CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO PARA LA

PURIFICACION DE LISOZIMA DE HUEVO - DETERMINACION DE

LA ACTIVIDAD ESPECIFICA Y EL GRADO DE PUREZA DE
LISOZIMA PURIFICADA POR CROMATOGRAFIA
Sergio Ramos-Tecnología Medica podrá unir moléculas que posean carga
positiva.

El presente informe contiene el trabajo realizado en dos prácticos, el cual aborda la separación de
biomoleculas, en este caso la lisozima mediante cromatografía de intercambio iónico, y su cuantificación y
determinación de su rendimiento, a través del cálculo de su actividad específica y la pureza de la
sustancia.

Del practico 6 se obtienen muestras del proceso de lavado y eluido de la muestras las cuales son
analizadas en el espectrofotómetro con lo cual se obtiene picks de absorbancias que indican las muestras
adecuadas para su incubación, siendo el mayor pick del eluido (1475nm).

Luego en el practico 7 se pretendió determinar y cuantificar la actividad específica de la lisozima y su

grado de pureza en base a la capacidad de esta para lisar bacterias Gram positivas, utilizando muestras
de eluido, lavado, extracto crudo y comercial, y la cuantificación de estos mediante reactivo de Bradford y
una curva de calibración. Lo que arrojo resultados normales en cuanto al rango de rendimiento y
comprobó la capacidad de lisar bacterias de la lisozima.

