espermatozoides) y se
mantiene invariable a lo largo de la vida del individuo. Para saber si hay
alteración en número o en estructura se hace un cariotipo constitucional:
debe ser IGUAL todas las células en toda la vida del organismo. Es invariable

En cambio se habla de Cariotipo hematológico en los procesos

oncohematologicos donde la alteración cromosómica puede variar
dependiendo de la evolución del proceso.

Para la visualización de los cromosomas resulta esencial que estos se

encuentren en su estado de máxima condensación, es decir en su estado de
metafase. Interesa observación cromosomas en metafase en tejido en
división o forzar la entrada en división a cultivo celular.

(La visualización directa de las metafases solo es posible en tejidos que

dividen espontáneamente es decir en aquellos que tienen proliferación rápida
tales como las gónadas medula ósea , trofoblasto o tejidos con tumores. Por
tanto el cultivo in vitro de células y tejidos humanos constituye una parte
básica del trabajo.

Unas vez realizado el cultivo y obtenidos los cromosomas metafásicos para la

visualización de los cromosomas al microscopio hay que extender los
cromosomas en un porta y aplicar técnicas de tinción y bandeado para que
permitan su contaje e identificación.

Metafases + tinción/bandeado (porque en el bandeado es para ver zonas más

claras y más oscuras por los porcentajes de citosinas guaninas) y observación
al microscopio óptico.

4,2 Técnicas de obtención y mantenimiento de los cultivos. Cultivos

celulares

El objetivo de los cultivos celulares en citogenética es obtener un número

suficiente de células en metafase que permitan el análisis cromosómico. Los
protocolos de cultivo varían dependiendo del tipo de célula

Los cultivos celulares tienen que ser adecuado para cada tipo celular. Hay
variedad de PNTs: Hay que tener suficientes numero de Metafases.
4.2.1Tipos de cultivos celulares:

1-Los cultivos celulares se pueden clasificar según el estado en el que se

encuentran las células en dos tipos;

- Suspensión: Las células cultivadas están en suspensión en el medio de

cultivo. Este tipo de cultivo es el empleado para el cultivo de linfocitos de
sangre periférica o de medula ósea. Son cultivos de corta duración 24-72h por
lo que no necesitan cambio de medio. Ya que los nutrientes no llegan a
agotarse. Son células sueltas ej. linfocitos - De corta duración (24 – 72 h) no se
agoten los nutrientes

- Monocapa: Las células se pegan al fondo del recipiente de cultivo y forman

colonias. Se usa para el cultivo de fibroblastos y células de tejidos sólidos.

Son cultivos de larga duración de larga duración (de 8 a 15 dias ) y los

nutrientes se agotan, por lo que es necesario renovar el medio cada 2 o 3 días.
Dado que las células crecen pegadas al fondo del frasco, tapizan el fondo de la
botella para su posterior procesamiento será necesario despegarlas con un
tratamiento con una enzima proteolítica. ( Se le hecha tripsina para
despegarlas de la base)

2.En función de si se realizan o no subcultivos, los cultivos se clasifican en

primarios , los que proceden del inicial ) y cultivos secundarios, que se
derivan de los resembrados.

Resiembra

- SI no hacemos resiembra se llaman cultivos primarios: sin subcultivos

- SI hacemos resiembra se llaman: Secundarios: con resiembras como los

monocapa.

3-Dependiendo de la forma en que mantienen el pH del medio se pueden

clasificar en cultivos abiertos y cerrados.

pH (7 – 7,4):
- Cerrados: Los cultivos cerrados son aquellos que en los que los tubos o
recipientes están herméticamente cerrados Estos cultivos llevan HEPES
(Compuesto químico tampón) para amortiguar los cambios del pH. En general
son los preferidos por muchos laboratorios de cito( no requieren regulación de
gas y humidificación y permiten el uso de incubadoras más sencillas.

- Abiertos: Los cultivos abiertos son aquellos en los que los recipientes se
dejan entreabiertos dentro de la incubadora, que posee una con atmosfera de
con un 95% de aire y un 5% de CO2. Esta composición evita que el CO2
formado por el metabolismo celular abandone el medio cultivo. Si se escapa
su perdida alcalinizaría el medio

Toma nota.

