UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD AZCAPOTZALCO

TÉCNICAS DE MEDICIÓN Y COMPOSICIÓN

PRÁCTICA 6. Cromatografía de columna

Profesora: Hernández Fydrych Vianka Celina

Profesor ayudante: González Orozco Zaid

Equipo 4.

Guerrero Villeda Diana Citlali 2203029950

Jiménez Suaste José Salvador 2193043204
Martínez Gutiérrez Daniela Sunmy 2212001317
Pérez Castillo Gabriela 2212003366

Fecha: 30/01/2024
MARCO TEÓRICO
Cromatografía
La cromatografía es una técnica analítica utilizada para separar y analizar mezclas
de compuestos químicos. Se basa en las diferencias en la velocidad a la que los
componentes de una mezcla se mueven a través de una fase estacionaria y una
fase móvil. Esta técnica es fundamental en química analítica, bioquímica,
farmacología y otras áreas de la ciencia. Bosch Reig, F. (2006).
Fase Móvil:
La fase móvil es el solvente o el gas que se mueve a través del sistema
cromatográfico, arrastrando consigo los componentes de la muestra a medida que
fluye. Sus propiedades, como la polaridad, la viscosidad y la capacidad de
disolución, influyen en la eficacia y selectividad de la separación. Bosch Reig, F.
(2006).
 Solventes en Cromatografía líquida: En cromatografía líquida, los solventes
comunes incluyen mezclas de agua, acetonitrilo, metanol o tetrahidrofurano,
dependiendo de la aplicación y la naturaleza de los analitos.
 Gases en Cromatografía de Gases: En cromatografía de gases, se utilizan
gases como el helio, el nitrógeno o el argón como fase móvil, que interactúan
con la fase estacionaria en la columna cromatográfica.
Fase Estacionaria:
La fase estacionaria es el medio inmóvil a través del cual los componentes de la
muestra se separan según sus interacciones con esta fase. La elección de la fase
estacionaria depende de las propiedades de los analitos y las condiciones de
separación requeridas. Bosch Reig, F. (2006).
 Tipos de Fases Estacionarias: Pueden ser sólidas o líquidas, dependiendo
del tipo de cromatografía. Ejemplos comunes incluyen sílices modificadas,
fases C18 en cromatografía líquida, y fases poliméricas o capilares en
cromatografía de gases.
 Interacciones Químicas: La selectividad de la separación está determinada
por las interacciones químicas entre los analitos y la fase estacionaria, que
pueden incluir enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo,
interacciones iónicas, entre otras.
Tipos de Cromatografía.
La cromatografía es una técnica analítica poderosa que se utiliza en una amplia
gama de campos para separar, identificar y cuantificar componentes de una mezcla.
Existen varios tipos de cromatografía, según el tipo de fase estacionaria, fase móvil,
mecanismo de separación e instrumentación utilizada. Bosch Reig, F. (2006).
Cromatografía de Columna.
En la cromatografía de columna, la muestra se separa en una columna que contiene
una fase estacionaria, a través de la cual se mueve una fase móvil. La separación
se basa en las interacciones entre los componentes de la muestra y la fase
estacionaria. Valcárcel, M., & Cárdenas, S. (2010).
 Fase Estacionaria: La fase estacionaria puede ser sólida o líquida y se elige
según las propiedades de los analitos y las condiciones de separación
requeridas. Ejemplos comunes incluyen sílice, alúmina, resinas de
intercambio iónico y fases C18 en cromatografía líquida.
 Fase Móvil: La fase móvil puede ser líquida o gaseosa y se elige para
arrastrar los analitos a través de la fase estacionaria. La elección de la fase
móvil depende del tipo de cromatografía, como la cromatografía de columna
líquida (HPLC) o la cromatografía de gases (GC).
 Interacciones Moleculares: La separación se basa en las interacciones
específicas entre los analitos y la fase estacionaria. Estas interacciones
incluyen enlaces químicos, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan,
J. W. (2010).
La cromatografía de columna se utiliza en una amplia variedad de campos y
aplicaciones, incluyendo:
 Purificación de compuestos químicos en el laboratorio.
 Análisis de muestras en la industria farmacéutica y alimentaria.
 Separación de proteínas y ácidos nucleicos en biología molecular. Bosch
Reig, F. (2006).

Imagen 1: Representación ilustrativa de una cromatografía por columna.

