TRABAJO PRÁCTICO Nº 1: DETERMINACIÓN DE NO3- Y NO2-

EN MUESTRAS DE AGUA POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV Y

VISIBLE.
Integrantes: Goñi, Oriana
Ivani, Martina
1.- Cuestionario

a- ¿Qué intervalos de longitudes de onda corresponden en el espectro

electromagnético a las regiones: a) UV lejano; b) UV cercano; c) visible; d) IR cercano;
e) IR medio; f) IR lejano?

- UV lejano: 10 a 200 nm
- UV cercano: 200 a 400 nm
- Visible: 400 a 800 nm
- IR cercano: 800 nm a 2500 nm
- IR medio: 2.5 µm a 50 µm
- IR lejano: 50 µm a 1000 µm

b- En esta experiencia, ¿Por qué cree que la determinación del ion nitrato es más
simple que la del nitrito? ¿De qué material deben ser las celdas utilizadas en cada
caso?

La determinación de nitrato resulta más sencilla porque es posible medir directamente la

absorbancia del analito, el cual absorbe a 220 nm. El único paso extra, además del armado
de la curva de calibración correspondiente, es la corrección de la absorbancia de las posibles
trazas de materia orgánica presente, la cual también absorbe a 220 nm y actuaría como un
interferente en el análisis. Para corregir estos efectos, se resta dos veces el valor de la
absorbancia a 275 nm, longitud de onda a cuál absorbe la materia orgánica pero no el analito.

Para la determinación de nitrito es necesario realizar una derivatización porque el analito no

absorbe en la región UV-Visible. Esto hace que su determinación entonces, necesite de
reactivos especiales y un procedimiento experimental un poco más complejo. La reacción
que se utiliza es la formación de una sal de diazonio, que luego reacciona para dar un
colorante azoico rosado, especie que absorbe fuertemente en la región visible.

Las celdas utilizadas en la determinación de nitrato deben ser de cuarzo, porque se mide en
la región UV, mientras que las celdas utilizadas en la determinación de nitrito pueden ser de
plástico debido a que las mediciones se realizan en la región visible del espectro.

c- ¿Cuál es el propósito de preparar una curva de calibración?

El propósito de preparar una curva de calibración a partir de una solución patrón, es
comprobar que la relación entre la absorbancia y la concentración de la especie que se
quiere estudiar sea lineal. Si esto se cumple, entonces se puede aplicar la Ley de Beer, y
utilizar la medición de absorbancia de la muestra para interpolar el valor de la concentración
de analito correspondiente.
Para realizar una curva de calibración es necesario seleccionar una longitud de onda donde
el analito tiene un máximo de absorción.

d- Suponga que la absorbancia experimental es mayor a uno. ¿Cómo modificaría su

procedimiento?
Si la absorbancia medida es mayor que 1, se debe realizar una dilución de la muestra y
repetir la medición.

e- Deduzca la ley de Beer e indique las causas de sus desviaciones. ¿Cómo están
relacionados algebraicamente el porcentaje de transmisión y la absorbancia?

Para derivar la ley de Beer, consideramos que un haz de radiación monocromática con
potencia Po irradia al bloque de la materia absorbente; después de pasar por una longitud b
del material, que contiene n partículas absorbentes, su potencia disminuye a P como
resultado de la absorción, como se observa en la imagen:

Si analizamos una sección de área S, y un espesor infinitesimal dx que contiene dn partículas

absorbentes, al atravesarlo, la potencia del haz disminuirá en una cantidad dP por la
interacción con las partículas.

El área total proyectada de estas superficies de captura dentro de la sección S es

denominada dS y la proporción del área de captura con la superficie total es dS/S. La
potencia del haz que entra en la sección sería P, y dP representa la cantidad removida por
segundo dentro de la sección. La fracción absorbida es entonces -dP/P, y esta relación es
también equivalente a la probabilidad promedio de captura. El signo negativo indica una
disminución. Por lo tanto, se tiene la relación:

𝑑𝑃 𝑑𝑆
− =
𝑃 𝑆
Con cada partícula podemos asociar una sección eficaz de captura, siendo 𝑑𝑆 = 𝛼 . 𝑑𝑛
Reemplazando e integrando a n en el intervalo entre 0 y n, se llega a:
𝑃 𝑛
𝑑𝑃 𝛼. 𝑑𝑛 𝑃 𝛼. 𝑛 𝑃 𝛼. 𝑛
−∫ =∫ ⟹ −𝑙𝑛 = ⟹ −𝑙𝑜𝑔 =
𝑃 𝑆 𝑃𝑜 𝑆 𝑃𝑜 2,303. 𝑆
𝑃𝑜 0
 Se define entonces transmitancia (T) y absorbancia (A) de la forma:
𝑃 𝛼.𝑛
𝑇 = 𝑃𝑜 𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 = 2,303.𝑆

El área de sección transversal S se puede expresar en términos del volumen del bloque V
(en cm3) y su longitud b (en cm). Por lo tanto, S = (V/b) y sustituimos:

𝑃𝑜 𝛼. 𝑛 . 𝑏
𝑙𝑜𝑔 =
𝑃 2,303. 𝑉

Teniendo en cuenta que n/V tiene unidades de concentración haremos la conversión a mol/L,
quedando la siguiente expresión:

𝑃𝑜 𝑁𝐴 . 𝛼. 𝑏
𝑙𝑜𝑔 =
𝑃 2,303. 1000
𝑃𝑜
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 = 𝜀. 𝑏. 𝐶
𝑃
Siendo 𝜀 la absortividad molar y C la concentración del soluto.

