Apoptosis de células granulosas en el folículo ovárico: una visión cambiante

Introducción
La tasa de embarazo y la calidad de los ovocitos se han relacionado con la incidencia de apoptosis en mujeres
que reciben tratamiento de fertilización in vitro (FIV) ( 1 ). Los pacientes de peor pronóstico (como las
mujeres mayores) tuvieron una mayor incidencia de apoptosis (número de cuerpos picnóticos), mientras que
los folículos que produjeron ovocitos que fertilizaron tuvieron niveles más bajos de apoptosis de células de la
granulosa ( 1 , 2).) Varios factores de crecimiento y hormonas son antiapoptóticos, como las proteínas
morfogenéticas óseas (BMP), la hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y el
estrógeno. Estudios recientes de nuestro grupo informaron que la expresión de las células de la granulosa de
los receptores (R) de FSH (FSHR), BMP (BMPR1B) y LH (LHR) se reducen y desregulan en mujeres
mayores; sin embargo, en la misma cohorte de mujeres, la apoptosis de células de la granulosa fue más alta en
las mujeres más jóvenes que en las mayores ( 3 - 5 ). Diferentes técnicas se han aplicado históricamente para
determinar el nivel de apoptosis. A la luz de los informes recientes sobre el análisis de la apoptosis, surge la
pregunta de si la apoptosis es una medida precisa para la interpretación de la calidad de los ovocitos.
Necrosis y apoptosis: características morfológicas
La necrosis resulta de la exposición celular a una toxina o agente destructivo que causa hinchazón y alteración
de los orgánulos de la célula, lo que produce una descomposición irreversible de las membranas de la célula y
la dispersión de los contenidos citoplásmicos y nucleares ( 6 ). Esto conduce a una respuesta inflamatoria
marcada por el cuerpo. Sin embargo, la apoptosis es causada por varias vías de señalización distintivos, que
culminan en la contracción de la célula, formación de ampollas en citoplasmática, y la compartimentación de
los orgánulos (Figura (Figura 1)1 ) ( 7 - 9) Característicamente no hay una respuesta inflamatoria
consecuente. Aunque las membranas celulares pierden integridad, se pliegan y encapsulan (formación de
ampollas) para evitar que el contenido afecte a las células vecinas, una característica que no se observa en las
células de la granulosa necrótica ( 10 ). Las células apoptóticas típicamente tienen cuerpos picnóticos, en
forma de media luna o redondeados oscuros de ADN denso, fragmentados en secciones más pequeñas. Sin
embargo, la mayoría de las células picnóticas en las capas medias de la membrana granulosa habían sido
consumidas por células sanas adyacentes.

Figura 1
Células de la granulosa periluteal y morfología celular. Se recogieron células de la granulosa humana de un folículo de
15 mm durante un ciclo de fertilización in vitro en el momento de la recolección de los oocitos. Las células de la
granulosa son células peri-lúteas; sin embargo, el citoplasma es aún relativamente compacto en comparación con las
células de la granulosa recogidas de los folículos ovulatorios ( 5).) Las células de la granulosa tienen un agrupamiento
denso de organelas alrededor del núcleo redondo grande (N). El citoplasma aparece granular durante las últimas etapas
de la fase folicular; grandes gotas de lípidos contienen hormonas. Se muestran extrusiones citoplásmicas o blebbing, que
indica apoptosis tardía (*); cuerpos apoptóticos (a); organelos (o) agrupados alrededor del núcleo. La célula de granulosa
sana (N) sin formación de ampollas engulle un núcleo de células de la granulosa apoptótica vecino (N1) a través de
la fagocitosis ( 10 ). Bar 5 μm
La necrosis y la apoptosis ambas culminan en la muerte celular de la célula de la granulosa, y los tintes
nucleicos que tiñen el material de ADN se usan comúnmente para indicar la vitalidad de las membranas
celulares ( 11 ). Excepcionalmente, la célula granulosa apoptótica continuará sintetizando hormonas esteroides
hasta que las membranas mitocondriales se vean alteradas. El funcionamiento de las células de la granulosa
apoptótica se reorganiza el citoplasma celular, creando ampollas de organelos no citoplasmáticos en la
periferia; y mitocondrias, aparato de Golgi y retículo endoplásmico, que se agrupan alrededor del
núcleo; grandes vacuolas llenas de líquido que contienen esteroides, lípidos y proteínas también se acumulan
( 12 , 13)) La célula granulosa expande y reorganiza el contenido del citoplasma, formando nuevos orgánulos,
particularmente el retículo endoplásmico liso (SER) para la producción de progesterona ( 13 ). El SER y las
mitocondrias se ensamblan en estrecha asociación con el núcleo ( 8 , 13 ). La mitocondria y grande, redondo,
gotitas de lípidos están estrechamente asociados con la SER, todos los cuales han aumentado
considerablemente en número, y se agrupan alrededor del núcleo para aumentar la eficiencia de la síntesis de
esteroides(Figura 2) ( 8 ).