El mantenimiento del pH del medio de cultivo entre los limites 7 7.4 es

fundamental para la supervivencia de las células. Se puede conseguir
añadiendo un buffer como el HEPES al medio de cultivo o bien con una
atmosfera de CO2,

SIEMBRA DE CELULAS

4.2.2 Determinación del número y viabilidad celular.

En el cultivo de algunos tipos de muestras ( especialmente en el análisis

cromosómicos en enfermedades oncohematologicas la cantidad de muestra
que se va a sembrar debe ajustarse a la densidad celular.

Previamente a sembrar podemos necesitar:

Ajustar y conocer la densidad celular del cultivo. Sobre todo es importante

en estudios oncohematológicos

• Manualmente: Con cámara de Neubauer. Es método manual de contaje al

microscopio con una cámara neubauer

• Contador automático : Coulter

Viabilidad: para no fracaso en el cultivo:

Al establecer los cultivos celulares es importante conocer la viabilidad

celulares decir el porcentaje de células vivas con respecto al número total de
células. La viabilidad celular puede determinarse midiendo la integridad de las
membranas mediante la utilización de tintes como la eritrosina o el azul
trypan. Si las células no están vivas la membrana no está integra , por lo tanto
el colorante penetra en el interior de la célula y están aparecen teñidas al
observarlas al microscopio.

Tinción de membrana (eritrosina, azul de trypan, etc.) teñidas son las no

íntegras, las muertas.
4.2.3 Muestras para análisis cromosómico a estudio

Para realizar un estudio cromosómico se pueden tomar diferentes muestras

( sangre medula ósea tejidos) En principio se pueden estudiar los cromosomas
de cualquier célula pero dependiendo de tipo de su estudio se hace se
utilizan diferentes muestras . En el cuadro 4.1 se refleja las habitualmente
usadas.

Importante: Todas las muestras para el análisis citogenetico deben ser

extraídas y conservadas en condiciones estériles y llegar lo antes posible a
laboratorio , refrigeradas en espera para su estudio, NO congelación porque se
dañan las células. Las células sobreviven durante unos días si se refrigeran
pero mueren si se congelan o exponen a altas temperaturas.

Hacer cálculos de la ficha final del tema 3 para la práctica.

4.3 Cultivos de linfocitos de sangre periférica para

estudios citogenéticos constitucionales.
Pág 114 para cariotipo constitucional (nº CRs) El cariotipo constitucional es
la dotación cromosómica que tienen todas las células somaticas y que no
cambia a lo largo de la vida

La sangre periférica es fácil de obtener. El estudio del cariotipo constitucional

de una persona se realiza sobre un cultivo de células blancas que son células
nucleadas capaces de sufrir división celular cuando se agrega un agente
mitogeno.

Se usa sangre total porque los eritrocitos parece que no interfieren en la

división del de los linfocitos.

El agente mitógeno de uso común en laboratorio de citogenética es la

fitohemaglutinina PHA mucoproteina que se comporta de manera similar a un
antígeno extraños y estimula la división de los linfocitos mediante el aumento
de la síntesis de ADN.

Condiciones preanaliticas de las muestras.

 Obtención
 Conservación
 Rechazo

A ) Obtención

La sangre se obtiene normalmente por venopuncion en niños y adultos.( en lso

mas pequeños sangre capilar con peores resultados)

1.-Sangre (tabla 4.2.) procedencia según los casos

B) Conservacion

Las muestras deben procesarse lo antes posible. Aunque pueden conservarse

de 2 a 4 dias a 4ºC.( no congelar si someter a altas temperaturas.

La sangre ha de recogerse en un tubo esteril que contenga como

anticoagulante heparina litio sodio, EDTA no se usa porque es toxico para
cultivo. El anticoagulante evita la formación de un coagulo que atrapa las
células sanguíneas. No debe utilizarse EDTA ya que es toxico para las células
y afecta negativamente al cultivo celular.

