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Laboratorio de Química-Física

Primer semestre 2018

Determinación del coeficiente de partición de un fármaco


Francisca Santibáñez Méndez, Paula Rojas Vásquez, Diego Villaseca Sura.
Química y Farmacia
Correo-e: ftsantibanez@uc.cl, pvrojas1@uc.cl, dpvillaseca@uc.cl

Resumen. En este práctico se determina el coeficiente de partición (P) de la amoxicilina y su Log P para
encontrar el grado de lipofilia de este fármaco, lo que nos permite deducir su comportamiento en los
fluidos biológicos. Para esto se determina la concentración inicial y final del fármaco en la fase acuosa,
luego de ponerla en contacto con una fase inmiscible en ella ya que posee propiedades hidrofóbicas, las
cuales se logran calcular a través de una recta obtenida a partir de una curva de calibrado de seis
disoluciones preparadas a dos pH y concentraciones del fármaco distintas, para obtener un P promedio
de 0,304 y 0,0498 para pH 5,0 y 7,4 respectivamente, de las disoluciones y así determinar un Log P de
-0,520 y -1,3 a pH 5,0 y 7,4 respectivamente, del fármaco en estudio.

1. Introducción 2. Materiales y métodos


Un fármaco o principio activo es una sustancia pura, Materiales:
químicamente definida, que puede ser obtenida de
● 6 Tubos de ensayo
fuentes naturales o por síntesis que tiene una actividad
● 2 Pipetas graduadas 10 mL
biológica, sea o no utilizada con fines terapéuticos o
de diagnóstico [3]. Cuando un fármaco es ● 1 Micropipeta 1000 L
administrado a un paciente, entre el tiempo en el que ● 6 Celdas UV-Visible
la droga es administrada y el tiempo en el que es ● Tapón de goma
eliminada del organismo ésta debe difundir a través de Reactivos:
una variedad de membranas biológicas que actúan
como barreras lipídicas. Un criterio importante para ● Fármaco
evaluar la capacidad de una droga para penetrar estas ● 1-Octanol
membranas lipídicas es su coeficiente de partición ● Agua
aparente aceite/agua, definido como:
Métodos:
𝐶𝑜
𝐾= A partir de una disolución de amoxicilina de
𝐶𝑤
concentración conocida, se deben preparar 3
donde Co es la concentración en el equilibrio de todas disoluciones de 100 mL a dos pH distintos, los cuales
las formas de la droga, por ejemplo, ionizada y no son 5,0 y 7,4.
ionizada en la fase orgánica del equilibrio, y Cw es la
Luego se determina la concentración inicial de seis
concentración en el equilibrio de todas las formas en
disoluciones acuosas de fármaco, las cuales son
la fase acuosa [1]. Sin embargo, una expresión más
preparadas con 30, 50 y 70 mL de las disoluciones de
sencilla de aplicar es la que se presenta en la siguiente
distinto pH preparadas previamente y se aforan a 100
ecuación:
mL, y se mide la absorbancia de cada una a =400 nm.
𝐶𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎 − 𝐶𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎 Se utiliza una curva de calibrado para obtener la
𝐾= ecuación de la recta, de la cual se pueden extrapolar
𝐶𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎
las concentraciones a través de las absorbancias
El coeficiente de partición de un fármaco es usado para medidas.
estudiar su absorción, metabolismo, toxicidad y
Posteriormente, se introducen 5 mL de cada disolución
correlación estructura-afinidad [1].
acuosa y 3 mL de octanol en un tubo de ensayo, el cual
Por otra parte, el coeficiente de partición (P), en forma se tapa con un tapón de goma, se agita (sin batir) por
de Log P, es también uno de los parámetros un minuto y se espera que se observe la separación de
considerados en las reglas de Lipinski para la fases para que el sistema se encuentre en equilibrio
determinación de las propiedades de fármaco que cabe Una vez alcanzado el equilibrio, se extraen 2,5 mL de
esperar para una molécula [5]. El valor de Log P fase acuosa (sin burbujas de octanol) y se deposita en
representa el grado de lipofilia de una sustancia. una celda UV-visible. Luego se determina
espectrofotométricamente la concentración final de