Figura 2
Diagrama esquemático de la caracterización de células de la granulosa desde fase folicular a fase lútea. En una
progresión dependiente de la etapa, la granulosa se diferencia de una célula compacta de 8-15 μm con un núcleo redondo
grande y citoplasma relativamente pequeño ( 12 ). El citoplasma contiene mitocondrias, retículo endoplásmico rugoso,
aparato de Golgi, gotas de lípidos y muchos otros orgánulos ( 14 ). A medida que la célula de la granulosa madura, los
orgánulos proliferan y el citoplasma se expande para adaptarse a la nueva capacidad esteroidogénica. Una célula de
granulosa totalmente luteinizada, de 25-30 μm, contiene un gran volumen de mitocondrias, gotas de lípidos llenas de
esteroides y retículo endoplásmico liso / rugoso, y tiene la capacidad de producir progesterona directamente ( 8).) En
cualquier etapa de crecimiento folicular, la célula de la granulosa puede sufrir apoptosis. La apoptosis temprana se
caracteriza por el colapso de las membranas celulares y la condensación de la cromatina, que a menudo se polariza en
el núcleo con los orgánulos agrupados adyacentes ( 15 ). La apoptosis temprana en una célula granulosa con un
citoplasma expandido se modifica de manera similar con un mayor volumen de orgánulos agrupados alrededor de un
núcleo colapsado. Las últimas etapas de la apoptosis terminan con la compartimentación de organelos en ampollas y la
extrusión de cuerpos apoptóticos que pueden contener materia nucleica.
Durante la luteinización, las células de la granulosa forman microvellosidades irregulares y uniones estrechas
entre las células, mientras que en una célula granulosa apoptótica, la membrana celular se desintegra y se
forman espacios ( 12 ). La célula de la granulosa apoptótica continúa produciendo esteroides en grandes
folículos antrales hasta que se produce la ruptura mitocondrial completa ( 16 ).
Apoptosis de células de la granulosa: tres fenotipos, su iniciación y regulación
La atresia de los folículos ováricos se puede dividir en tres fenotipos, cada uno con diferentes mecanismos de
iniciación y regulación, pero todos implican apoptosis de células de la granulosa ( 17 ). La primera, la llamada
"atresia antral", afecta las capas prolíficas medias de las células de la granulosa, y la apoptosis progresa hacia
el antro. El segundo, "atresia basal", se produce en las células de la granulosa más cercanas a la lámina basal
de los folículos antrales muy pequeños. Las células luteinizan prematuramente y comienzan a producir
progesterona; sin embargo, no completan la luteinización, con la posterior muerte celular ( 17 ). Una tercera
forma de apoptosis en los folículos preovulatorios se conoce como "apoptosis de diferenciación terminal" y es
similar a la desprendimiento de células epidérmicas de la piel ( 10 , 18).) Las células de la granulosa que se
desprenden de la superficie antral forman glóbulos que se agregan y flotan en el líquido antral ( 10 ). Los
glóbulos tienen un diámetro promedio de 40 μm y se tiñen positivamente para el yoduro de propidio (PI), lo
que indica que sus membranas celulares están comprometidas. Sin embargo, el ADN no está fragmentado, es
de alto peso molecular y tiene un resultado negativo en la fragmentación del ADN para el ensayo TUNEL
(terminal deoxy-UPT nick end-labeling). La mayoría de la muerte celular en la membrana granulosa
es vía"Atresia antral". Los cuerpos apoptóticos y la formación de ampollas citoplásmicas son típicos de la
apoptosis antral, mientras que las células apoptóticas en la sección media o basal de la membrana granulosa
suelen ser engullidas por células de la granulosa vecinas sanas y / o macrófagos infiltrantes. Hay tres áreas
principales de inducción de apoptosis; factores de crecimiento, receptores de muerte y daño celular. La
apoptosis puede ocurrir en cualquier etapa del desarrollo del folículo. En los folículos pequeños, las células de
la granulosa son compactas con grandes núcleos redondos. A medida que el folículo madura, la granulosa
predominantemente productora de estrógenos se diferencia esteroidegénicamente, aumentando el volumen de
mitocondrias y SER. La apoptosis en esta etapa de desarrollo daría como resultado la condensación de los
contenidos nucleicos y la agrupación de los orgánulos alrededor del núcleo. En las últimas etapas de la
apoptosis, las membranas celulares se descomponen y los contenidos se compartimentan en cuerpos
apoptóticos.
