Preparación solución estándar de albumina sérica de bovino y

determinación de su concentración absoluta mediante absorciometria

UV.
Sergio Ramos Álvarez-Tecnología Medica

Resumen

Este practico abordo el análisis espectrofotométrico, proceso que nosde

una longitud permite
onda cuantificar proteínas,deen este
particular depende
caso al albumina sérica (BSA) y pretende evidenciar los la tipos
proporcionalidad
de moléculasdirecta entre
y de iones absorbancias
presentes y y
concentración, que es el pilar de la ley de Lambert-Beer.

Para ello se preparo una solución concentrada de BSA de 50 ml al 10% P/V, y a partir de esta una solución
diluida de 2ml al 0,1 %, con los que se prepararon diluciones 1;10 y 1;100 ambas 0,1% y 10% p/v; proceso
realizado en duplicado con lo que se prepararon 8 muestras, las que en seguida se analizaron en
espectrofotómetro y se procedió a calcular las concentración molar en base a la ecuación de Lambert-Beer y
su concentracion porcentual.

Finalmente se procedió a graficar los datos lo que demuestra una pendiente en ascenso, demostrando así la
ley de Lambert beer, en cuanto que a mayor absorbancia mayor la concentración será. Así mismo se calculo
el error % estimado, lo que nos indico que si bien teníamos datos dentro de un porcentaje aceptable, también
nos evidencio en cuales diluciones hubo mayor error en su preparación.

esta podría variar con la concentración. pH o

Introducción
temperatura.
Dentro de los métodos de análisis la
Para realizar el análisis se recurre a
espectrofotometría es uno de los más
un espectrofotómetro, que es un equipo que
utilizados. Es un método que se basa en la
opera proyectando un haz de luz
relación que se da entre la luz que es
monocromática a través de una muestra y
absorbida por un compuesto y la
mide la cantidad de luz que fue absorbida en
concentración de este, el cual es utilizado
ella, lo que nos permite conocer la naturaleza
para determinar moléculas, mediante su
de la sustancia en la muestra, así como la
precisión y aplicación universal a moléculas
cantidad de dicha sustancia presente en ella.
de distinta índole.
Objetivos:
El procedimiento esta descrito en
base la ley de Lambert-Beer, que describe  Realizar los cálculos pertinentes para
una relación que hay entre la luz que absorbe poder preparar una solución de
una disolución y la concentración de esa albumina sérica, así como las
misma disolución, indicando que esta disoluciones de esta.
concentración es directamente proporcional a  Calcular las concentraciones de las
la cantidad de luz absorbida o inversamente muestras preparadas mediante el
proporcional al logaritmo de la luz coeficiente de extinción molar y
transmitida. Cabe señalar que la cantidad de porcentual
luz que pueda absorber una disolución “x” a  Comprobar la ley de Lambert Beer.
Materiales Epp. los cuales después de ser agitados en
un Vortex, se procedió a medir sus
 Micropipetas absorbancias a 280 nm previamente
 Matraces volumétricos 10ml blanqueando el espectrofotómetro con agua
 Tubos Epp. 2ml destilada. Una vez obtenidas las
 Bandejillas absorbancias se procedió a calcular la
 Vaso precipitado concentración molar mediante la ecuación de
 Gradilla Lambert Beer: A=E*L*C y también la
 Agitador de vidrio concentración relativa (mg/ml) mediante el
 Cubeta de cuarzo coeficiente porcentual de 6,6 %:

Soluciones

 Albumina sérica bovina en polvo

C ( ULug )=(|λ 280
ε (% ) )
nm|
∗10
 Agua destilada
Las concentraciones porcentuales, se
Equipo pasaron a molares mediante la fórmula %
P/V.
 Espectrofotómetro
 Balanza analítica P
 Agitador Vortex % ∗10
V
M=
Método PM