C) Rechazo

Las muestras hemáticas coaguladas o que no es encuentren en el contenedor

adecuado darán lugar a fallo en los cultivos. Estas muestras podrán
rechazarse pero si es preciada se puede intentar.
Desechar si no ok condiciones de la muestra (ej. hemolizada, baja cantidad,
etc.) si no son preciadas en estas intentar usar. Como por ejemplo dificultad
de obtención, etc.

4.3.2 Siembra de la muestra

 Cantidad de sangre que sembrar

 Medio para el cultivo de linfocitos.
 Protocolo de preparación de medio de cultivo completo

a) Cantidad de sangre que sembrar

La siembra en condicione de esterilidad en la cabina de flujo laminar.

La cantidad de sangre que sembrar debe ajustarse a las características de la

muestra ya que varía la cantidad y vitalidad de los linfocitos presente s en la
muestra.

Se pone X vol sangre en 10 mL medio de cultivo No memorizar los minimo

por consenso. Se pueden modificar. Si tenemos problemas se cambia.

b)Medio para el cultivo de linfocitos.

El medio generalmente utilizado para el cultivo de linfocitos es el RPMI 1640**

c) PROTOCOLO DE SIEMBRA DE LINFOCITOS.

0

4.3.3 TECNICAS DE CULTIVO Y OBTENCION DE LOS CROMOSOMAS

Una vez transcurridas las 72h de cultivo se alcanza el mayor índice mitótico;
llegado este momento es necesario parar la división celular en esta etapa de
metafase antes de que los cromosomas vuelvan a entrar en estado de interfase
en el que se encuentran de nuevo descondensados. El proceso de parada de
los cultivos se denomina en terminología citogenética como cosecha o sacrificio
del cultivo. Para ello se utilizan inhibidores del huso acromático de modo que
bloquee el ciclo celular en estado de metafase.

A) Inhibidores del huso acromático (El rosa primero)

Existen varios productos químicos que previenen la formación de las fibras del
huso acromático que se insertan en el centrómero de cada cromosoma antes
de la división mitótica y tiran de las cromátidas hermanas separándolas en
anafase. Estos productos químicos incluyen vinbaltina y Colchicina ( igual que
el Colcemid).

Importante: El tiempo con Colcemid.

El tiempo en Colcemid es proporcional al índice en metafase: a mayor tiempo

de Colcemid mas células se pararan en estado de metafase pero una
exposición prolongada al Colcemid da como resultado una reducción de la
longitud del cromosoma ya que los cromosomas en metafase se vuelven
progresivamente más cortos con el tiempo. Por lo tanto se debe buscar una
situación intermedia en la que haya un número suficiente de metafases con
cromosomas de una morfología suficientemente alargada para facilitar la
buena resolución de las bandas, de 1.5 a 2h de tratamiento con Colcemid.

B) Protocolo de tratamiento -siembra, con Colcemid: Los tiempos no

entran en el examen.

A las 72h de cultivo a 37ºC el índice mitótico de la muestra alcanza su nivel

máximo Con la finalidad de parar las células en división en el estado de
metafase se añade el Colcemid (inhibe la polimerización de los micro túbulos
del huso mitótico) a los cultivos siguiendo el siguiente protocolo:

Protocolo de tratamiento con Colcemid

(Sacar los cultivos del incubador)

 Adicionar 0,2 Ml Colcemid / 10 mL

 Mezclar
 Incubar 37ºC de 45 a 60 minutos. ( recordar que si es más tiempo de
acortan los cromosomas)

C). Tratamiento con una solución hipotónica:

Una vez paradas las células en el estado de metafase se someten a un

tratamiento con una solución hipotónica que origina un hinchamiento de los
cromosomas. Con el objetivo de conseguir una buena separación
cromosómica, las células deben someterse a choque osmótico. Para ello, se
emplea un medio hipotónico (0,075M KCl), que ocasiona el aumento de
volumen de las células.