Principales vías de señalización de apoptosis en el folículo ovárico
Existen tres vías principales de señalización para el desarrollo de apoptosis en células de la granulosa ( 19). El
primero son los altos niveles de cAMP inducidos por el factor de crecimiento a través de la granzima B; el
segundo afecta la función mitocondrial a través de la activación del miembro de la familia Bcl2; y el tercero
utiliza factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y ligando Fas (FasL) -Fas y otros receptores de muerte; todos
los cuales dan como resultado la fragmentación del ADN de la caspasa inducida (Figura (Figura 3).3 ). En el
ovario, la granzima B es estimulada por las gonadotropinas y la forskoline para eludir las mitocondrias para
preservar su función en las primeras etapas de la apoptosis, a pesar de que puede haber ocurrido la
fragmentación del ADN y el colapso nuclear ( 16 ).

figura 3
Vías de señalización de apoptosis. El estrógeno es un importante impulsor del crecimiento folicular y sus efectos dan
como resultado la inhibición de la apoptosis. Hay tres áreas principales de inducción de apoptosis: 1. factores de
crecimiento, 2. receptores de muerte y 3. daño celular ( 20 ). Antes de la formación de la cavidad antral, los andrógenos
del folículo ovárico aumentan el receptor de la expresión de la hormona folículo estimulante (FSH) y los altos niveles
de actividad de BMPR1B, posiblemente a través de BMP6 y 7, suprimen la expresión de LHR ( 21 ). La cAMP-PKA
inducida por FSH antiapoptótica promueve la señalización de ERK1 / 2, que aumenta Bcl-2 y promueve la producción
de estrógeno a favor de la síntesis de progesterona ( 22 - 24) Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) 2, 4, 6 y 7
inhiben la síntesis de progesterona, que reduce la producción de caspasa 3, 6 y 7 durante la fase folicular ( 25 ). La
desregulación de las BMP induce la síntesis de granzima B que conduce a una mayor fragmentación del ADN ( 16 ). El
ligando Fas (FasL) y la actividad de TNFR inducen la fragmentación del ADN inducida por caspasa 8 ( 26 ). BMP 7
inhibe la actividad de caspasa 3. También se ha demostrado que el estrógeno a través del receptor de estrógenos reduce
la actividad de FasL ( 27 , 28 ). La apoptosis inducida por estrés a través de p53 causa la degradación mitocondrial
a través de la caspasa 9 ( 29).) La apoptosis mitocondrial depende de la proporción de factores pro y antiapoptóticos de
la familia Bcl-2 ( 30 ). La vía de señalización de Akt promueve la actividad antiapoptótica y está influenciada por la
actividad de cAMP-PKA inducida por estrógenos y factores de crecimiento ( 31 , 32 ).
La apoptosis también puede iniciarse por una serie de factores extrínsecos que pueden dañar la célula, como
el daño del ADN y el estrés oxidativo, que activan las vías de señalización específicas de p53 para
desencadenar mecanismos apoptóticos ( 8 , 19 , 33 ).
Por el contrario, muchos factores de crecimiento [como el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF),
factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)], así como las
gonadotropinas (FSH y LH) son antiapoptóticos, lo que crea un microambiente que garantiza supervivencia.
El estrógeno y la progesterona son los principales factores antiapoptóticos junto con FSH, LH, EGF, IGF,
FGF, prolactina, laminina, leptina y glucocorticoides. La capacidad de producción de esteroides de un folículo
se refleja en los niveles de hormonas en el suero y el líquido folicular de la cavidad antral del folículo bajo la
influencia de la proteína reguladora aguda esteroidogénica (StAR) ( 34 ). Los esteroides producidos por las
células de la teca y la granulosa proporcionan un efecto antiapoptótico de manera específica en el estadio
durante la foliculogénesis.
Después de la selección dominante del folículo, las mitocondrias de las células de la teca convierten el
colesterol en pregnenolona mediante la enzima de escisión de la cadena lateral del citocromo P450, mediada
por StAR. La pregnenolona es transportada fuera de las mitocondrias y convertida en progesterona por 3β-
hidroxiesteroide dehidrógeno. La progesterona se convierte luego en andrógenos, predominantemente en
androstenediona, dehidroepiandrosterona y testosterona, y se transporta de la célula de la teca a la célula de la
granulosa donde solía sintetizar estrógenos.
