PRÁCTICA N° 1

ESPECTROFOTOMETRÍA

INDICE DE EXPERIMENTOS

1. Determinación del espectro de absorción del Azul de Evans

2. Demostración de las leyes de Lambert-Beer

OBJETIVO GENERAL

Demostrar las leyes que fundamentan los análisis fotométricos y su aplicación a la

bioquímica clínica, análisis de biomoléculas, entre otras.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Explicar los fundamentos en los que se basan la Espectrofotometría y las

aplicaciones de la técnica.
2. Determinar la longitud de onda a la cual la solución de Azul de Evans presenta la
máxima absorción.
3. Practicar el manejo del espectrofotómetro.

FUNDAMENTO

Cada sustancia presenta una absorción máxima a una determinada longitud de onda. Para
seleccionar la longitud de onda óptima para una determinada sustancia, es preciso construir
una curva que relacione absorbancia con longitudes de onda.
Manteniendo fija la concentración de la solución con su blanco adecuado, se hace variar la
longitud de onda efectuando las lecturas de la densidad óptica que corresponde a cada
caso. Los resultados obtenidos son usados para la construcción de una gráfica que debe
relacionar la longitud de onda (eje de las X o abscisas) con las lecturas de la absorbancia
(eje de las Y u ordenadas). En el punto que la absorción es máxima, existe la máxima
sensibilidad y la longitud de onda que corresponde a dicho punto será la conveniente.
ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL AZUL DE EVANS

PROCEDIMIENTO

En un matraz aforado de 100

Longitud de onda (nm) Absorbancia (Abs)
ml, coloque 1 ml de solución
540
madre de azul de Evans y
550
afore con agua destilada. Lea
560
la absorbancia de la solución
570
en las siguientes
580
longitudes de onda:
590
600
610
620
630
640
RESULTADOS

Anota la absorbancia para cada longitud de onda señalada. Usa estos datos para elaborar
una curva espectral para el Azul de Evans. Anote la longitud de onda de absorción máxima
encontrada.

DEMOSTRACIÓN DE LAS LEYES DE LAMBERT BEER

OBJETIVO
Observar el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en la curva de calibración del Azul de
Evans.

INTRODUCCIÓN

Al utilizar cualquier método colorimétrico es indispensable conocer la sensibilidad de este y

el rango en el que el color desarrollado en la solución es directamente proporcional a la
concentración del soluto.

Para cumplir estos propósitos, una vez se ha seleccionado la longitud de onda de máxima
absorción, se efectúan los ensayos en varias soluciones con concentraciones crecientes de
la sustancia. Se determina para cada una de ellas la absorbancia a la longitud de onda de
máxima absorción y se genera el gráfico que debe relacionar la concentración de la
sustancia (eje X) con las lecturas de absorbancia (eje Y). Mediante esta gráfica se puede
determinar la concentración de cualquier solución problema de la misma sustancia. Si la
gráfica resulta en una línea recta se cumple las Leyes de Lambert-Beer.

PROCEDIMIENTO 1: CURVA DE CALIBRACIÓN PARA AZUL DE EVANS

A partir de la solución madre de azul de Evans (50 mg/100 ml) se preparan diluciones a las
siguientes concentraciones: 0.750 mg %, 0.500 mg %, 0.250 mg %, 0.125 mg %, 0.0625
mg %. Calibrar el aparato al 100% de transmitancia con agua destilada y leer cada
concentración a la longitud de onda máxima.

CONCENTRACIÓN (mg
TUBO Abs
%)
1 0.750
2 0.500
3 0.250
4 0.125
5 0.0625

EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Elabore un gráfico de la absorbancia en función de la concentración del colorante en cada
solución. Observe si cumple con las leyes de Lambert-Beer.

DETERMINACIÓN DE UNA CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA

Vierta 5 ml de una solución desconocida en un tubo de ensayo. Lea el porcentaje de

transmitancia a la longitud de onda máxima para el medio, calibrando al 100% de
transmitancia con el tubo blanco. Interprete el resultado de la absorbancia en la curva de
calibración.

ACTIVIDAD (BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN PREVIO AL LABORATORIO)

Investiga sobre aplicaciones de la espectrofotometría en la bioquímica clínica.