UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Junio 2021 – Octubre 2021

Asignatura: Laboratorio Integrador de Ciencias Básicas V

Docente: Francisco José Álvarez Nava
Semestre: Quinto Fecha de elaboración: 22 de julio de 2021

Fecha de la práctica: Enero 2022 Número de práctica: 4

Tema Cariotipo Humano
El estudio de la citogenética se ha convertido en una herramienta fundamental en el campo
de la genética ya que contribuye en la búsqueda de evidencias científicas que sirven de
plataforma la compresión de rasgos o características que están determinadas por factores
cromosómicos. En este sentido, el estudio de la Citogenética es un pilar clave indispensable
de la genética como ciencia porque ayuda a comprender la patogenia de muchas
enfermedades con base genética no solo en el humano sino también en otros mamíferos. La
siguiente práctica tiene como fin lograr visualizar el material genético que bajo otras
condiciones es difícilmente visible. Además, el biólogo debe conocer el manejo de técnicas
citogenéticas.

Con la finalidad de obtener la máxima información del estudio citogenético obtenido de una
preparación de cromosomas, las imágenes de los cromosomas individuales se organizan en
un formato convencionalmente estandarizado conocido como cariotipo, o más precisamente,
cariograma. Por lo tanto, podemos definir cariograma, o más comúnmente cariotipo, a la
organización de cromosomas para su análisis o estudio. El cariotipo describe la totalidad de
todas las propiedades cromosómicas reconocibles citológicamente de un individuo. Estas
propiedades incluyen el número de cromosomas en una célula, así como su tamaño relativo y
absoluto, la posición del centrómero, las constricciones secundarias, los patrones de bandas
específicos y la distribución de la cromatina en el cromosoma. En otras palabras, el cariotipo
es el conjunto de cromosomas de una célula ordenados por tamaño, disposición del
centrómero y patrón de bandas. Por extensión, se afirma que el cariotipo es la constitución
cromosómica de un individuo.
INTRODUCCIÓN
Para fines prácticos el análisis cromosómico o citogenético (cariotipo o cariograma) se debe
realizar en cultivo de células que sean capaces de crecer y dividirse rápidamente. Las células
más accesibles que cumplen con este requisito son los glóbulos blancos, específicamente los
linfocitos T. Otra fuente de células en proliferación son los fibroblastos de piel, células
epiteliales encontradas en el líquido amniótico, y células derivadas de la médula ósea, entre
otras

Para preparar un cultivo que sea adecuado para el análisis citogenético, se necesita la toma
de una muestra de sangre periférica por venipunción y se mezcla con heparina para evitar la
coagulación. Se colocan alrededor de 5 a 8 gotas de sangre (este número puede variar
dependiendo de la cuenta blanca de la persona) en un medio de cultivo enriquecido, que
suministra los factores de crecimiento que inducen proliferación celular. Luego, se estimulan
las células para que estas se dividan. La estimulación de la división celular se logra con la
adición de un factor mitogénico como la fitohemaglutinina. Posteriormente, este cultivo se
incuba a 37ºC durante 72 horas aproximadamente y, después de unos días, las células en
división se detienen en metafase con sustancias químicas que inhiben el huso mitótico por lo
que se agrega una solución de colchicina al medio para detener la división celular (metafase)
y evitar que las células completen la mitosis. La colchicina actúa inhibiendo la formación del
huso mitótico y las células que alcanzan la metafase se acumulan en el cultivo. Luego se
recolectan y se agrega una solución hipotónica (KCl a 0,075M) que hace que penetre liquido al
interior de la célula, con el consecuente aumento de su volumen (se edematizan) y los
cromosomas flotan en su interior. Posteriormente, se adiciona la mezcla fijadora de Carnoy
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(metanol en ácido acético en proporción 3:1) y luego de un tiempo predeterminado se las
hace estallar con una técnica de goteo sobre una lámina portaobjeto para liberar los
cromosomas y que estos se esparzan sobre el portaobjetos. A continuación, el material se fija
y se tiñen mediante una de varias técnicas de bandeo, según el procedimiento particular que
se realice.