Durante la fase proliferativa de la foliculogénesis impulsada por estrógenos, la apoptosis de células de la
granulosa se inhibe por vías de señalización antiapoptóticas como la proteína quinasa B (Akt / PKB), la quinasa
regulada por señal extracelular (ERK), el EGF y las BMP. La vía de señalización de Akt promueve la actividad
antiapoptótica y está influenciada por la actividad cAMP-PKA inducida por estrógenos y factores de
crecimiento. El estrógeno inhibe directamente la apoptosis inducida por FasL a través del receptor de
estrógeno, que activa la vía dependiente de Akt ( 20 ). Además, se ha demostrado que los ligandos de BMP
inhiben la señalización de la apoptosis aguas abajo de estas vías de señalización en una serie de estudios
( 25 , 35 - 38 ).
La diferenciación inducida por la sobrecarga de LH de la célula granulosa le permite convertir el colesterol en
progesterona directamente, y los niveles aumentan sustancialmente. En el momento de la ovulación, el
aumento de LH induce a las células de la granulosa a expresar los receptores de progesterona. El folículo se
somete a luteinización inducida por progesterona y entra en la fase lútea, cesa la proliferación celular y los
niveles elevados de progesterona inhiben la apoptosis durante la formación del cuerpo lúteo ( 39 ).
Vías mitocondriales de apoptosis y las BMP
La apoptosis se induce a través de un cambio en el equilibrio de los factores proapoptóticos frente a los factores
antiapoptóticos. En la mayoría de las células del cuerpo, la apoptosis mitocondrial es la principal vía implicada
en la muerte celular programada. Sin embargo, en el ovario, la apoptosis temprana comienza en el núcleo de
las células de la granulosa, evitando las mitocondrias hasta la etapa posterior de la apoptosis. La familia del
gen del linfoma B de células B (Bcl-2) consiste en factores proapoptóticos y antiapoptóticos (~ 40 miembros
conocidos) asociados con la regulación de la apoptosis a través de las mitocondrias ( 27 , 40 ).
Proteínas morfogenéticas óseas tienen un inter-relación con el factor proapoptótico Bax (un derivado de
proteína prosurvival Bcl-2), y su relación con los factores antiapoptóticos (Figura (Figura 3).3 ). Bcl-2 se
opone a Bax y su destrucción de las membranas mitocondriales. Bax está presente desde el folículo primordial
en reposo hacia adelante; mientras que Bcl-2 solo está presente después de la transición de primario a
secundario, lo que puede influir en la pérdida del folículo primordial ( 41 ). BMP2, cuando se sobreexpresa en
tumores renales, señales a través de Smad 1, 5 y 8 (Smads, inicialmente identificadas en drosophila, son
transductores de señal para receptores de la superfamilia TGF-B) y aumenta la expresión de GATA-4, que
inhibe la actividad de Bax en las mitocondrias ( 42) (La familia del factor de transcripción GATA son
mediadores clave de los progenitores hemopoyéticos sp.) En el ovario de ratón, GATA-4 inhibe la
permeabilización de la membrana mitocondrial inducida por Bax ( 41 ). Por el contrario, BMP2 induce la
apoptosis en el hueso al aumentar la expresión de caspasa 3, 6, 7 y 9 ( 35 ), lo que indica una implicación
específica de tejido de BMP2.
En el ovario, BMP2 aumenta FSHR granulosal en folículos pequeños, y la señalización mediada por FSHR es
de naturaleza antiapoptótica ( 43 ). Esta acción ocurre independientemente de la proliferación de células de la
granulosa inducida por BMP2, destacando la capacidad de acción dual de las BMP para inhibir e inducir
actividad celular, e inducir respuestas diferenciales durante las diferentes etapas de la foliculogénesis.