También es posible relacionar el porcentaje de transmisión y la absorbancia mediante:

A = 2 –logT%

Desviaciones a la Ley de Beer:

 Reales. El índice de refracción depende de la concentración, n=c/v, por ende, cuando

se trabaja con una concentración mayor igual o mayor a 10-3 M debe considerarse la
expresión:
𝑛
𝜀 = 𝜀(𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑟𝑜) .
(𝑛2 + 2)2

 Instrumentales. Ocurre a causa de la baja calidad de monocromaticidad, presencia de

luz parásita, fenómenos de fluorescencia, dispersión de luz, errores de lectura.
 Químicas. Son aquellas que ocurren por desplazamiento de equilibrios, ya sean por
formación de complejos, reacciones ácido base o dimerizaciones, reacciones con el
solvente, influencia de la temperatura o interacción de especies absorbentes.

PARTE A: Determinación de NO3- por absorción UV.

A.1-Completar
Zona espectral empleada para la Región UV
determinación
λ detección 220 nm
 Aspecto visual Incoloro
Tipo de muestra Agua potable
Cuidados Trabajar únicamente con agua
bidestilada. Asegurarse de que la
muestra no contenga material
suspendido.
Rango de absorbancia confiable 0.1≤A≤0.9

A.2- Tareas previas.

1. A través de un cuadro indicar los pasos experimentales a realizar, es decir presentar
el protocolo de trabajo.

Construcción de curva de calibración:

Medición de la muestra:

2. Realice el cálculo que contenga las diluciones correspondientes para realizar los
patrones de la curva de calibración, preséntelos en una tabla. Muestre a modo de
ejemplo un cálculo completo.

Patrón Vsln estándar / ml [NO3-] /M V H2O /mL VHCL/mL A220 nm teórica

0 0 0 50 1 0
1 3 4.839𝑥10−5 47 1 0.15
2 5 8.065𝑥10−5 45 1 0.25
3 7 1.129𝑥10−5 43 1 0.35
4 10 1.613𝑥10−4 40 1 0.50
5 15 2.419𝑥10−4 35 1 0.75
6 18 2.903𝑥10−4 32 1 0.90

Ejemplo de cálculo:
𝐴 = 𝜀. 𝑏. 𝐶

𝐴
𝐶=
𝜀. 𝑏
Se elige un valor para A teórico, que se encuentre dentro de los límites de la Ley de Beer
(entre 0.1 y 0.9).
 Sea A= 0.25, se utiliza el valor de ε de bibliografía que para el anión nitrato es 50 ml/(mg.cm)
y, a partir de la Ley de Beer, se calcula el valor de la concentración necesaria de la solución
patrón.
0.25
𝐶𝑝2 = = 0.005 𝑚𝑔/𝑚𝑙
𝜀. 1𝑐𝑚
Luego, se calcula el volumen necesario de solución estándar para poder preparar 50 ml de
una solución patrón de esa concentración. Si la concentración de la solución estándar es
0.05 mg/ml, el cálculo correspondiente sería:
𝑉𝑆𝐸 . 𝐶𝑆𝐸 = 𝑉𝑝 . 𝐶𝑝

𝑉𝑝 . 𝐶𝑝
𝑉𝑆𝐸 =
𝐶𝑆𝐸

50𝑚𝑙 𝑥 0.005𝑚𝑔/𝑚𝑙
𝑉𝑆𝐸 = = 5 𝑚𝑙
0.05𝑚𝑔/𝑚𝑙
Por último, se puede expresar la concentración de los patrones en molaridad realizando la
conversión:
𝑚𝑔 𝑔 𝑚𝑜𝑙
𝐶𝑝2 = 0.005 = 0.005 𝑥 = 8.065𝑥10−5 𝑀
𝑚𝑙 𝑙 62 𝑔

A.3- “Resultados” experimentales.

Suponiendo que los siguientes datos se obtuvieron en el TP, realice la curva de
calibración y calcule la [NO3-] en la muestra problema. No olvide poner los cálculos
realizados para facilitar la corrección.