Cromatografía de Capa Fina (TLC).
En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una capa delgada de
adsorbente (generalmente sílice gel) en una placa de vidrio o aluminio. La
muestra se aplica en la parte inferior de la placa y luego se desarrolla con una
fase móvil líquida. Los analitos se separan en la placa según su afinidad por la
fase estacionaria. Es una técnica rápida y económica que se utiliza en una
variedad de aplicaciones, desde la identificación de compuestos hasta el control
de calidad en la industria farmacéutica y alimentaria. Linskens, H. F., & Jackson,
J. F. (2007).
 Fase Estacionaria: La fase estacionaria en TLC consiste en una capa
delgada de material adsorbente, como sílice gel o alúmina, que se deposita
sobre una placa de vidrio o aluminio.
 Fase Móvil: La fase móvil es un solvente o una mezcla de solventes que
asciende por capilaridad a través de la fase estacionaria, arrastrando consigo
los componentes de la muestra.
 Interacción Analito-Fase Estacionaria: Los analitos se separan en la TLC en
función de su interacción con la fase estacionaria. Los componentes que
tienen una mayor afinidad por la fase estacionaria se mueven más
lentamente, mientras que aquellos con menor afinidad se mueven más
rápidamente. Linskens, H. F., & Jackson, J. F. (2007).
La TLC se utiliza en una variedad de aplicaciones, como:
 Identificación de componentes en mezclas desconocidas.
 Control de calidad en la industria farmacéutica, alimentaria y cosmética.
 Monitoreo de reacciones químicas y síntesis orgánica. Ettre, L. S. (2001).

Imagen 2: Representación ilustrativa de una cromatografía por capa fina (TLC).

Cromatografía de Reparto
La cromatografía de reparto es una técnica de separación en la que los
componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases inmiscibles: una
fase estacionaria y una fase móvil. Este método se basa en las diferencias en la
solubilidad de los analitos en cada fase y se utiliza ampliamente en química
analítica y bioquímica.
 Distribución Diferencial: Los componentes de la muestra se distribuyen entre
la fase estacionaria y la fase móvil en función de sus afinidades relativas por
cada fase.
 Ley de Distribución de Fases: La concentración de un analito en cada fase
está determinada por la ley de distribución de fases, que establece que la
relación entre las concentraciones de un analito en ambas fases es constante
a una temperatura dada.
La cromatografía de reparto se utiliza en una variedad de aplicaciones, como:
 Separación y purificación de compuestos orgánicos.
 Análisis de mezclas complejas de compuestos.
 Purificación de productos naturales y sintéticos en la industria farmacéutica.

Imagen 3: Representación ilustrativa de una cromatografía de reparto.

Cromatografía de Adsorción.
La cromatografía de adsorción es un método de separación en el que los
componentes de una muestra se separan en función de sus diferentes
interacciones con una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o
gaseosa. En este proceso, los analitos se adsorben y desorben de la fase
estacionaria, lo que permite su separación y posterior análisis. Guiochon, G., &
Guillemin, C. L. (2006).
 Adsorción Selectiva: Los componentes de la muestra se adsorben en la fase
estacionaria en función de su afinidad por esta fase. Los analitos con mayor
afinidad se retienen más tiempo en la columna, lo que resulta en su
separación de los demás componentes.
 Interacciones Superficiales: La adsorción de los analitos en la fase
estacionaria se basa en una variedad de interacciones superficiales, como
enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo, enlaces de van der Waals
y fuerzas electrostáticas. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010).
La cromatografía de adsorción se utiliza en diversas áreas, incluyendo:
 Purificación de compuestos químicos.
 Análisis de muestras complejas, como extractos naturales y productos
farmacéuticos.
 Determinación de la pureza de productos químicos. Snyder, L. R., Kirkland,
J. J., & Dolan, J. W. (2010).

Imagen 4: Representación ilustrativa de una cromatografía por adsorción.