El cultivo in vitro de células de la granulosa caprina con BMP2, 4, 6 y 7 reduce el porcentaje de fragmentación
del ADN ( 38 ). En el mismo estudio, el silenciamiento de FSHR aumentó la apoptosis. La neutralización de
BMP4 en roedores causa un aumento en la apoptosis de las células de la granulosa y el ovocito ( 37 ). BMP7
activa la caspasa 9 en células de la granulosa; sin embargo, BMP4 y 7 no tuvieron ningún efecto sobre los
niveles de los factores apoptóticos mitocondriales, Bax y Bcl-x1 mRNA ( 25 ). Además, BMP7 indujo
survivina e inhibidor ligado a X de la proteína de apoptosis para estimular la expresión de caspasa 3 y 9. BMP4,
sin embargo, los factores de aguas abajo de la caspasa 3 que culminaron en la reducción de la apoptosis (Figura
reducida (Figura 3)3 ) ( 25)
Regulación de BMPR1B y FSHR y su influencia sobre la apoptosis
Los ligandos de BMP están bien establecidos como reguladores de la proliferación de células de la granulosa
en ovejas ( 25 , 44 - 48 ), vacas ( 25 , 49 - 52 ) y humanos ( 3 , 5 , 22 , 23 , 53 - 56 ). Además, la apoptosis de
células de la granulosa aumenta drásticamente en el momento de la selección del folículo dominante cuando
la proporción de andrógenos es mayor que el estrógeno ( 49 , 57 - 59 ). El inicio de la selección del folículo
coincide con la regulación negativa de la expresión de células de granulosa BMPR1B y FSHR ( 3, 4 , 9 ).
En la transición del folículo pre-antral al antral, los altos niveles de BMP promueven la expresión de FSHR
dentro de las células de la granulosa. Los altos niveles de BMP6, 4, 7 ( 25 ) y BMP15 ( 60 ) al mismo tiempo
suprimen la expresión de LHR en células de la granulosa. Durante el posterior proceso de sección folicular, la
expresión de FSHR y BMPR1B se reduce junto con los ligandos de BMP 4, 6, 7 y 15, y esto puede facilitar la
regulación positiva de la expresión de LHR de células de la granulosa ( 61 ). Los folículos con células de la
granulosa que expresan LHR pueden continuar produciendo estrógenos y se reclutan en la cohorte
dominante. FSHR es protector contra la apoptosis; por lo tanto, a medida que disminuye el nivel de FSHR,
aumenta la apoptosis ( 4 ).
Durante el crecimiento continuo del folículo dominante seleccionado, los niveles de estrógenos aumentan a
un nivel crítico y desencadenan la luteinización. La luteinización regula negativamente el BMPR1B y los
FSHR en el folículo ovulatorio. La reducción de FSHR y el cese de la proliferación reduce momentáneamente
la síntesis de estrógenos y el equilibrio entre los factores proapoptóticos y antiapoptóticos. En las mujeres
mayores, la desregulación de FSHR granulosal y BMPR1B alteraría este equilibrio y se esperaría que cambiara
los niveles de apoptosis. También se observó un perfil alterado de expresión de BMPR1B en células de la
granulosa en ovejas jóvenes en comparación con las ovejas mayores ( 47 , 62 ). Además, la reducción inducida
por la mutación BMPR1B en los niveles de apoptosis asociados con la alta tasa de ovulación en las ovejas
Booroola ( 47).) fue confirmado recientemente por los niveles reducidos de GADD45A en los folículos de las
ovejas Booroola ( 62 ). (GADD45 alfa es una proteína de detención del crecimiento y daño inducible por el
ADN que es un marcador genético para la apoptosis).
Las células del cumulus granulosa que rodean el ovocito tienen niveles de apoptosis reducidos en comparación
con las células de la granulosa mural ( 2 , 63 ). El nivel reducido de apoptosis está asociado con el gradiente
de concentración del ligando de BMP que emana del ovocito ( 36 ). En el momento de la ovulación, la
luteinización expande el complejo ovocito-cúmulo, que cierra las uniones de comunicación entre el oocito y
las células del cumulus. La alteración del gradiente de concentración de las BMP da como resultado un
aumento en el nivel de apoptosis y una expresión reducida de LHR ( 64 ). Una vez que se produce la
luteinización, la progesterona se convierte en la principal hormona antiapoptótica.
La relación entre la apoptosis y la calidad de los ovocitos
En los programas de fecundación in vitro se reconoce desde hace mucho tiempo que menos del 10% de los
ovocitos recolectados se convierten en nacimientos vivos ( 65 ); por lo tanto, en la década de 1990 hubo un
esfuerzo concertado para encontrar un marcador de la calidad de los ovocitos para determinar mejor la
posibilidad de embarazo. Esto condujo a investigaciones sobre la relación entre la apoptosis y la calidad del
oocito. La degeneración de los ovocitos en forma de fragmentación del ADN se relacionó con la calidad de
los ovocitos ( 66 ) y se informaron niveles mayores de fragmentación del ADN en el ovocito de ratón
envejecido. El nivel de apoptosis de células de la granulosa aumentó en pacientes con FIV más antiguos,
similar a la observada en ratones, y esto se asoció con una reducción en la calidad de los oocitos, la
fertilización, el embarazo y la tasa de nacidos vivos ( 1 , 2 , 67- 69 ).