Figura 5. Fases del cultivo Cromosómico y reactivos utilizados en éste.

Como se señaló anteriormente, los cromosomas se pueden identificar fácilmente a nivel

citogenético a través de varios procedimientos de tinción específicos. Estas tinciones se unen
a ciertos tipos de secuencias de DNA. Los colorantes utilizados distinguen principalmente
entre el DNA que es rico en pares de nucleótidos A-T y el DNA que es rico en C-G. De esta
manera, las diferentes secuencias cromosómicas absorben la tinción mejor que otras regiones
cromosómicas y producen un patrón de bandas llamativo y confiable a lo largo de cada
cromosoma. El patrón de bandas en cada tipo de cromosoma es único y específico para cada
cromosoma, lo que permite identificar y numerar individualmente cada cromosoma. Así, el
bandeo o bandas cromosómicas se refiere a determinadas técnicas de tinción que generan
alternancia de regiones claras y oscuras a lo largo de un cromosoma, producidas por el patrón
de tinción de cada colorante empleado. Una banda cromosómica se define como la región de
un cromosoma que se distingue claramente de sus secuencias adyacentes al aparecer más
oscura o clara con el uso de una o más técnicas de bandeo. Más estrictamente hablando, una
banda cromosómica es una variación longitudinal en las propiedades de tinción a lo largo de
un cromosoma independiente de cualquier variación estructural. Por consiguiente, una banda
cromosómica es una manifestación de un dominio de cromatina con características
funcionales y estructurales que son homogéneas, consistentes y específicas de una región
cromosómica lo suficientemente larga como para ser vista al microscopio. Así, los
cromosomas se visualizan como si estuvieran formados por una serie continua de bandas
claras y oscuras.

Para obtener un cariotipo se utilizan una o varias técnicas de tinción o bandeo cromosómico,
las cuales tienen sus ventajas y limitaciones. Los métodos de bandas cromosómicas se basan
en teñir los cromosomas con un colorante o en analizar una función particular. De allí, que las
técnicas de bandeo cromosómico de uso común se clasifican en dos grandes grupos: 1) las
que dan como resultado bandas distribuidas a lo largo de todo el cromosoma; y 2) las que
tiñen un número restringido de bandas o estructuras específicas.

Dentro del primer grupo, las técnicas más comunes de bandas cromosómicas basadas en
colorantes son bandas G (Giemsa), R (Reversa) y Q (quinacrina). Las bandas que muestran una
tinción intensa se denominan bandas positivas; las bandas de tinción débil son bandas
negativas. Sin embargo, los patrones de bandas no son en blanco y negro, sino que se
adquieren bandas que se tiñen a diferentes intensidades. Las bandas G deben su nombre del
colorante Giemsa, pero se pueden producir con otros colorantes. Esta es la técnica de tinción
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de Giemsa más utilizada en América del Norte. En las bandas G, las regiones oscuras tienden a
ser heterocromáticas, de replicación tardía, ricas en AT y relativamente pobres en genes. Por
el contrario, las regiones claras incorporan menos tinción de Giemsa porque se encuentran
descondensadas por lo que tienden a ser eucromáticas. Además, las bandas claras son de
replicación temprana y ricas en CG, por lo que son más activa transcripcionalmente. Las
bandas R son aproximadamente el reverso de las bandas G (la R significa "reverso"). Aquí, las
regiones oscuras son eucromáticas y las regiones claras son heterocromáticas. En las bandas
G, los cromosomas en metafase primero se tratan con la enzima proteolítica tripsina
(tripsinización) antes de aplicar el colorante Giemsa a los cromosomas, de allí que se le
conoce como técnica GTG (bandas G por tripsina y Giemsa). Esto se realiza con la finalidad de
relajar la estructura de la cromatina y permitir que el colorante de Giemsa tenga acceso al
DNA. En las bandas R, los cromosomas se calientan a 88 °C en un tampón, antes de aplicar la
tinción de Giemsa (técnica RHG). El tratamiento previo con calor derrite preferentemente la
hélice de DNA en las regiones ricas en AT que generalmente se unen a la tinción de Giemsa
con más fuerza, dejando solo las regiones comparativamente ricas en CG para absorber la
tinción, por lo que el patrón de bandas es el contrario al del bandeo G. Esta técnica de tinción
se utiliza para proporcionar detalles sobre las regiones ricas en genes que se encuentran
cerca de los telómeros, por lo que muchos laboratorios en Europa la prefieren.