Cromatografía de Intercambio Iónico.
La cromatografía de intercambio iónico es una técnica de separación basada en
la interacción de iones presentes en la muestra con una fase estacionaria que
contiene grupos funcionales cargados. Esta técnica es ampliamente utilizada en
la separación y purificación de iones y moléculas cargadas en diversos campos,
como la bioquímica, la química analítica y la industria farmacéutica. Vargas, C.,
Pérez, A., & Gómez, L. (2008).
 Intercambio de Iones: En este método, los iones presentes en la muestra
intercambian lugares con iones de carga opuesta en la fase estacionaria. Los
analitos son retenidos o eluidos en función de su afinidad por los grupos
funcionales de la fase estacionaria.
 Selectividad: La selectividad de la separación se controla mediante la
elección de la fase estacionaria, que puede tener grupos funcionales con
diferentes cargas y tamaños, así como mediante la modificación de las
condiciones de la fase móvil, como el pH y la fuerza iónica. Vargas, C., Pérez,
A., & Gómez, L. (2008).
La cromatografía de intercambio iónico se utiliza en una amplia variedad de
aplicaciones, incluyendo:
 Purificación de proteínas y ácidos nucleicos en biología molecular.
 Análisis de muestras biológicas, como extractos de células y fluidos
corporales.
 Determinación de iones inorgánicos en muestras ambientales y alimentos.
Pino, V., & Afonso, A. M. (2009).

Imagen 5: Representación ilustrativa de una cromatografía por intercambio iónico.

Tipos de Adsorbentes en Cromatografía
Los adsorbentes son materiales utilizados en cromatografía para la separación de
componentes de una muestra. Existen diferentes tipos de adsorbentes, cada uno
con sus propiedades únicas que influyen en la eficacia y selectividad de la
separación. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010).
 Silicagel
La silicagel es un adsorbente ampliamente utilizado en cromatografía de capa
fina y columnas de cromatografía líquida. Se compone de partículas de sílice
porosa que proporcionan una gran área superficial para la interacción con los
analitos.
 Gel de Sílice Modificado
El gel de sílice modificado es una variante de la silicagel que se modifica
químicamente para alterar sus propiedades de adsorción. Esto puede incluir
modificaciones en la polaridad, la selectividad y la capacidad de interacción con
diferentes tipos de analitos. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010).

 Fases Estacionarias Poliméricas.

Estas fases estacionarias están basadas en polímeros y se utilizan en
cromatografía de gases y líquidos. Pueden ofrecer selectividad adicional para
ciertos tipos de analitos y son útiles en aplicaciones donde la sílice no es
adecuada. Fernández Alba, A. R., & Hernando, M. D. (2004).

Factores para Elegir un Adsorbente en Cromatografía.

 Naturaleza de los Analitos.

La polaridad, el tamaño y la carga de los analitos influirán en la elección del
adsorbente adecuado. Por ejemplo, compuestos polares se pueden separar
mejor utilizando adsorbentes polares como la sílica, mientras que compuestos
apolares pueden necesitar adsorbentes modificados. Snyder, L. R., Kirkland, J.
J., & Dolan, J. W. (2010).
 Tipo de Cromatografía.
El tipo de cromatografía utilizada ya sea de capa fina, de columna líquida o de
gases, determinará qué tipo de adsorbente es más adecuado para el método de
separación específico. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010).
 Condiciones de Separación.
Las condiciones como el pH, la fuerza iónica y la temperatura pueden afectar la
interacción entre los analitos y el adsorbente, por lo que es importante
 seleccionar un adsorbente que sea compatible con las condiciones de
separación. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010).

OBJETIVO.
 Diferenciar la migración de componentes de una mezcla homogénea a través
de una fase estacionaria por influencia de una fase móvil.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
 Investigar qué es la cromatografía, para que sirve y su importancia.
 Identificar y diferenciar la fase móvil y la fase estacionaria.
 Separar los componentes de la clorofila presentes en las hojas de espinaca
a través de cromatografía en columna.
 Identificar las diferentes fases gracias a su cambio de coloración (5 colores)
 Reconocer los diferentes pigmentos en la tinta de la espinaca.
 Analizar la influencia del solvente en la cromatografía.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales:
Mortero con pistilo Espátula
1 bureta Pipeta 10 ml
Soporte universal con pinzas Propipeta
5 tubos de ensayo Gradilla
2 vasos de precipitados (100 ml) Embudo
Vidrio de reloj Matraz de 100ml

Reactivos y soluciones:
Reactivo Pictograma Indicaciones de peligro
Etanol H225 Líquido y vapores muy
inflamables.
H319 Provoca irritación ocular grave.

Inflamable

Irritante
Éter de petróleo H225 Líquido y vapores muy
inflamables.
H304 Puede ser mortal en caso de
Inflamable ingestión y penetración en las vías
respiratorias.
H315 Provoca irritación cutánea.
H336 Puede provocar somnolencia o
vértigo.
H411 Tóxico para los organismos
Irritante
acuáticos, con efectos nocivos
duraderos.