soluto en la disolución acuosa, midiendo la
absorbancia a =400 nm, para reemplazarla en la 7,4 después del reparto para calcular la
misma recta anterior. Finalmente, se utilizan las concentración final de amoxicilina en la fase
concentraciones iniciales y finales para calcular el acuosa.
coeficiente de partición (P) de la amoxicilina y su Log
P.
3. Resultados y Discusión Determinación del coeficiente de partición (P):
Datos y cálculos para la determinación del El coeficiente de partición puede ser calculado a
coeficiente de partición (P) y Log P de la partir de la siguiente ecuación:
amoxicilina. [𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜]𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑎 𝐶𝑜
Determinación de concentración inicial de 𝑃= =
[𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜]𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎 𝐶𝑤
amoxicilina en fase acuosa:
Luego, al no conocer la concentración de nuestro
Para obtener la concentración inicial de compuesto (amoxicilina) en la fase orgánica, la
amoxicilina en la fase acuosa, se le miden las ecuación queda en función de la concentración
absorbancias a 400 nm a las disoluciones 1,2 y 3 inicial y final en la fase acuosa:
a pH 5,0 y 7,4; y con estas se extrapolan las
concentraciones a partir de la recta obtenida de 𝐶𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎 − 𝐶𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎
𝑃=
una curva de calibrado (previamente dada). 𝐶𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎
La recta de la curva de calibrado se obtiene a Como anteriormente se calculó la concentración
través de Excel, la cual es: inicial y final en la fase acuosa se puede aplicar
esta última ecuación de la siguiente forma:
𝑦 = 18,577𝑥
Para la disolución 1 se tiene que la concentración
Donde “y” corresponde a la absorbancia y “x” a
inicial de amoxicilina en la fase acuosa es de
la concentración inicial de amoxicilina en la fase
4,84x10-3 mol L-1 mientras que la concentración
acuosa.
final de amoxicilina en la fase acuosa es de
Luego, para la disolución 1 a pH 5,0 se obtiene 3,61x10-3 mol L-1, reemplazando en la fórmula:
una absorbancia de 0,090, reemplazando en la
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
recta se tiene: 0,00484 𝐿 − 0,00361 𝐿
𝑃= = 0,341
𝑦 = 18,577𝑥 𝑚𝑜𝑙
0,00361 𝐿
𝑥 = 0,00484
El mismo procedimiento se realiza con las
El mismo procedimiento se realiza con las concentraciones iniciales y finales de amoxicilina
absorbancias de otras disoluciones a pH 5,0 y 7,4 en la fase acuosa de las otras disoluciones a pH
para calcular la concentración inicial de 5,0 y 7,4 para calcular el coeficiente de partición.
amoxicilina en la fase acuosa.
Determinación de Log P:
Determinación de concentración final de
Para determinar el Log P simplemente basta con
amoxicilina en fase acuosa luego del reparto:
aplicar logaritmo en base 10 al coeficiente de
Para obtener la concentración final de partición (P) obtenido anteriormente.
amoxicilina en la fase acuosa, se le miden las
Para la disolución 1 se tiene que el coeficiente
absorbancias a 400 nm a las disoluciones 1,2 y 3
de partición (P) es de 0,341:
a pH 5,0 y 7,4 después de realizar el reparto con
octanol, y con estas se extrapolan las log10 0,341 = −0,467
concentraciones a partir de la recta mencionada
El mismo procedimiento se realiza con los
anteriormente:
coeficientes de partición (P) de las otras
𝑦 = 18,577𝑥 disoluciones a pH 5,0 y 7,4 para calcular el Log
P.
Para la disolución 1 a pH 5,0 se obtiene una
absorbancia de 0,067 después del reparto con Para determinar el coeficiente de partición (P) de
octanol, reemplazando en la recta se tiene: la amoxicilina se usa el octanol, ya que este es un
compuesto orgánico que remeda adecuadamente
𝑦 = 18,577𝑥
el material lipídico de la biota y el material
𝑥 = 0,00361 orgánico presente en partículas y sedimentos, por
lo que el coeficiente de partición de un compuesto
El mismo procedimiento se realiza con las
absorbancias de las otras disoluciones a pH 5,0 y