Las células tienen que ser fijadas

Una disolución hipotónica es una disolución con una concentración salina

menor que en el citoplasma de la células, por la ley de osmosis habrá un
movimiento de h20 desde la solución hipotónica al interior de la célula a
través de la membrana celular Esto origina que las células se hinchen y
estallen muchos de los eritrocitos ( la solución adquiere un tono marrón
debido a lisis de los eritrocitos, la hemoglobina que da color rojo al cultivo se
convierte en hematina que es de color marrón oscuro) Si aparecen coágulos
de color marrón oscuros hay que eliminarlos con una pipeta ( estas son las
células que dan lugar a un índice mitótico bajo)

El tratamiento hipotónico es una etapa crítica que requiere control exacto de

su duración. Las células deben tratarse suavemente sin movimientos bruscos
par no den lugar a metafases incompletas y evitar pasar el pellet por pipetas
de puntas estrechas.

Sirve para complementar el tratamiento con Colcemid y ayuda da la dispersión

de los cromosomas

Protocolo de choque hipotónico:

1. Centrifugar 10 minutos a 1.000 rpm

2. Eliminar sobrenadante por aspiración

3. Se resuspende el pellet y añadir goteo 10 mL solución hipotónica KCl

0,075M atemperada ( precalentada a a 37º) medio bajo en sales con lo cual la
célula se hincha , mezclar ((hinchamientos de cromosomas, y estallan
hematíes))

4. Incubar 37ºC en un baño durante 10 minutos.

Recuerda: El tratamiento con la solución hipotónica hincha las células Es una

etapa crítica y su duración debe estar bien controlada.

D) Fijación

El fijador habitual ( Carnoy) para preparaciones de cromosomas es una mezcla

recién hecha de 3 partes de alcohol ( etanol absoluto o metanol) y una parte de
ácido acético glacial. Si se cambia la proporción 3; 1 se afecta de forma
negativa la morfología de los cromosomas. Esta mezcla debe conservarse en
frio hasta su utilización

Protocolo de fijación:

1. Se centrifuga la muestra 10 minutos a 1.000 rpm ( con esto se elimina el

producto que hemos usado anteriormente). Importante.

2. Eliminar sobrenadante por aspiración

3. Se resuspende pellet y se añade gota a gota ( eso es directamente en el tubo

sin pegarse a la pared) mediante agitación suave para que se mezcle conforme
cae, 5 mL de una solución fría recién preparada de fijador. ( solución fijadora
Carnoy)

4. Se mantiene 20 minutos en el congelador a -20ºC

5. Repetir pasos 1 a 3 hasta que sobrenadante transparente.

Se centrifuga de nuevo repitiendo al operación un total de 3 veces (el

sobrenadante debe quedar transparente) Si no es transparente hay hematíes
con hemoglobina.
A partir de ese momento las muestras se pueden conservar a 4ºC hasta el día
siguiente.

Un exceso de exposición a ácido acético origina la rotura prematura de la

membrana celular dando lugar a la perdida de cromosomas.

Tanto el alcohol ( metanol)como el ácido acético glacial deben permanecer en

recipientes herméticos para evitar que absorban agua. El alcohol que contiene
agua no hidrata bien las células ocasionando resultados negativos en la
obtención de metafases porque la evaporación del alcohol desempeña un papel
importante en la separación de los cromosomas en las metafases cuando se
hacen las extensiones.

Una fijación insuficiente da lugar a metafases con material amorfo sobre los
cromosomas e interfiere en la obtención de bandas, En este caso las
metafases son acristaladas como de huevo frito.

E. 4. 3.2 TÉCNICAS DE OBTENCION DE LAS EXTENSIONES

Para poder estudiar los cromosomas al microscopio el pellet celular se

extiende sobre un portaobjetos (importante que esté limpio y libre de grasa)
para asegurar una buena difusión.

E.1. MÉTODO HÚMEDO E.2. MÉTODO FLAMEADO

a) Método húmedo

b) Método flameado

Hacer nosotros del libro Pago 123 del libro Poner los dos.

C) Calidad de los cromosomas… superIMPORTANTE

La extensión del material en los portas es una etapa crucial ya que las
metafases se abren al secarse el material en el porta. Se examinan las
preparaciones bajo el microscopio de contraste de fases, debe observarse la
densidad de células y metafases, la distribución de los cromosomas en la
metafase y el grado de condensación de los cromosomas.

-Densidad. Se ajusta diluyendo o concentrando la suspensión celular. Una

altea densidad celular provoca un retraso en el secado de la extensión
mientras que un bajo numero de metafases dificulta el análisis cromosómico.