General: Realizar un cariotipo

Específicos:
• Ordenar los cromosomas en función del tamaño, disposición de centrómeros y patrón de
OBJETIVOS bandas.
• Identificar las bases celulares, bioquímicas y moleculares que intervienen en los diferentes
momentos que se realizan el cariotipo.
• Identificar anomalías cromosómicas en un extendido cromosómico.
RESULTADOS DE
Reconoce las técnicas citogenéticas convencionales de cultivo celular y tinción cromosómicos
APRENDIZAJE
Materiales Y Equipos:
2 frascos de cultivo
1 pipeta serológica de 10 ml
MATERIAL O
2 tapones para frascos de cultivos
RECURSOS
1 pinza Adson sin dientes de 14 cm
2 pipetas Pasteur
2 tubos de centrífuga de vidrio en punta V
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2 bulbos de hule ámbar para pipeta Pasteur
Mechero Bunsen
Microscopios
Guantes de látex (un par por integrante)
Gaza estéril
Marcador permanente
Cinta adhesiva
Centrífuga clínica
Incubadora a 37oC
Agitador tipo Vórtex
Bomba de vacío con trampa
Refrigerador
Campana de flujo laminar
Caja de portaobjetos caja de cubreobjetos 24 x 50 mm
Perilla de goma para pipeta serológica
Jeringa desechable

Reactivos, soluciones y material biológico

Fitohemaglutinina (PHA)
Cloruro de benzalconio
Cloruro de potasio 0,075 M
Colorante de Giemsa en solución
Medio de cultivo (RPMI, Ham F 10 o McCoy 5ª modificado)
Heparina 10000 unidades internacional
Colchicina 0,04%
Sangre fresca heparinizada
Alcohol
Solución fijadora de Carnoy (Metanol: ácido acético 3:1)

Materiales provistos por el estudiante

N/A

Debido al estado de confinamiento y al cierre temporal de los laboratorios de la Facultad de

Ciencias Biológicas de la Universidad Central, esta practica de laboratorio se limitará al
ejercicio interactivo a través de plataformas de simulación on line.

Este ejercicio de simulación que los estudiantes realizarán será a través de imágenes
digitalizadas obtenidas de la siguiente dirección de internet:
http://www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping2.html.

Los estudiantes tendrán que comparar y ordenar los cromosomas de acuerdo con su tamaño,
disposición del centrómero y patrones de bandas de tinción cromosómica. Posteriormente, los
estudiantes asociados en diferentes grupos realizarán un cariotipo completo e interpretarán
los resultados como si se estuviera trabajando en un servicio de citogenética humana.

1. Instrucciones-Procedimiento–Actividades
Obtención de la muestra
1. Obtener de 1,5 a 2 ml de sangre venosa por medio de una jeringa heparinizada (éste es el único
anticoagulante que se puede usar).
2. Limpiar perfectamente la zona de venopunción con agua y jabón y desinfectar con, por lo menos, tres
torundas humedecidas con alcohol.
3. Ligar el antebrazo y realizar la punción. Una vez obtenida la sangre mezclar muy bien rotando la jeringa.
No olvidar que toda la operación se debe de realizar dentro de la zona estéril donde se está trabajando.

Siembra de linfocitos
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1. Adicionar a cada frasco de cultivo limpio y estéril:
Medio de cultivo 8 ml.
Fitohemaglutinina 0,4 ml.
Sangre entera 0,5 ml.
2. Mezclar bien el contenido de los frascos e incubar en la estufa a 37º C durante 72 horas.
3. Cumplidas las 72 horas agregar con una pipeta Pasteur a cada frasco de cultivo 25 µl de colchicina al 0.04%.
4. Mezclar bien y continuar la incubación por 2 horas más.