Comenzamos por realizar los calcular Finalmente se calculó el % de error estimado

la masa necesaria para preparar 50 ml de mediante la fórmula: ([Ve-Vo]/Ve)*100 y se
BSA al 10%, mediante la fórmula P/V: realizó una gráfica con las concentraciones
obtenidas.
P g soluto
% = ∗100 Resultados
V ml solución
Primeramente se calculo la masa para una
Con la que determinamos que necesitamos
solución 50 ml BSA al 10%.
5 g y procedimos a pesarla, y luego disolverla
en un vaso destilado con agua destilada, P g soluto
para luego trasvasijarla a un matraz aforado % = ∗100
V ml solución
y completar los 50 ml. En seguida calculamos
el volumen necesario para poder preparar
xg
una dilución de 2ml al 0,1% P/V mediante la 10 %= ∗100
fórmula de concentraciones:
50 ml

C ₁∗V ₁=C ₂∗V ₂ 50 ml∗10 % /100=x g

Con lo que se obtuvo la cantidad de solución 5 g=x

a utilizar y en seguida se vertió en un tubo
Así mismo se realizo se calculo el volumen
Epp. de 2ml, 20 ul de la solución original y se
para preparar una dilución de 2ml al 0,1 P/V.
completó con 1980 ul de agua destilada y se
agitaron en un agitador Vortex.
C ₁∗V ₁=C ₂∗V ₂
Posteriormente preparamos dos diluciones
en factor 1:10 (concentrada) y 1:100 (diluida) P P
en agua destilada, lo cual se hizo en 10 % ∗V ₁=0 , 1 % ∗2 ml
V V
duplicado, preparando finalmente 8 tubos
 0 ,1 % P /V∗2 ml Factor Absorbancias Concentració
V ₁=
10 %P /V dilución promediadas n molar
1:10- 10% 2.503 0,571
V ₁=0 , 02 ml
1:10- 0,1% 0,4315 0,0983
Para preparar las diluciones 1:10 y 1:100 1:100- 10% 0,9655 2,2
respectivamente se dividió el volumen total (2 1:100-0,1% 0,076 0,173
ml) en el factor de dilución y se completo el Figura 2: Absorbancias promediadas por factor dilución
y sus concentraciones molares calculadas.
total con agua destilada:
A su vez se calculo la concentración relativa
2000ul
=200 ul+1800 ul H 2 O mediante su coeficiente porcentual, cuya
10 concentración fue convertida a molar.

2000ul
100
=20 ul +1980 ul H 2 O C ( ULug )=(|λ 280
ε (% ) )
nm|
∗10

Una vez analizadas las muestras en el

espectrofotómetro, se procedió a calcular la [ C ] = 0,9655 ∗100
concentración molar de estas, previamente 6 ,6
promediando las diluciones, con la siguiente
formula A=E*L*C multiplicando el resultado [ C ] =1, 46
por el factor de dilución:
%P /V ∗10
M=
Factor Absorbancia PM
dilución s
1 , 46∗10
1:10- 10% 2,507 M=
66,430
1:10- 10% 2,5
1:10- 0,1% 0,441 M : 2, 2
1:10- 0,1% 0,422
1:100-
10% 0,944
Después de comparar que los valores de las
1:100-
concentraciones calculadas son similares, se
10% 0,987
calcula el % de error estimado:
1:100-
([Ve-Vo]/Ve)*100
0,1% 0,094
1:100-
0,1% 0,058
Figura 1: Diluciones preparadas y sus respectivas 1 :100= A menor 0,944=[ C ] 2 ,1(Ve )
absorbancias medidas en el espectrofotometro.