-Distribución de los cromosomas en la metafase.

-Morfologia de los cromosomas

Los cultivos no se usa EDTA porque la amida es toxica para el crecimiento

celular. Se usa heparina.

Colcemid: inhibir formación del uso.

4.3.5 TINCIÓN CON GIEMSA

Las tinciones una vez secas pueden teñirse con una disolución Giemsa al 2%
en buffer fosfato. Para ello se cubre el porta con la solución de tinción. Se
deja 10 minutos se lava con agua destilada y se deja secar.

Con este proceso obtenemos metafases en las que todos los cromosomas están
teñidos uniformemente, se pude con esta técnica contar el número de
cromosomas y la morfología de cada uno pero no es útil para la identificación
de cada cromosoma.

Mediante la tinción con Giemsa solo es posible detectar alteraciones en el

número total o por grupos de los cromosomas, no permite saber que
cromosoma esta en defecto o en exceso.

Protocolo para la tinción con Giemsa. 0. extensión seca

1. Solución Giemsa 10’

2. Lavar H2Od

3. Secar

4. Observar el “MORFOLOGICO”

4.4 TÉCNICAS DE BANDEO CROMOSÓMICO

Las técnicas de bandeo originan una serie de marcas en forma de bandas y

subbandas a lo largo de cada cromosoma (blancas negras y grises)
características para cada cromosoma que permiten su identificación individual
y el estudio de su estructura para determinar la presencia de anomalías
cromosómicas en su estructura.
Hay descritas numerosas técnicas de bandas pero las más utilizadas en los
laboratorios de citogenética son las bandas CTG. CGB y NOR.

BANDAS GTG

Las bandas G por tripsina utilizando Giemsa es la técnica que se utiliza

habitualmente para la obtención del cariotipo.

Consiste en un tratamiento con Tripsina antes de la tinción con Giemsa O

Wright. La tripsina digiere las proteína; en las zonas de mayor condensación
de los cromosomas la digestión será peor se observaran zonas transversales
oscuras, que contiene ADN rico en bases AT que replica tardíamente y son
pobres en genes constitutivos. Las regiones menos condensadas aparecerán
más claras; contienen DN rico ene G-C que replica tempranamente y tienen
muchos genes constitutivos.

Cada cromosoma posee unas bandas claras y oscuras características que

permiten su identificación Imagen 4.6

Dependiendo del grado de condensación de los cromosomas estos pueden

aparecer más largos o más cortos. A mayor longitud de los cromosomas
mayor será el número de bandas de que se podrán observar. Por tanto será
mayor la resolución del cariotipo. La resolución necesaria es de un mínimo de
450-550 bandas( suma de las bandas de los 46 cromosomas

A medida que los cromosomas están menos condensados cada banda a su

vez se subdivide en subbandas. El tiempo de tratamiento con la tripsina es un
punto clave para conseguir metafases de buena calidad Imagen 4.8

• Si en el tratamiento con tripsina la concentración es escasa casi no existirán

bandas, si es alta el cromosoma esta como hinchado.

No esta en sus apuntes el Protocolo bandas CTG ( con giemsa)

 Poner los portas a 60ºC al menos 16 h antes.

 Preparar la solucion de tripsina e incubar a 37ºc


BANDAS CBG

Las bandas CBG consisten en un tratamiento con acido clorhídrico,hidróxido

de bario y tinción con Giemsa. Se utilizan para obervar la heterocomatina
constitutiva dfe los cromosomas Esta se encuentra en todos los centrómeros
subcentromérica de CR1, 9, 16 y extremo final CR Y brazo Q
Se hace un tratamiento con ácido HCL Y BAOH2 que digiere todo el
cromosoma excepto las regiones más condensadas que corresponden a la
heterocromatina constitutiva. Posteriormente se tiñe con Giemsa durante 45
minutos.

4.4.3 BANDAS NOR nitrato de plata

• Las bandas NOR permiten la visualización de las regiones de los

organizadores nucleolares de los cromosomas mediante el tratamiento con
nitrato de plata.