Estudios anteriores y teoría de la apoptosis

La gran proximidad de las células del cumulus al ovocito condujo a la investigación de la apoptosis de las
células del cumulus y su relación con la fertilidad y la calidad de los ovocitos. Lee et al. ( 70 ) encontraron una
fuerte asociación con la fertilidad; sin embargo, también se encontraron resultados contradictorios ( 71). Se
informa que el nivel de apoptosis de las células del cumulus antes del aumento de LH es inferior al 3%
( 2 , 72 ). Después de la adquisición de LHR ( 73 ) y la expansión del cúmulo lejos del ovocito, los niveles de
apoptosis aumentan tanto en el oocito como en las células del cumulus ( 71 ).
Sin embargo, las técnicas inicialmente empleadas para evaluar la apoptosis se basaron en la evaluación
mediante microscopía óptica del recuento o índice de células pyknotic. Lo que quedó claro en estos primeros
estudios fue la variación en el desarrollo de los folículos más pequeños no ovulatorios en comparación con los
folículos preovulatorios más grandes ( 7 ). Nakahara et al. ( 2) pasó a examinar el efecto de la edad del sujeto,
y en contraste con otros informes, observaron una tasa reducida de apoptosis de células de la granulosa en el
grupo de edad de más de 40 años. Este hallazgo fue eclipsado por el énfasis en el mayor nivel de apoptosis de
células de la granulosa en pacientes con "poca capacidad de respuesta ovárica" a la estimulación con
gonadotropinas. Por ejemplo, cuando la reserva ovárica se equiparaba indirectamente con el número de
ovocitos recogidos> 12 mm de diámetro, "independientemente de la edad", la tasa de apoptosis de células de
la granulosa era significativamente mayor. Esto implica que las mujeres con baja reserva ovárica, o peor
"receptividad ovárica" con la estimulación IVF, tenían niveles más altos de apoptosis de células de la
granulosa.
Los niveles de apoptosis dentro de las células de la granulosa también fueron mayores en las mujeres que no
quedaron embarazadas, y se asoció con pacientes con un nivel alto de FSH al comienzo de un ciclo (lo que
implica una reserva ovárica deficiente). Curiosamente, cuando se ajustó para los factores de confusión de la
edad y el número de ovocitos recuperados, la apoptosis de células de la granulosa se relacionó con el resultado
del embarazo y no con la reserva ovárica ( 1 ). Los resultados fueron significativamente confusos por muchas
variables no controladas y la metodología utilizada para evaluar la apoptosis tenía limitaciones.

Estudios recientes y teoría revisada de la apoptosis

Con la técnica más nueva de citometría de flujo, se podrían examinar más células de la granulosa (~ 5,000 por
folículo) y la fracción de glóbulos blancos podría eliminarse selectivamente usando cuentas magnéticas CD45
para el bloqueo de sustracción para mejorar la precisión de identificación de las células de la granulosa. Sin
embargo, la práctica común de agrupar las células de la granulosa recogidas de un rango de tamaños de
folículos de cada paciente impidió la identificación de las diferencias relacionadas con el tamaño del
folículo. Se introdujeron otros errores descartando selectivamente los folículos porque estaban contaminados
con sangre y por la superposición espectral entre el isotiocianato de fluoresceína y el PI que no se compensó
durante la citometría de flujo ( 1 , 68 ).
En la era actual de la investigación, es posible analizar individualmente las células de la granulosa recogidas
de un solo folículo de un tamaño conocido determinado mediante ultrasonografía ( 5 ). La población de células
de la granulosa puede seleccionarse selectivamente para eliminar los glóbulos blancos contaminantes usando
un anticuerpo monoclonal CD45. Antígeno leucocitario común; 7AAD (tinción de ADN muy roja) se puede
utilizar en lugar de PI para minimizar la superposición espectral o se puede realizar una compensación
citométrica de flujo.
