PRACTICA III. CITOLOGÍA cblanco@ugr.

es
Realización de un cariograma mediante bandeo G.

¿Qué es un cariograma?

Un cariograma es una representación ordenada de los cromosomas de un individuo en función, de

su morfología y tamaño. Es característico de cada especie.

¿Qué es el bandeo cromosómico?

Técnica que se utiliza para visualizar los diferentes segmentos o bandas, de los cromosomas. Estas
bandas se ven cuando los cromosomas se tiñen con productos químicos y se observa bajo
microscopio. Dependiendo de la tinción empleada, se obtendrá un patrón de bandas claras y oscuras
diferente y específico para cada par cromosómico. Esta característica permite estudiar los
cromosomas de una persona en busca de alteraciones cromosómicas.

Los bandeos más comúnmente utilizados son:

 Bandeo G: se obtiene al tratar el cromosoma con tripsina y teñir posteriormente con glemsa
(también se emplea para frotis sanguíneos).
 Bandeo R (reverse): se utiliza para definir los extremos de los cromosomas. Las bandas
obtenidas son las contrarias al bandeo G, es decir, donde en el G había una banda oscura, en
el R es clara.
 Bandeo T: se emplea para la tinción de telómeros.

¿Qué células se necesitan para realizar un cariograma?

Deben ser células que tengan núcleo y capacidad de proliferación. Las células del tejido epitelial no
nos servirían porque están muy queratinizadas. Para realizar estas técnicas se pueden obtener a
partir de la sangre o de otros tejidos que contengan células con las características previamente
mencionadas (técnicas muy poco invasivas).

¿Servirán todas las células sanguíneas?

No, las plaquetas son fragmentos celulares y no tienen núcleo, es decir, no nos servirían. Los
eritrocitos tampoco tienen núcleo. Las únicas que cumplen los requisitos son los leucocitos.

Pasos del cariograma:

1. Obtención de cromosomas.
2. Extensión cromosomas.
3. Tinción.
4. Observación. Se emplea el MO directo (la lupa va abajo-arriba)

Dentro del primer paso:

1.1. Obtención de células. Mediante el análisis o la biopsia. Se emplea un frasco de cultivo, uno de
las paredes presenta un recubrimiento de manera que las células se adhieren a esta parte del
plástico. Para sobrevivir las células necesitan O2, realizar el intercambio gaseoso (CO2-O2), las
células deben estar estériles (que no entren en contacto con microorganismos). Estas condiciones se
consiguen gracias a un filtro que presenta el bote de plástico. El medio de cultivo (disolución que
aporta nutrientes a la célula) es el liquidito rosa. Está rosa porque tiene un indicador de pH (rojo
fenol), si estuviese amarillo (pH ácido) y morado (pH básico). Existen los cultivos en adhesión (lo que
acabamos de decir, las adheridas requieren que las despeguemos para poder trabajar con ellas –
paso 1.2 -) y en suspensión.

La sangre se centrifuga, para poder trabajar con las células adecuadas. Lo amarillo y más ligero es el
plasma, lo más oscuro y al fondo son los eritrocitos. En el medio están las plaquetas y los glóbulos
blancos. Biopsia: las células se extraen del tejido conjuntivo (fibroblastos).

Añadiendo la fitohematoglutinina conseguimos asegurar que la gran mayoría de las células

proliferen (hagan mitosis).

Señal de los glóbulos blancos para que empiece a dividirse: un antígeno.

Para detener a las células en metafase, se emplea la colchicina (75 % de las células quedan detenidas
en metafase).

1.2. Obtención de una suspensión de células independientes.

*Este paso no sería necesario para los glóbulos blancos (se encuentran en suspensión)*

1) Retirar el medio de cultivo y lavar con PBS. Si quisiésemos trabajar con esterilidad se deben
emplear las cabinas de flujo laminar (se protege a lo que hay dentro de ti). Lo recomendable sería
que el proceso se realizase en dicha cabina. Lavamos con PBS (porque con agua -hipotónica-, por
ósmosis, las células -hipertónicas- explotaría. Se repite el lavado dos veces, así nos aseguramos de
que estamos eliminando todo el medio de cultivo (se eliminan todas las proteínas).

2) Añadir un agente disociador químico capaz de levantar las células del fondo del frasco. El agente
disociador es una enzima que rompe las uniones entre las proteínas y las células adheridas. Si se
hiciese en el medio de cultivo con proteínas, la enzima se saturaría y no podría ser tan eficiente a la
hora de despegar las células. Debe cubrir toda la superficie.
3) Incubar a 37 º C durante 5-10 minutos (el tiempo depende del número de células). Se trata de una
enzima que actúa en el cuerpo humano y los procesos fisiológicos se realizan a 37 º C. A más
temperatura, se desnaturalizaría. A menor temperatura, la actividad de la enzima se ve
comprometida y es menos efectiva. En el incubador se intenta imitar una condición fisiológica
(presencia de humedad, CO2...)

4) Observar al microscopio para observar el proceso. Se usa un microscopio invertido, porque

interesa ver el fondo del frasco. No hay que teñir las células porque se hace por contraste de fase.
No altera la esterilidad de las células gracias a este método de observación en concreto. Los
fibroblastos son células fusiformes (alargadas) deben su morfología a las prolongaciones, con el
agente disociador, rompemos estas uniones (proteínas que unen las células al frasco de cultivo),
entonces la célula alargada pasa a ser una bolita.