2
en el sistema bifásico octanol-agua es una buena
medida de su hidrofobicidad [4]. 3.1 Figuras y tablas
Como se puede observar en la tabla 2 la Tabla 1. Datos para curva de calibrado.
concentración inicial en la fase acuosa es siempre
mayor a la final, ya que luego de realizar el Concentración Absorbancia
reparto con octanol una parte del soluto queda en (mol L-1) ( = 400 nm)
fase orgánica debido a la afinidad que posee con
este, dado que es liposoluble.
0,0066 0,117
Por otra parte, al mirar los resultados de P y Log
P obtenidos en la tabla 3 se puede apreciar que
estos difieren a los distintos pH, siendo que 0,0132 0,243
debería ser una propiedad que no cambie. Esto se
explica debido a que muchos fármacos presentan
0,0198 0,374
propiedades ácido-base, los cuales pueden sufrir
ionización dependiendo del pH del medio en el
que se encuentren. Dado que los iones son mucho 0,0264 0,491
más polares que los compuestos neutros, la
ionización complica la medida del valor de Log P
dado que subestima este valor de la especie neutra 0,0330 0,618
en sustancias donde la forma ionizable sea la
predominante de tal forma que se debe corregir 0,0396 0,744
teniendo en cuenta el pKa y el pH. En el caso de
sustancias ionizables no se habla de P si no de D
o coeficiente de distribución el cual corresponde 0,0462 0,846
a un coeficiente de reparto aparente que toma en
cuenta la forma ionizada y no ionizada de la
sustancia [2]. Cabe mencionar que para el cálculo
del promedio del coeficiente de partición y Log P Curva de calibrado
a pH 7,4 en la tabla 3 no se considera el valor del
1
tubo 2, ya que es un dato anómalo, debido a que
0.9
la absorbancia del tubo 2 después del reparto
0.8
resulta mayor, lo que significa que la
Absrobancia a 400 nm