El estudio reciente de Regan et al. ( 4 , 5) examinaron la relación entre la reserva ovárica, la densidad del
receptor de células granulosas y la apoptosis durante el desarrollo sano del folículo humano. El efecto de la
edad de las mujeres sometidas al protocolo de FIV sobre la tasa de apoptosis de células de la granulosa se
relacionó con el receptor de gonadotropina de superficie celular y la expresión del receptor BMPRIB. El
estudio demostró que la tasa apoptótica de células de la granulosa era más alta en folículos durante las dos
etapas críticas de la selección del folículo dominante y la etapa de maduración preovulatoria de la
foliculogénesis en mujeres jóvenes con mejor reserva ovárica, según lo determinan los recuentos de folículos
antrales definidos por ultrasonido ( AFCs), en comparación con las mujeres de mayor edad con una AFC
disminuida. La apoptosis reducida se asoció con niveles bajos de BMPR1B en el momento de la selección del
folículo dominante, mientras que la falta de regulación a la baja del BMPR1B, FSHR,3 , 4 ). Los autores
sugirieron que este resultado es un reflejo de una baja tasa de recambio mitogénico de las células de la
granulosa en folículos sanos en los pacientes mayores.
Cabe destacar que la administración de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) demostró aumentar
la apoptosis tanto del cúmulo como de las células de la granulosa mural. Sin embargo, en la práctica clínica,
la predictibilidad del aumento de LH por su supresión con GnRH ha sobrevivido a la importancia del hallazgo
( 74 ); sin embargo, solo la tinción de Hoechst se realizó para la determinación de apoptosis en ese
estudio. Este cambio pudo haber sido ayudado por el hallazgo de otro estudio de que el nivel de apoptosis en
células de la granulosa no se correlacionaba con la calidad de oocitos o la tasa de fertilización, que se determinó
usando una nueva técnica de identificación de apoptosis muy temprana víaAnnexin V y PI y citometría de
flujo ( 75) En otro estudio que utilizó tinción fluorescente PI y Bcl2 de células de la granulosa en pacientes
con la misma reserva ovárica y edad, la tasa de fecundación fue la misma, pero las pacientes (mujeres) que
lograron un embarazo exitoso tuvieron un índice apoptótico reducido ( 76 ). Sin embargo, la variación fue muy
amplia en el grupo no embarazada (13.61 ± 9.26). La internalización de la membrana de fosfolípidos (ensayo
de anexina V) ocurre después de la cascada proteolítica de la caspasa, pero antes de la condensación y
fragmentación del ADN ( 11 ). Desafortunadamente, la apoptosis inducida involuntariamente al centrifugar
células a> 300  g limitaría el valor de algunos estudios ( 67 , 74 ). En el estudio de Lee et al. ( 70), se encontró
que la apoptosis de células cumulus era mayor en el grupo de edad de más de 40 años, lo que corresponde a
una tasa de fertilización más pobre; sin embargo, solo 200 células del cúmulo se contaron por complejo
cúmulo-ovocito, y solo cuatro pacientes se encontraban en los grupos de mayor edad.
A medida que se desarrollaron nuevas técnicas y se aumentó su sensibilidad, también se analizó la actividad
de la caspasa granulosa ( 71 , 76 - 79 ). Yuan et al. ( 71 ) no encontraron diferencias en la tinción de TUNEL
y la actividad de caspasa hasta el aumento de LH, mientras que la actividad de caspasa para las caspasas
combinadas 1-9 estaba presente antes del pico de LH, pero luego desapareció después del pico de LH ( 71 ). En
un estudio reciente, la misma técnica de conteo de células picnóticas encontró que el nivel de apoptosis se
redujo en pacientes que quedaron embarazadas ( 80) El hallazgo fue respaldado por datos de qPCR de un
mayor nivel de caspasa 3 en el grupo no embarazada. Aunque los resultados parecen robustos, se tomaron
muestras de un número no revelado de folículos (entre 1 y 4 por paciente), y no fueron necesariamente el
folículo correspondiente que produjo el embarazo. Para confundir más el hallazgo, se transfirieron dos
embriones por paciente; por lo tanto, el resultado del destino para cada folículo, embarazada o no, no estaba
claro.
En este momento, los mecanismos de la apoptosis se estaban investigando para determinar si varios factores
eran proapoptóticos o antiapoptóticos ( 81 ). También se llevaron a cabo investigaciones completas de ovarios
y revelaron el nivel de fragmentación del ADN (ensayo TUNEL) y la actividad de la caspasa 3 en indetectables
en folículos adultos primarios, primarios y secundarios ( 59 , 78 , 82 ), mientras que altos niveles de apoptosis
dependiente de caspasas registrado en folículos antrales. Sin embargo, en los folículos preovulatorios, la
apoptosis nuevamente se encontró raramente ( 59) Este cambio en la apoptosis corresponde a los dos
momentos críticos de la regulación a la baja de la FSHR y la adquisición de LHR durante la selección del
folículo dominante; y más tarde durante la regulación negativa preovulatoria de LHR, FSHR y BMPR1B
( 3 , 5 ).