Daño al medio ambiente

Peligro para la salud

Sulfato de sodio - -
anhidro
Diagrama de flujo

Practica 6. Cromatografía de
columna

A) homogeneización

Cortar y pesar 3g de espinaca

En un mortero macerar la espinaca Tratamiento de residuos

con 10 ml de etanol

En un embudo colocar el papel filtro y verter la

espinaca
Etanol: incineración para pequeñas
cantidades
B) montar columna
Sulfato de sodio anhidro: Neutralizar el
producto sobrante con una base diluida

Colocar algodón dentro de la bureta y Éter de petróleo: No tirar residuos por

agregar éter el drenaje, juntar los residuos en un
embace etiquetado
En el mortero triturar 100 g de sacarosa

Agregar 20 cm a la bureta

Agregar 1cm de sulfato de sodio

Verter éter de petróleo para saturar la columna

Adicionar 1ml del concentrado de espinaca

Seguir agregando éter poco a poco

Recolectar cada color percibido en tubos de ensayo

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
Se obtuvieron los diferentes pigmentos de la espinaca en 5 tubos de ensaye,
como se muestra en la figura 1.1.

1 2 3 3 4

Figura 1.1. Pigmentos extraídos por cromatografía en columna de la hoja de espinaca

Figura 1.2. Color característico de pigmentos presentes en la hoja de espinaca

En el tubo de ensaye numero 1 de la figura 1.1., se puede apreciar que su contenido

es de un color verde obscuro, el cual, de acuerdo con la figura 1.2., podemos decir
que se trata de la clorofila B, la cual se caracteriza por presentar un color verde
fuerte.
El tubo de ensaye numero 2 de la figura 1.1., que aprecia un color verde más claro
comparado con el 1, esto denota que, en este tubo de ensaye, se encuentra
presente la clorofila tipo A.
El color amarillo-verde que caracteriza a las xantofilas presentes en la hoja de
espinaca que se muestra en la figura 1.2., podemos apreciarlo en los tubos de
ensayo marcados con el número 3 de la figura 1.1.
En el tubo de ensaye número 4 de la figura 1.1., se observa el color amarillo-naranja
que delata la presencia de carotenos en la hoja de espinaca.

CONCLUSIONES
Por medio de la cromatografía en columna se puede llevar a cabo la separación de
los componentes de una mezcla gracias a la diferente polaridad de estos, al
fenómeno de adsorción y a la velocidad del eluyente. En la hoja de espinaca se
encuentran presentes diferentes pigmentos que presentan colores característicos
los cuales se pueden separar por medio de la cromatografía en columna, estos
pigmentos son: clorofila A, la cual presenta un color verde intenso; clorofila B, cuyo
color característico es el verde olivo; xantofilas, las cuales se manifiestan con un
color amarillo-verde; caroteno, cuyo color representativo es el amarillo-naranja.
Cabe destacar que el color del caroteno y las xantofilas se encuentran normalmente
ocultos por la abundancia de la clorofila, pero son de gran importancia, ya que
ayudan a captar la luz y transformarla en energía.

BIBLIOGRAFÍA:
 Bosch Reig, F. (2006). Cromatografía: Principios y Aplicaciones. Ediciones
Díaz de Santos.
 Valcárcel, M., & Cárdenas, S. (2010). Cromatografía: técnicas de
separación. Ediciones Díaz de Santos.
 Fernández Alba, A. R., & Hernando, M. D. (2004). Cromatografía líquida de
alta resolución. Editorial Reverté.
 Jménez, A., & Pérez, A. (2009). Cromatografía de gases. Ediciones Díaz de
Santos.
 Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010). Introducción a los
métodos de separación cromatográfica. Editorial Reverté.
 Guiochon, G., & Guillemin, C. L. (2006). Fundamentos de cromatografía
preparativa y no lineal. Editorial Reverté.
 Pino, V., & Afonso, A. M. (2009). Técnicas de separación en química
analítica: cromatografía de intercambio iónico. Elsevier.
 Belcher, R., & Lee, M. L. (2002). Cromatografía: Principios y Aplicaciones.
John Wiley & Sons.
 Linskens, H. F., & Jackson, J. F. (2007). Cromatografía: Técnicas de
separación. Editorial Acribia.