VSln estándar/ml [NO3- ]/M A220nm A275nm Am=A220- 2A275 Am- blanco

0 0 0,059 0,053 0

1 1,613𝑥10−5 0,0648 0,0029 0,059 0,006

2 3,226𝑥10−5 0,116 0,110 0,057

5 8,065𝑥10−5 0,307 0,301 0,248

10 1,613𝑥10−4 0,602 0,596 0,543

12,5 2,016𝑥10−4 0,748 0,742 0,689

15 2,419𝑥10−4 0,927 0,921 0,868

20 (muestra) 1,192𝑥10−4 0,458 0,452 0,399

Ejemplo de cálculo:

Concentración solución estándar: V= 10 ml

10𝑚𝑙 . 0,05𝑚𝑔/𝑚𝑙 1
⌈𝑁𝑂3− ⌉ = . = 1,613𝑥10−4
50𝑚𝑙 𝑃𝑀
A= 0,602 – 2 . 0,0029 – blanco = 0,543

Se descarta la medición del patrón 1 y 6, por estar por fuera del rango de cumplimiento de
la Ley de Beer (por debajo de 0,1 en el primer caso, y por arriba de 0,9 en el segundo).

Concentración de la muestra: V= 50 ml A= 0,399 y= 3346,5x= 0,399

x= 1,192𝑥10−4

−4 50
⌈𝑁𝑂3−⌉ = 1,192𝑥10−4 𝑀. 𝑓𝑑 = 1,192𝑥10 𝑀.
20
⌈𝑁𝑂3−⌉ = 2,980𝑥10−4 𝑀

CURVA DE CALIBRACIÓN
Regresión lineal y= 3346,5x
R2= 0,9909
Valor obtenido ⌈𝑁𝑂3−⌉= 2,980𝑥10−4 𝑀
Valor máximo permitido 45 mg/L = 7,258𝑥10−4 𝑀

Curva de Calibración
0,8
Absorbancia a 220nm

0,7

0,6

0,5 y = 3346,5x
R² = 0,9909
0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,00005 0,0001 0,00015 0,0002 0,00025

[NO3-] / M
PARTE B: Determinación de NO2- por absorción Visible.

B.1- Completar
Zona espectral empleada para la Región Visible
determinación
Fundamento técnica Determinación de nitritos a partir de la
medición de la absorción molecular en
el visible de un derivado coloreado.
λ detección 540 nm
Aspecto visual Incolora inicialmente. Luego de la
derivatización toma un aspecto rosado.
Tipo de muestra Agua de pozo
Cuidados Se utiliza un reactivo cancerígeno (1-
naftilamina), se debe tener la
precaución de trabajar bajo campana y
con la protección adecuada.
Rango de absorbancia confiable 0.1≤ A ≤0.9

B.2- Tareas previas

1. A través de un cuadro indicar los pasos experimentales a realizar.

Construcción de la curva de calibración:

Medición de la muestra:

B.3- “Resultados” experimentales

Suponiendo que los siguientes datos se obtuvieron en el TP, realice la curva de
calibración y calcule la [NO2-] en la muestra problema. No olvide poner los cálculos
realizados para facilitar la corrección.

VSln estándar/ml [NO2- ]/M A540nm A540nm - blanco

0 0 0,02 0
0.5 2,174𝑥10−6 0,045 0,025

1 4,348𝑥10−6 0,163 0,143

2 8,696𝑥10−6 0,307 0,287

3 1,304𝑥10−5 0,420 0,400

4 1,739𝑥10−5 0,521 0,501

5 2,174𝑥10−5 0,625 0,605

Muestra(1:50) − 0,783 0,763

Muestra (1:100) 1,473𝑥10−5 0,448 0,428

Ejemplo de cálculo:

Concentración solución estándar: V= 5 ml

5𝑚𝑙 . 0,01𝑚𝑔/𝑚𝑙 1
⌈𝑁𝑂2− ⌉ = . = 2,174𝑥10−5
50𝑚𝑙 𝑃𝑀
Concentración muestra (1:100): A= 0,428 y= 29048x= 0,428

X= 1,473𝑥10−5 𝑀

[𝑁𝑂− −5 −3
2 ] = 1,473𝑥10 𝑀. 𝑓𝑑 = 1,473. 10 𝑀

La medición para la muestra diluida 1:50 no puede utilizarse porque su valor de absorbancia
supera el valor máximo permitido por la curva de calibración y, por lo tanto, no se puede usar
la expresión de la regresión lineal, para interpolar el valor de su concentración.

CURVA DE CALIBRACIÓN

Regresión lineal y= 29048x

R2= 0,9897
Valor obtenido [𝑁𝑂2−] = 1,473. 10−3 𝑀

Valor máximo permitido -

Curva de Calibración
0,7
Absorbancia 540nm

0,6

0,5
y = 29048x
0,4 R² = 0,9897

0,3

0,2

0,1

0
0 0,000005 0,00001 0,000015 0,00002 0,000025

[NO2- ]/M