Las primeras investigaciones de Sadraie et al. ( 67 ), informaron que los pacientes jóvenes producían más
ovocitos que eran maduros en comparación con los grupos de mayor edad, lo que es consistente con la reciente
falta de regulación negativa de BMPR1B, FSHR y LHR, y la maduración final del folículo en mujeres mayores
( 3 - 5 ). Sin embargo, Jancar et al. ( 83 ), no encontraron ningún efecto de la apoptosis de células de la
granulosa sobre la tasa de fertilización o el desarrollo de blastocisto. Aunque se usaron perlas recubiertas con
CD45 para purificar las células de la granulosa, se agruparon a partir de múltiples folículos. Además, las
células se centrifugaron a 400  g, que se sabe que induce la apoptosis. Estos factores pueden limitar la
importancia de este estudio, así como un estudio similar que examina células de la granulosa de folículos
agrupados, donde las células también se centrifugaron a 400  g ( 84 ).
En pacientes mayores, los niveles foliculares de estrés oxidativo se incrementaron, lo que puede asociarse con
una reducción de la calidad de los ovocitos ( 29 ). Sin embargo, tanto el embrión como el ovocito producen
especies de oxígeno reactivo (ROS) como parte normal del metabolismo, y la producción de ROS puede
reflejar otros cambios en el ambiente ovárico que están asociados con el envejecimiento y no necesariamente
como resultado de niveles de apoptosis modificados ( 29 , 70 , 85 - 88 ).
Recientemente, en los ovarios humanos fetales enteros, se informó que las células de la granulosa de los
folículos primordiales eran positivas para la caspasa 3 y la fragmentación del ADN ( 89 ). Este estudio
semicuantitativo limitado también informó altos niveles de BAX en folículos primordiales y Bcl2 en folículos
secundarios. Sin embargo, el nivel de apoptosis dependiente de caspasas no fue proporcional a la pérdida
esperada de folículos primordiales antes del nacimiento o después del nacimiento ( 89 , 90 ). Los bajos niveles
inconsistentes de apoptosis indican que otras formas de muerte celular independiente de caspasas están en
operación.
Varias nuevas propuestas han surgido en relación con los mecanismos de muerte celular programada que no
tienen características típicamente asociadas con la apoptosis. Estos incluyen autofagia ( 91 ), autosacrificio
para proporcionar nutrientes para folículos vecinos ( 92 ) y apoptosis neuronal-endocrina inducida a través del
retículo endoplásmico ( 93 ). Claramente, todavía hay muchas preguntas sin respuesta asociadas con el
mecanismo de muerte celular en el folículo.
Conclusión
El control complejo de la foliculogénesis, la ovulación y la fase lútea del desarrollo del folículo depende del
equilibrio de los factores proapoptóticos y antiapoptóticos para regular la supervivencia celular. La apoptosis
en la célula granulosa es predominantemente a través de vías de señalización dependientes de caspasas, y la
mayoría de la apoptosis da como resultado la diferenciación terminal de la célula de la granulosa en la
superficie antral del folículo. El tipo de apoptosis y la vía de señalización dependen de la etapa de desarrollo
del folículo y el origen del desencadenante intrínseco o extrínseco. Un gran volumen de apoptosis de células
granulosas dentro de la membrana granulosa conduce a la muerte del folículo.
La expresión óptima del receptor durante la foliculogénesis asegura la síntesis máxima de estrógenos, que es
esencial para la supervivencia del folículo. La cesación de la proliferación inducida por estrógenos conduce a
la ovulación, lo que impone un nuevo paradigma regulador. La fase lútea dominada por progesterona también
está regulada por la expresión del receptor para promover la supervivencia celular y la función del cuerpo
lúteo.
Usando las técnicas disponibles en este momento, es evidente que los niveles de apoptosis de las células de la
granulosa son un reflejo de la etapa proliferativa del folículo en lugar de un predictor de la salud de los
ovocitos. La apoptosis no se utiliza como marcador en el entorno clínico debido a su escasa capacidad
predictiva con respecto a la calidad de los ovocitos y la tasa de embarazos resultante. Estudios recientes
desafían el punto de vista sostenido de que el aumento de la apoptosis de las células de la granulosa es típico
de pacientes mayores y está relacionado con la calidad de los ovocitos. Más bien, la apoptosis de las células
de la granulosa parece ser una parte integral del desarrollo normal del folículo y refleja el crecimiento
mitogénico del folículo que varía de una manera dependiente de la etapa.