A A mayor : 0,987
[C]=
E
Promedio de A: 0,9655=[ C ] 2 ,2 (Vo)
0,9655
[C]= ∗100 (2 , 2−2 , 1)
43.824 ∗100=4 ,76 %
2 ,1
[C]=2 ,2 M
 Concentració su alta concentración: a un 10 % y su dilución
n relativa Conversión % de error es de 1:10. Así mismo la dilución que dio una
(mg/ml) a [C] M estimado absorbancia de 0,071(1:100-0,1%) no cabe
0,379 0,0571 0,18% dentro del rango puesto que tanto como su
concentración como dilución son muy bajos.
0,653 0,0982 -1,6%
estos valores quedaron excluidos del grafico
1,46 2,2 4,76% puesto que sin ellos se aprecia el carácter
0,115 0,173 23,69% ascendente de la pendiente y visibiliza la
Figura 3: Concentraciones relativas y su conversión a
molar, sumado el % de error estimado en cada dilución
proporcionalidad directa entre absorbancias y
concentración que enfatiza la ley de Lambert-
Beer, lo que se demuestra la dilución de A:
0,944 (1:100-10%) que al tener una
concentración de 2,2 M, demuestra el
Concentración vs Absorbancias principio descrito. Cabe decir que en teoría la
1.2 dilución A:0,431(0,1% 1:10) debería haber
arrojado una absorbancia que reflejara la
1
Absorbancias 280nm

0.9655 proporcionalidad en la cual se basa el

0.8
método espectrofotométrico pero por
0.6 cuestiones que se remiten a su preparación;
Series2
0.4 0.4315 mala elección de la micropipeta al momento
0.2 de realizar la dilución, no se logro dar con
una absorbancia adecuada la cual rondaría
0 0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 entre 0,1-0,2 y no 0,4 como se obtuvo.
Concentración molar En cuanto a los cálculos realizados
para obtener la concentración de las
Figura 4: Grafico que comprueba la ley de Lambert Beer, sustancias medidas, se puede decir que
para dos diluciones, de las cuales solo una arrojo tanto el coeficiente de extinción molar como
resultados dentro del rango estimado.
el porcentual arrojan resultados similares,
Discusión con pequeñas discrepancias, habiendo una
correlación entre ambas formulas.
Uno de los objetivos del practico fue
comprobar la ley de Lambert Beer (A=E*L*C), En cuanto al porcentaje de error
la cual nos indica que la concentración en estimado, se puede decir que la dilución que
una sustancia es directamente proporcional varias estuvieron dentro del rango aceptable
con la energía radiante absorbida por esta, (5%), exceptuando la mas diluida:
para lo cual es importante una constante de 0,071(1:100-0,1%) con un 23,69% de error
que nos indica la capacidad de radiación que podría explicarse por cuestiones de
absorbida de cierta sustancia a una preparación; errores de pipeteo en alguno de
determinada longitud de onda; el coeficiente los puntos de su preparación.
de extinción molar que al ser de un valor alto
Conclusión
(43,824) nos dará una mayor absorbancia y
por ende una mayor sensibilidad en el  Se pudo comprobar la ley de
proceso Lambert- Beer ya que se demostró la
proporcionalidad directa de a mayor
En cuanto a las absorbancias
absorbancia mayor concentración, lo
obtenidas se obtuvieron algunas que no
que quedo expresado en el grafico
están dentro del rango debido a
realizado.
absorbancias muy altas (A:2500) producto de
  los métodos para calcular la
concentración, tanto por medio de el
coeficiente de extinción molar como
el coeficiente porcentual, sirven para
llegar a la concentración molar ya
que ambos emiten valores similares.
 El haber tenido absorbancias fuera
de rango y porcentajes de error altos,
indican una mala preparación de las
diluciones, las cuales al ser en
volúmenes pequeño necesitan una
mayor precisión así como exactitud.

Bibliografía

 Amézquita L. et all,"Curso Básico de

Espectroscopía Ultravioleta -visible",
Universidad de Guanajuato,
disponible en:
http://www.dcne.ugto.mx/
Contenido/MaterialDidactico/
amezquita/Analitica3/
TallerBasicoUvVis.pdf
consultado el:19/08/2018
 SKOOG, D.A.; Leary J.J., Holler F.
James; PRINCIPIOS DE ANÁLISIS
INSTRUMENTAL, 5° ed.; Ed.
McGraw-Hill (1998), págs. 353-367.
 Barnard, J.A Y CHAYEN. métodos de
análisis químico, capitulo 3. España
1970, edición urmo.