Introducción
Los prácticos en los cuales se realizo La fase móvil (liquida o gaseosa),
este informe; 6 y 7 tienen como eje en común mueve la muestra a través de una región que
un método se separación cromatografico y un contiene la fase estacionaria (solida o
componente de análisis que es la lisozima. liquida). Los componentes de la muestra se
esta sustancia tiene su origen en secreciones distribuyen entre la fase móvil y la
de los mamíferos, que funciona como un estacionaria, donde algunos poseen mayor
antibiótico natural y que cataliza la hidrolisis afinidad por la fase estacionaria retardando
de uniones beta 1,4 entre los residuos de su movimiento por el sistema cromatográfico.
ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-
Los componentes con afinidad débil
glucosamina en un peptidoglicano. sumado a
por la fase estacionaria se quedan en la fase
lo anterior la lisozima ayuda al diagnostico
móvil y son eluídas rápidamente del sistema;
clínico de enfermedades si es que se
primero eluian las moléculas de carga
encuentra en altos niveles en determinadas
negativa, en seguida las de carga neutra y
zonas del cuerpo, puede indicar la presencia
finalmente las de carga positiva.
de tumores.
Este practico pretende demostrar que
EL método de separación que se
la actividad muramidasa de la lisozima puede
utilizo fue la cromatografía; método
ser cuantificada mediante su capacidad de
recurrentemente utilizado para la separación
lisar bacterias Gram positivas, lo que se verá
de biomoleculas que posee dos fases: la fase
reflejado al momento de analizar en el
estacionaria, que se utiliza carboximetil
espectrofotómetro la reducción de
celulosa, que al estar a un pH 3 sus grupos -
absorbancias que se generan en distintas
CH2-COOH se cargaran negativamente y
fracciones por espacio de 2 minutos.
Objetivos
 Realizar la purificación
caracterización de la lisozima a
través de la clara de un huevo.
 Determinar la actividad específica y
el grado de pureza de la lisozima.
 Aprender a realizar el método de
cromatografía en fase estacionaria.
 Determinar la concentración de la
lisozima mediante curva de
calibración de método de Bradford
Materiales
Laboratorio 6
 Micopipetas
 30 tubos de ensayo
 2 tubos falcón
 Gasa
 Vaso precipitado
 Huevo
 Columna para cromatografía
 Pipeta invertida de 5 ml
Soluciones
 Buffer A: buffer Tris-HCl 50 mM, pH
8,2, conteniendo 50 mM NaCl
 Buffer B: buffer Tris-HCl 50 mM, pH
8,2, conteniendo 600 mM NaCl
 Carboximetil celulosa en buffer A
 Agua destilada
Equipo
 Espectrofotómetro
Laboratorio 7
 Micropipetas.
 Espectrofotómetro.
 Tubos epp.
 Cubetas de plástico
Soluciones
 Extracto crudo de clara de huevo.
 Lavado de clara de huevo.
 Eluído de clara de huevo.
 Lisozima comercial (50 mg/ml).
 Micrococcus luteus liofilizado
(sustrato).
Método
Laboratorio 6
y
Comenzamos por separar la yema de la clara
del huevo, vertiendo la clara en un vaso
precipitado, para en seguida filtrar la clara a
través de una gasa sobre otro vaso
precipitado hasta recolecta entre 10 ml.
Una vez finalizado el filtrado, se vertió 10 ml
de este en una vao precipitado, agregando
70 ml de buffer A. En seguida se rotulo 30
tubos del 1 al 30, marcando del 1 al 14 con
3ml, y del 15 al 30 con un 1 ml.
Luego con una columna de
cromatografía armada, se le agrego 3ml de
buffer A, y se le abrió la llave de paso y
comenzó a gotear sobre el tubo 1 hasta 2 ml,
sin dejar que se seque la columna. A
continuación, agregamos 5 ml de extracto de
clara por las paredes y se colocó en el tubo
2, y se abrió la llave de paso para que gotee
hasta 2 ml de la resina y se vuelve a tapar.
Proseguimos con el lavado de la
columna con buffer A y se coloco esta en el
tubo 3 y se procedió a drenar hasta
completar los 3 ml rotulados en el tubo d
ensayo, y luego se paso al siguiente tubo
hasta llegar al tubo N° 14.
En seguida se procedió a la elusión
para lo cual se agrega a la columna buffer B
y se procede a drenar en el tubo N°15 hasta
completar el ml rotulado, y se prosigue en los
siguientes tubos hasta el tubo N°30.
Finalmente se procede a medir sus
absorbancias en el espectrofotómetro a
280nm , con lo cual se determina los picks de
absorbancia de determinados tubos, los
cuales se seleccionan y se depositan en
tubos falcon para ser incubados.
Laboratorio 7
Se comenzó por rotular 8 tubos epp. de 2ml,
de los cuales a 4 de ellos se vertió 950 ul del
sustrato Micrococcus Luteus. En seguida se
vertió a cada tubo la muestra; al tubo 1 se le
agrego 100 ul de muestra comercial, al 2 se
le agrego 100 ul de extracto crudo, al tubo 3
 Absorbancias 280 nm
100 ul de la muestra lavada y al tubo 4 se le Absorbancias eluido
agrego 100 ul de la muestra eluida. 1.6
1.4
Se prosiguió a realizar las diluciones a base 1.2
del extracto crudo y extracto eluido, y al 1
finalizar se procedió a medir las absorbancias 0.8
a 450nm. Para ello se blanqueo el equipo 0.6
con agua destilada y se procedió a agregar a 0.4
cada tubo con sustrato 50 ul de las distintas 0.2
fracciones y se leyó las absorbancias en un 0
periodo de 2 minutos, registrando valores 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
cada 15 segundos con la ayuda de un N° de Tubos
cronometro.
Figura 2: Grafica del proceso de eluido (tubos 15-29), se
Finalmente se tomo 14 tubos epp visibilizan los picks de absorbancia; contendría la
(con el fin de hacer el procedimiento en lisozima en forma pura.
duplicado), a los cuales se les agrego 1ml de
reactivo de Bradford y 50 ul de las fracciones, Practico n°7
para después medir sus absorbancias a
La medición de la actividad muramidasa en
595nm.
las 4 fracciones se realizo, añadiendo 50 ml
Resultados de la muestra a los tubos que contenían el
sustrato y se leyeron a 450nm. De esto se
De los resultados de la medición determino que la lisozima del lavado hubo
espectrofotométrica de los tubos de lavado y una reducción de 0,014, evidenciando que
eluido se obtuvo una serie de absorbancias desde el segundo 75 hasta el 120 hubo un
que al ser graficadas se visibilizaron los picks estancamiento en la reducción.
de absorbancias tanto en el lavado y eluido;
por lo consiguiente las muestras de elevados
picks fueron seleccionados para ser Tiempo (s) Absorbancias
incubados posteriormente.
0 0,244
En teoría el eluído debería contener lisozima
Absorbancias del lavado 15 0,239
Absorbancias 280 nm