0.7
concentración en la fase acuosa después del 0.6
reparto es mayor a la inicial, por lo que P es 0.5
negativo, al cual no se le puede aplicar logaritmo 0.4
en base 10. 0.3 y = 18,577x
0.2
En relación a Log P cabe mencionar que, a un
0.1
mayor valor de P o Log P, se puede afirmar que 0
la sustancia presenta mayor afinidad por la fase 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
orgánica y por consiguiente su carácter lipofílico Concentración de Amoxicilina (mol/L)
es mayor. En el caso de los Log P obtenidos, a
pesar de diferir en su valor, ambos son negativos Figura 1. Curva de calibrado para las concentraciones
lo cual indica que la amoxicilina posee un de Amoxicilina con sus respectivas absorbancias a 400
carácter más hidrofílico. En comparación con el nm.
Log P descrito 0,87, se puede apreciar que es
distinto al obtenido experimentalmente, esto se
debe a que la amoxicilina es un fármaco ionizable
por lo que esto afecta significativamente al
utilizar Log P, por lo que se obtiene un valor
lejano al descrito.
Tabla 2. Resumen de datos obtenidos para tubo 1, 2 y 3.2 Abreviaturas y acrónimos
3 para cada pH.
 P o K : Coeficiente de partición
 Log P : Logaritmo en base 10 del coeficiente
pH Tubo* 1 2 3
de partición
Absorbancia 0,090 0,155 0,214  mL : Mililitros
antes de   : Longitud onda
reparto  C : Concentración
(promedio)  Co : Concentración de soluto en fase orgánica
 Cw : Concentración de soluto en fase acuosa
4,84x10-3 8,34x10-3
Cinicial en agua 0,0115
 UV : Ultravioleta
(mol L-1)  nm : nanómetros
0,067 0,123 0,163
 L : Litro
Absorbancia
después de 4. Conclusión
reparto
(promedio)  La determinación de P da un valor promedio
de 0,304 a pH 5,0 y de 0,0498 a pH 7,4.
Cfinal en agua 3,61x10-3 6,62x10-3 8,77x10-3  La determinación de Log P da un valor
5,0 (mol L-1) promedio de -0,520 a pH 5,0 y de -1,3 a pH
7,4.
Absorbancia 0,107 0,167 0,253  P y Log P se ven afectados por el pH.
antes de  Se determina que la amoxicilina posee
reparto carácter hidrofílico.
(promedio)
Apéndice I: Coeficiente de distribución D
Cinicial en agua 5,76x10-3 8,99x10-3 0,0136
(mol L-1) Como se menciona anteriormente el coeficiente de
distribución D, a diferencia del coeficiente de partición
0,105 0,174 0,245
P, toma en cuenta la forma ionizada y no ionizada del
Absorbancia
después de
analito. Es por esto que se ve afectado por el pH
reparto Su expresión matemática para ácidos y bases,
(promedio) respectivamente es:
Cfinal en agua 5,65x10-3 9,37x10-3 0,0132 Log D = log (Pn • 10pka + Pi •10pH) – log (10pka +
7,4 (mol L-1) 10pH)
Log D = log (Pn • 10pH + Pi •10pka) – log (10pka +
*Cada tubo contiene 5 mL de la disolución acuosa de 10pH)
amoxicilina, las cuales contienen 30, 50 y 70 mL de
disolución madre aforadas a 100 mL (igual para ambos Dado que la concentración de las especies iónicas en
pH), y 3 mL de octanol para efectuar el reparto. el disolvente orgánico puede despreciarse en
compuestos poco lipófilos, pues con frecuencia es de
Tabla 3. Resumen de coeficientes de partición (P) y 30 a 50 veces menor que Pn, las ecuaciones pueden
Log P en cada tubo para cada pH. simplificarse para la mayor parte de los ácidos y bases
a valores de pH no muy alejados de los valores de pKa:
pH Tubo 1 2 3 𝑋̅
Log D = log Pn – log (1 + 10pH-pka)
5,0 Coeficiente 0,341 0,260 0,311 0,304 Log D = log Pn – log (1 + 10pka-pH) [7]
de
partición Agradecimientos
(P) Se agradece al profesor del curso, a los ayudantes y a
la Pontificia Universidad Católica de Chile por
Log P -0,467 -0,585 -0,507 -0,520
permitirnos llevar a cabo esta experiencia que es muy
útil para entender los temas tratados en clases,
7,4 Coeficiente 0,0195 -0,0406 0,0303 0,0498 llevándolos a la práctica.
de
partición Referencias
(P)
[1] Alfonso R. Gennaro. Remmington: Farmacia. 20ª
Edición. Editorial Médica Panamericana. Montevideo,
Log P -1,710 --- -1,519 -1,3
2003. Página 199 y 1052.

4
[2] Dawsn, Taylor, Reide. Lo esencial en
farmacología. 2ª Edición. Editorial Elsevier. Página
11.

[3] Pelayo Campos García, Santiago Vázquez Cruz,


Carmen Escolano Mirón. Química Farmacéutica I,
Tomo 1. Editorial Universitat de Barcelona. España,
2009. Página 13.

[4] Juan E. Figueruelo, Martín Marino Dávila.


Química Física del ambiente y de los procesos
medioambientales. Editorial Reverté. España, 2004.
Página 242.
[5] Antonio Delgado Cirilo, Cristina Minguillón
Llombart, Jesús Joglar Tamargo. Introducción a la
Química Terapéutica. 2ª Edición. Editorial Díaz de
Santos. Madrid, 2004. Página 158.

[6] Harry G. Brittain. Analytical profile of drug


substances and excipients. Editorial Academic Press.
California, 1994. Página 10.
[7] Pasto, D. J; Johnson, C. R. Determinación de
estructuras orgánicas. Editorial Reverte. España,
2003. Página 18-20.

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