5) Inactivar el agente disociador añadiendo medio de cultivo, para asegurar que estamos deteniendo
la enzima, se saturan los centros activos de las enzimas con proteínas. Se añade el doble del medio
de cultivo del volumen que se ha añadido de tripsina. Si la enzima siguiese viva, la viabilidad celular
se vería afectada.

6) Si no se han levantado, emplear un proceso mecánico para la disociación (Scraper). Solo se utiliza
si ha fallado el proceso químico, que es menos invasivo.

7) Recoger la suspensión celular (las células ya no están pegadas) y llevarla a un tubo de centrífuga.
Previo a la centrifugación, hay que calibrar la máquina, poniendo volúmenes iguales uno en frente
de otro. Siempre se trabaja con un número de muestras par (la pareja va a ser un tubo con el mismo
volumen, pero con agua).

8) El pellet estará justo en el fondo (la célula es lo más pesado y se va hacia abajo), y por encima lo
que no nos interesa (el sobrenadante). El sobrenadante lo descartaremos con pipetas normales (no
con una Pasteur porque los volúmenes son mayores), recogiendo el medio Y SIN TOCAR EL PELLET
PORQUE LOS DESPEGARÍAMOS. Es preferible que quede un poco de líquido a arriesgarse a perder el
pellet.

9) Después de la centrifugación, las células del pellet están súper juntas y las necesitamos
disgregadas (separadas). Eso lo conseguimos dando una serie de golpecitos (disgregación mecánica).
La disgregación permite que, en el choque osmótico, la disolución llegue a todas las células.

1.3. Choque osmótico. Usaremos una solución hipotónica de cloruro potásico, que ocasionará que la
célula se hinche, pero NO QUE ESTALLE. Al hinchar la célula, conseguimos que se separen los
cromosomas (facilitar la observación). ¿Por qué en este paso incubamos a 37 º C? Porque las células
siguen estando vivas y necesitamos mantener esta condición de temperatura.

1.4. Fijación de las células. Por fijar entendemos mantener las estructuras y parar el metabolismo.
Fijador: carnoy -> metanol + ácido acético. El calor y el frío se pueden emplear como fijadores físicos.
Tras añadir, centrifugamos porque tenemos ya la mezcla del carnoy y la disolución de cloruro
potásico y queremos que estas disoluciones queden en el sobrenadante. Después realizamos una
disgregación mecánica porque queremos células en el pellet SEPARADAS. Se resuspende el pellet en
carnoy porque para la extensión cromosómica se necesita un medio que se evapore rápido y que las
células estén en un líquido.

2. Extensión de los cromosomas.

Queremos sacar los cromosomas de la célula, y para ello hay que romperla. Lo conseguimos
tirándolas desde cierta altura. No hace falta que se rompan todas las células, quedará un porcentaje
que no. Dejamos caer gotas de la muestra sobre el portaobjetos y esperamos a que el portaobjetos
esté totalmente seco, para acelerar el proceso podemos meter el porta en el incubador.

3. Tinción.

La tinción será sobre las proteínas que acompañan al material genético (las histonas).

¿Qué es la tripsina? Una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas
mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aa.

La enzima digiere todas las proteínas, pero especialmente las no modificadas epigenéticamente
porque son menos densas. Las proteínas de la heterocromatina tienen mucha carga y están muy
empaquetadas, por lo que la tripsina no penetra suficiente y no las digiere tan rápido como las que
están accesible en la eucromatina.

La heterocromatina se verá como banda oscura y la eucromatina como banda clara.

¿Por qué debe estar la tripsina a 37 º C? Es la temperatura óptima de la enzima. Son importantes
tanto el tiempo como la temperatura. Si la introducimos poco tiempo se verá todo negro y si la
introducimos mucho tiempo desaparecerán las bandas oscuras.

Tenemos que introducir la muestra en FBS, una solución concentrada de proteínas, que va a
bloquear los sitios activos de la tripsina (enzima) deteniendo su actividad (saturamos la enzima) y,
por lo tanto, la digestión de las proteínas que acompañan al material genético.

¿Qué tiñe el giemsa? Va a teñir a las proteínas que acompañan al material genético,
especialmente las histonas. El colorante tiene una unión más fuerte en las regiones de ADN ricas en
A-T, proteínas modificadas genéticamente; heterocromatina. La idea es que las bandas G positivas
(más oscuras) aparecen puesto que son más resistentes a la tripsina por tener más A-T y, al
contrario, las bandas G negativas (claras) contienen proteínas que se ven más afectadas por la
digestión desnaturalizante de la tripsina por tener menos A-T. Si no se usa la tripsina, el bandeo sería
poco preciso porque no se distinguirían bien las bandas claras y oscuras. (Serían todas más oscuras).

4.Observación:

Ponemos la muestra en la platina, encender, mirar por los oculares y ponértelos a tu distancia,
empezamos por el menor aumento. Primero enfocamos con el macrométrico, y luego con el
micrométrico. Las células rotas son las que dejan su contenido en el portaobjetos.
Hay muchos cromosomas porque es una línea celular cancerígena.

EJERCICIO QUE PUEDE CAER EN EL EXAMEN.

Página importante: http://www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping2.html

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