Cosecha de linfocitos
1. Una vez completado el periodo de incubación, sacar los frascos de la estufa y transferir su contenido a
tubos de centrífuga punta cónica centrifugándolos a 3000 rpm., durante 10 minutos.
2. Retirar el sobrenadante y adicionar 8 ml de KCl 0.075 M a 37 ºC. Resuspender muy bien con ayuda de un
vórtex el paquete celular e incubar durante 30 minutos a 37 ºC.
3. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 3000 rpm. y desechar el sobrenadante. Resuspender el paquete
celular.
4. Con agitación constante agregar lentamente 8 ml de la solución fijadora de metanol:ácido acético
proporción 3:1 recientemente preparada y fría.
5. Dejar actuar la solución fijadora durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Repetir el proceso de fijación 2 veces más a tiempos de 15 minutos cada uno.
7. Después de la tercera fjación centrifugar 5 minutos y dejar un poco de solución fijadora para hacer una
suspensión celular adecuada.
8. Resuspender el paquete celular y dejar caer 3 gotas de esta suspensión sobre un portaobjetos limpio y frío
desde una altura aproximada de 20 cm. Dejar secar.

Tinción de cromosomas
1. En un vaso de Coplin preparar el colorante Giemsa con agua destilada en proporción 1:10.
2. Sumergir los portaobjetos en el vaso de 10 a 30 minutos dependiendo de la capacidad de tinción del
colorante.
3. Enjuagar con agua corriente y secar al aire

Observación al microscopio
1.Observar al microscopio óptico con los objetivos 10x, 25x y 40x. Localizar las mejores metafases y anotar
las coordenadas.
2.Montar los portaobjetos con resina sintética que deberá dejarse secar por lo menos 2 días.
3.Estudiar las metafases seleccionadas con el objetivo de inmersión (100x)

2. Resultados esperados-obtenidos

Cariotipo a través de la clasificación de los cromosomas en pares homólogos, tamaño, disposición del
centrómero y patrón de bandas.

3. Discusiones y Conclusiones

Los estudiantes clasificarán los diferentes pares de cromosomas homólogos en función de su tamaño,
disposición de centrómero y patrón de bandas obtenidos por cultivo cromosómico y tinción con GTG e
identificarán posibles anomalías cromosómicas numéricas o estructurales y las consecuencias fenotípicas que
éstas pueden ocasionar. Ellos reflexionarán sobre los diferentes reactivos que se utilizan en el cultivo y tinción
cromosómicos y sus mecanismos de acción para obtener cromosomas metafásicos adecuadamente teñidos.
Igualmente, los estudiantes reconocerán las fallas que puedan cometer al estandarizar las técnicas de cultivo
y tinción cromosómicos y expresarán escribirles y sugerir posibles soluciones a los problemas que puedan
presentarse.

4. Recomendaciones
N/A

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5. Referencias

- Karp G & Araiza Martínez ME. 2011. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos (6a ed.).
México D.F.: McGraw- Hill.
- Lodish H. et al. 2006. Biología Celular y Molecular, Quinta Edición, Editorial Médica Panamericana.
- Silva E et al. 1991. Citogenética humana – Protocolo hospitalario; Manual de procedimientos.

6. Evaluación

COMPONENTE TEÓRICO
Presentación de un evaluativo individual sobre los fundamentos teóricos de la práctica previamente discutidos con
el docente.

COMPONENTE PRÁCTICO
Elaboración grupal de un cariotipo a partir de un extendido cromosómico previamente teñido en una presentación de
Powerpoint. Los estudiantes asociados previamente en grupos, organizarán los cromosomas según su tamaño,
disposición de centrómeros y patrón de bandas para construir el cariotipo, y la presentación de Powerpoint deberán
transformarla a un documento en pdf identificando los integrantes del grupo, y posteriormente cargarlo a la
plataforma Teams.

RECOMENDACIONES
Emita sugerencias para mejorar la práctica.

Elaborado por: Francisco José Álvarez Nava Revisado por: Santiago Buitrón

Francisco José Álvarez Nava Aída Álvarez

FIRMADO DIGITALMENTE FIRMADO DIGITALMENTE
Fecha: 19-11-2021

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