Los organizadores nucleares contienen (en los satélites de algunos CRs

acrocéntricos) Mediante las bandas NOR se tiñen una proteínas adyacentes a
las regiones de los organizadores nucleolares; estas regiones se encuentran en
los satélites de los cromosomas acrocentricos.( aunque no todos los
cromosomas acrocentricos tienen satélites) asi cada individuo tiene un patrón
caracterisitico de bandas NOR. Las bandas NOR y bandas C son utiles para
detectar variantes ocasionales de la morfología o heteromorfismo. Estas
alteraciones son normalmente benignas y reflejan la cantidad o tipo de
secuencias de ADN satélite en un determinado lugar del cromosoma.
Región organizadora nucleolar

La región organizadora nucleolar (o NOR, del inglés: nucleolar organizer region) es el sitio del cromosoma
donde se localizan los clusters de genes ribosómicos (ADNr), que codifican para el ARN ribosómico y que está
asociado a una constricción secundaria.

Sólo son visibles las NOR dominantes, ubicadas en los cromosomas específicos que forman el nucléolo. El resto
de la cromatina ha sido retirada.

Se localizan en un número de cromosomas que varía dependiendo de cada especie. La existencia de una
constricción secundaria en esa región cromosómica hace que al segmento cromosómico existente entre la
constricción secundaria y el extremo del cromosoma se le denomine satélite cromosómico, de ahí la
denominación de cromosomas SAT a aquellos cromosomas donde se encuentran las NORs.

Internet: Algunos cambios en la morfología de los cromosomas, detectados durante el análisis citogenético,
no están asociados con defectos clínicos, representan un dilema para el asesor genético principalmente
durante la realización de un estudio prenatal; por esta razón es que una apropiada discriminación entre
una variante inocua y una verdadera anomalía resulta crucial para llevar a cabo un asesoramiento genético
preciso. Los polimorfismos de la heterocromatina son identificados usualmente por técnicas de bandeo
específicas y consideradas como variaciones mendelianas sin una significación clínica. De igual modo, en la
literatura se expone la presencia de variantes en regiones eucromáticas que después de un análisis
detallado resultan ser de naturaleza benigna. Debido a la importancia de este tema en la actualidad se hace
necesario proponer un protocolo a seguir en los laboratorios cada vez que una variante cromosómica sea
detectada en el diagnóstico prenatal. El objetivo de este trabajo es presentar una revisión de la literatura
acerca de los pasos que se siguen ante la aparición de una variante cromosómica y las sugerencias que se
brindan para un manejo más adecuado.

No pone el protocolo en sus apuntes

4.5 Cultivo de linfocitos sincronizados, Cariotipo de alta

resolución.
“Colcemid” detiene la mitosis en metafase tardia = alto º condensación

à menor resolución de bandas

0. cultivar 48h

1. Bloquear células antes de la síntesis de ADN (“MTX”): 17 h

2. Desbloquear las células (=ahora sincronizadas en fase para completarla

div.celular): 5 h

3. Añadir “Colcemid” antes del periodo* del ciclo para que haya mayornúmero
de céls en fases anteriores a metafase: 10 – 15’

4. Continuar igual

Diagnóstico celular en diagnóstico prenatal

• Amniocentesis semana 16-18: suf líq y fibroblastos (=

céls.tej.epitelial feto por descamación)

• No necesitan ag.mitógeno* (pq div.espont)

• 20 mL (y separar en 2 alícuotas*)– T.amb – t < 24h y hasta

48 h refrig

• Medio Ham’s, pref: Chang (ya todo incluido), …

• Se pegan al fondo frasco**

• 10 – 15 d à decantación para renov medio

• Subcultivos si crecen lentamente (tripsina)

• Revision- observ m.op. Invertido constraste fases

• Sacrificio (previa tripsinización sin cambio de tubo, día anterior para

despegar y aumentar índice mitotico)

• MVC Semana 10 – 13:

• cultivo y FISH directa (trisomías CR 21, 13 y 18, X e Y)

• Protocolo similar a anmioc: pero aquí tb procesamiento previo (separac’ del

resto de tejs (decidua+) y troceado)

• Cordocentesis después sem.18, pref detecc.anemia

• Similar protocolo a linfocitos

• Si otros tejidos à protoclo similar a fibroblastos (…)