en forma pura 30 0,236

0.9
0.8 45 0,232
0.7 60 0,231
0.6
0.5 75 0,23
0.4 90 0,229
0.3 105 0,23
0.2
0.1 120 0,23
0 Tabla1: Absorbancias emitidas de la
1 2 3 4 5 6 7 8 lisozima de lavado

N° de Tubos

Figura 1: Grafica con los tubos provenientes del lavado

(tubos 1-8), se visbilizan los picks de absorbancia;
contendría el resto de proteínas y elementos no
deseados.
En la lisozima del eluido, se aprecia una Absorbancia
reduccion de 0,012 absorbancia en el periodo
Tiempo (s) s
de 2 minutos.
0 0,222
Absorbancia 15 0,218
Tiempo (s) s 30 0,216
0 0,117 45 0,208
15 0,115 60 0,204
30 0,114 75 0,199
45 0,113 90 0,195
60 0,112 105 0,191
75 0,111 120 0,187
Tabla 4: Absorbancias emitidas del extracto crudo.
90 0,11
105 0,1 Se procedió a calcular las concentraciones
120 0,105 mediante una curva de calibración
Tabla 2: Absorbancias emitidas de la previamente elaborada en el practico n° 3,
lisozima del eluido con lo cual mediante interpolación y ecuación
de la recta se determino las concentraciones
En la actividad de la lisozima comercial se
de las fracciones de lavado, eluido y extracto
puede apreciar una reducción de 0,028 de
crudo, en base a las muestras preparadas
absorbancia.
con reactivo de Bradford.
Absorbancia
Tiempo (s) s
Curva de calibrado método de
0 0,241 Bradford
0.4
15 0,236
0.35
30 0,233
Abs. (595nm)

f(x) = 1.735 x + 0.00125000000000006

0.3 R² = 0.999701108389722
45 0,229
0.25
60 0,226
0.2
75 0,223
0.15
90 0,219
105 0,215 0.1

120 0,213 0.05

Tabla 3: Absorbancias de la lisozima comercial 0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

En el extracto crudo se aprecia
reducción de 0,035 absorbancias.
Concentracion (mg/ml)
una
Figura 3: Curva de calibración método de Bradford
Se calcularon las concentraciones con los
datos que entrega la ecuación de la recta y
tomando en cuenta el factor de dilución
1:200, con lo que arrojaron los siguientes
resultados.
 Absorbancia Concentracio
Fracciones s n
Lavado 0,218 25mg/ml
Eluido 0,225 25,9mg/ml Activida
Extracto d
crudo 0,402 46,2mg/ml U de Mg de especific
Comercial Conocida 50,00mg/ml enzima proteínas a
Tabla 5: Concentraciones de las fracciones lavado, 5,6
eluido y extracto crudo, la concentración de la fracción
comercial ya era conocida. Lavado 7U 1,25mg U/mg

Actividad especifica
Eluido 6U 1,295mg 4,6U/mg
Comerci
Se calculara la actividad específica en al 14U 2,5mg 5,6U/mg
unidades de enzima por mg de proteínas, se
hará de la siguiente forma: Tabla 6: Unidades de enzima, mg de proteínas y su
actividad específica de cada fracción
Primero se restara las absorbancias entre el
segundo 0-60 y 60-120, con lo cual se En seguida se procedió a calcular la
obtendrá un promedio; para el caso del purificación, tomando como referencia el
lavado se tiene que: extracto crudo, bajo la siguiente fórmula:

0,244−0,231=0,013 actividad especifica(etapa x)

ectividad especifica (referencia)
0,231−0,230=0,001
Para el caso del lavado:
Promedio=0,007
5 ,6
1U∗0,007 =0,739
=7 U 7 ,57
0.001
Para el cálculo del rendimiento se aplica la
En seguida se obtiene los mg de proteína en siguiente fórmula:
base a las concentraciones obtenidas
anteriormente. Este cálculo se realizo actividad especifica(etapa x)
despejando los 50 ul de la muestra y
∗100
ectividad especifica (referencia)
multiplicando el resultado por la
concentración del lavado en este caso 5 ,6
∗100=73 , 97
50 ul 7 ,57
=0 , 05
1000 Purificació Rendimient
0 , 05∗25 , 00 mg/ml=¿ n o
Lavado 0,739 73,90%
¿ 1 ,25 mg Eluido 0,607 60,70%
Luego para obtener la actividad específica, Comercial 0,739 73,90%
se procedió a dividir los valores de unidades Extracto
de enzima en los mg de proteínas crudo 1 100%
calculados, arrojando los siguientes Tabla 7: Valores de purificación y rendimiento %
resultados: obtenidos.

Discusión

En base a los gráficos del practico N°6 se

puede apreciar que el mayor pick de
absorbancia se produjo en la etapa de eluido,
en el tubo 25 con una absorbancia de
1,475nm, lo que hace presumir que la
lisozima en estado puro se encontraba en
esta etapa.
Sobre el practico 7 se ven en las
absorbancias registradas, ciertas
reducciones dispares, que se podrían
explicar por interferentes o perdidas de
propiedades proteicas de la lisis al momento
de descongelarse.; también podría influir el
hecho de que la resina de la columna no este
del todo solida.
Así mismo las absorbancias de las
fracciones; lavado, eluido, comercial y
extracto crudo, evidencian donde se genero
una mayor actividad de la lisozima, en base a
las absorbancias mayores que se generaron.
En cuanto a la actividad específica se puede
apreciar que esta alcanzo sus valores
máximos en la etapa de lavado y comercial,
lo que indicaría que en estas fracciones se
descarto proteínas contaminantes y que la
enzima fue purificada a homogeneidad.
Al medir la actividad específica de la lisozima
se debe observar un aumento después de la
cromatografía de intercambio iónico ya que
se va descartando otras proteínas
contaminantes y así alcanzar un valor
máximo, cuando la enzima ha sido purificada.
proteínas que no presenten afinidad
a la columna eluyan rápidamente, y
el resto eluya dependiendo de su
afinidad.
 El método de cromatografía es una
buena opción, dentro de otras
técnicas de separación como la
espectroscopia de absorción
atómica, ya que es un método
cualitativo, cuantitativo eficaz, rápido
y económico.
Bibliografía
 La cromatografía. Fundamentos de
tecnología de productos
fitoterapéuticos. Nikolai Sharapin.
Editorial Convenio Andrés Bello,
2000. ISBN 9586980014. Pág. 159-
190.l
 Righetti P. Determination of the
isoelectric point of proteins by
capillary isoelectric focusing. J
Chromatogr A. 2004;1037:491-9
 Técnicas de bioquímica y biología
molecular. Jorge David Roriguez
Miranda. Editorial Reverté, 1991.
ISBN 8429118195. Cap. 8:
Cromatografía. Pág. 179

Conclusión

 En base a los resultados de los

valores de rendimiento se entiende
que estos están dentro de un rango
aceptable (60-80%), por ende se
puede decir que se obtuvo un
rendimiento normal.
 Se comprueba que la lisozima tiene
capacidad para lisar bacterias gram
positivas y que su mayor actividad se
evidencio en la fracción del extracto
crudo.
 El pH, cargas, gradiente y la
porosidad pueden afectar el tiempo
que el toma a la muestra eluir de la
columna. por ello es recomendable
usar un buffer que aumente la
concentración salina, para que las